来源：Construction of an orthogonal transport system for Saccharomyces cerevisiae peroxisome to efficiently produce sesquiterpenes（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
真核细胞的亚细胞区室化为天然产物的高效合成提供了独特优势。本研究在酿酒酵母中构建了一套全新的人工蛋白转运系统ScPEX5-PTS1，通过融合改造过氧化物酶体转运蛋白并优化信号肽序列，实现了与内源转运系统的正交化。研究进一步将该系统应用于α-蛇麻烯的合成，在5 L生物反应器中获得了17.33 g/L的产量和0.22 g/L/h的生产率，为过氧化物酶体细胞工厂的构建提供了有力工具。
研究背景
酿酒酵母作为真核模式生物，具有遗传背景清晰、耐受低pH和渗透压等工业优势，是合成生物学研究的优良底盘。与大肠杆菌相比，酵母拥有多种膜包裹细胞器，这些细胞器不仅代表真核细胞对环境需求的进化适应，还能创造独特的微环境，为不同代谢途径提供特定反应场所。利用细胞器合成天然产物具有多重优势：通过局部底物和酶浓度富集提高产量、隔离竞争途径抑制副产物生成、降低中间产物和酶的毒性效应。萜类化合物是植物中最大的次生代谢物类别，在医药等领域应用广泛。过氧化物酶体已被证明是酵母中合成萜类化合物的合适亚细胞区室，但如何实现蛋白质在该区室中的高效、特异性转运，仍是人工生物系统构建的关键瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、试剂与培养基
酿酒酵母菌株BY4741（MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0）和WCB10（MATa; leu2-3112; trp1-1; ura3-1; his3-11,15）作为生物合成途径组装的底盘菌株。大肠杆菌DH5α（TransGen Biotech, 北京）用于基因克隆。含抗生素的Luria-Bertani（LB）培养基（100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素）用于重组大肠杆菌的培养。YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）用于酵母培养。SC培养基（0.67%酵母氮碱、2%葡萄糖、适当氨基酸缺陷混合物）用于重组酵母菌株的筛选。所有限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher（Thermo Fisher Scientific, USA）。DNA聚合酶购自Vazyme（南京，中国），引物购自GENEWIZ（苏州，中国）。In-fusion克隆试剂盒购自UE（US Everbright Inc, 苏州，江苏，中国）。标准α-蛇麻烯、甲羟戊酸内酯及其他化学品购自Sigma（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.）。
【数据】菌株：BY4741、WCB10、DH5α；氨苄青霉素：100 μg/mL；卡那霉素：50 μg/mL；YPD培养基：1%酵母提取物+2%蛋白胨+2%葡萄糖；SC培养基：0.67%酵母氮碱+2%葡萄糖
2.2 分子克隆与菌株构建
本研究所用菌株和质粒分别列于表1和表2，所用引物列于表S1。基因ZSS1（GeneBank: AB247331.1）和ScPEX5*由GENEWIZ（苏州，中国）合成，并针对酿酒酵母进行了密码子优化。基因vioA（GeneBank: AVR55198.1）、vioB（GeneBank: AVR55200.1）和vioE（GeneBank: AVR55201.1）由天津大学化工学院谢泽雄教授和元英进教授惠赠（Wang et al., 2018）。所有用于酿酒酵母表达的密码子优化序列列于补充文件中。启动子、编码序列和终止子均从酿酒酵母W303-1a基因组DNA扩增获得。基因表达盒（图S1）按照前期工作描述的方法构建（Zhang et al., 2018）。相邻片段之间设计30 bp重叠的引物，片段经扩增后通过融合聚合酶链式反应（PCR）连接。所需引物见表S1。基因表达盒、基因组整合位点的同源臂和筛选标记采用醋酸锂方法整合到酿酒酵母基因组中（Zhang et al., 2018）。构建的菌株列于表1。转化子经碱裂解法粗提基因组后通过菌落PCR验证。首先从平板上挑取单菌落，将细胞悬浮于20 mM NaOH中。随后将细胞悬液置于100 °C水浴中处理20 min。取1 μL细胞悬液作为PCR模板进行验证。PCR条带正确的菌落经测序确认后保存于50%甘油溶液中。
【数据】NaOH浓度：20 mM；水浴温度：100 °C；水浴时间：20 min；PCR模板量：1 μL；甘油浓度：50%
2.3 荧光显微镜检测目标酶的定位
为确认蛋白定位并测试PTS1的过氧化物酶体靶向能力，表达RFP-PTS1和GFP-PTS1的酵母细胞在4 mL YPD培养基中培养48 h。培养物经离心浓缩，用PBS洗涤3次。随后取10 μL制备物直接点样于载玻片，使用共聚焦荧光显微镜观察。菌株使用荧光显微镜（落射荧光显微镜，Nikon Eclipse E200）观察，绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）的激发激光波长分别为488 nm和552 nm。
【数据】培养体积：4 mL YPD；培养时间：48 h；PBS洗涤：3次；样品量：10 μL；GFP激发波长：488 nm；RFP激发波长：552 nm
2.4 连接肽文库构建
质粒pRS426经限制性内切酶消化（BamHI + XhoI）后，进行凝胶纯化并插入基因片段pRPL18B-vioE。通过PCR生成具有适当5′和3′突出端的片段，使用无缝克隆方法（Minerva Super Fusion Cloning Kit）与线性化载体共组装。等温组装在50 °C下孵育30 min，随后转化至大肠杆菌DH5α。每个构建体经擎科测序（北京擎科生物技术有限公司）验证。九氨基酸连接肽文库通过引入九个DNK简并密码子重复序列构建，并立即插入vioE的C末端。连接完成后，将新生成的质粒文库与pRS415-AB一同转化至酿酒酵母菌株LC01，生成用于连接肽筛选的文库（9AA连接肽文库）。
【数据】限制酶：BamHI + XhoI；组装温度：50 °C；组装时间：30 min；连接肽长度：9个氨基酸；简并密码子：DNK
2.5 PDV产量的提取与定量
表达PDV途径的酵母菌株（LC02-LC09）在含适当氨基酸的合成葡萄糖（SD）培养基中，30 °C、220 rpm振荡培养过夜。随后将培养物按10倍稀释至30 mL新鲜SD-Ura培养基中，孵育72 h。取300 μL培养物离心收集细胞，重悬于150 μL冰醋酸中，转移至薄壁PCR管。将PCR管在95 °C孵育15 min，轻轻颠倒混匀，再继续孵育15 min。细胞碎片通过12,000 rpm离心5 min去除，上清液小心转移至微孔板中。取150 μL用于后续定量。PDV在激发525/5 nm和发射585/5 nm处检测（DeLoache et al., 2016）。
【数据】培养温度：30 °C；转速：220 rpm；稀释倍数：10倍；培养基体积：30 mL；孵育时间：72 h；取样量：300 μL；冰醋酸量：150 μL；孵育温度：95 °C；孵育时间：15 min×2；离心：12,000 rpm×5 min；检测体积：150 μL；激发波长：525/5 nm；发射波长：585/5 nm
2.6 两相摇瓶发酵
将保存于−80 °C的甘油菌液接种至YPD琼脂平板。挑取单克隆接种于3 mL YPD培养基中培养16–18 h，随后稀释至30 mL YPD培养基中，初始OD600为0.05。30 mL培养物在30 °C、220 rpm条件下进行两相发酵4天，9 h后加入3 mL肉豆蔻酸异丙酯。所有实验重复3次。结果中显示的数据为三次实验的平均值。
【数据】保存温度：−80 °C；种子培养：3 mL YPD、16–18 h；初始OD600：0.05；培养体积：30 mL；温度：30 °C；转速：220 rpm；发酵时间：4天；肉豆蔻酸异丙酯：3 mL、9 h后加入；重复次数：3次
2.7 α-蛇麻烯的提取与定量
取上层有机相（1 mL）转移至2 mL微量离心管中，12,000 rpm离心5 min以提取α-蛇麻烯。上层有机相经滤过和脱水后进行GC检测。GC系统（SCION 456, 德国）配备DB-WAX色谱柱（30 m × 0.32 mm，0.25 μm膜厚）和火焰离子化检测器（FID）。柱温箱温度先在80 °C保持3 min，然后以15 °C/min的速率升至180 °C，再以10 °C/min的速率升至240 °C并保持1 min。α-蛇麻烯采用外标法定量。所有结果报告为三次重复的平均值。
【数据】样品量：1 mL；离心：12,000 rpm×5 min；色谱柱：DB-WAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；初温：80 °C×3 min；升温1：15 °C/min至180 °C；升温2：10 °C/min至240 °C×1 min；定量方法：外标法；重复次数：3次
2.8 5 L生物反应器补料分批发酵
菌株LC18用于5 L生物反应器补料分批发酵。挑取YPD琼脂平板上的单克隆，在3 mL YPD液体培养基中过夜培养。将所得一级种子液接种至200 mL YPD培养基中制备二级种子培养物，用于5 L生物反应器（上海百仑生物）。种子培养基在30 °C、220 rpm条件下培养16 h，随后以10%的初始体积比接种至5 L生物反应器。补料分批发酵中YPD培养基初始体积设为2 L，使用2.5 M H₂SO₄和5 M NH₃·H₂O维持pH为5.5。温度自动维持在30 °C，通气量设为2 vvm。溶解氧（DO）维持在35%以上。培养9 h后加入肉豆蔻酸异丙酯（10 vol%）。葡萄糖耗尽后（20 h）开始添加补料液。补料液的配制和添加方法参照前期描述（Zhang et al., 2020）。
【数据】种子培养：200 mL YPD、30 °C、220 rpm、16 h；接种比：10%；初始体积：2 L；pH：5.5（2.5 M H₂SO₄和5 M NH₃·H₂O）；温度：30 °C；通气量：2 vvm；DO：>35%；肉豆蔻酸异丙酯：10 vol%、9 h后加入；补料时间：20 h
研究结果
3.1 酿酒酵母过氧化物酶体正交蛋白转运系统的开发
酿酒酵母中过氧化物酶体基质蛋白的转运主要依赖C末端信号肽和受体蛋白PEX5。基于C末端过氧化物酶体靶向信号1（PTS1）的蛋白转运系统已在多项研究中得到广泛研究和应用（Rucktäschel et al., 2011; Yuan et al., 2016）。PEX5的C末端结构域由七个α-螺旋四肽重复序列组成，形成漏斗状口袋以识别PTS1（Carvalho et al., 2006），而N末端结构域负责受体结合和货物递送（Francisco et al., 2014）。此前研究通过在苔藓中融合拟南芥AtPEX5（D505H-D507T-N601A）的C末端结构域与野生型PEX5的N末端，并结合增强型信号肽PTS1（WWRDPYSPMYQSYY），设计了用于正交蛋白转运的优化PEX5*（Cross et al., 2017）。本研究探讨了在酿酒酵母中保留并实施该正交蛋白转运系统的可行性。
为此，我们将酿酒酵母ScPEX5的N末端序列（第1–313位氨基酸）与AtPEX5的C末端序列（第340–728位氨基酸）融合，构建了融合过氧化物酶体转运蛋白ScPEX5（共702个氨基酸）（图1A）。通过荧光蛋白共定位测试评估新构建的ScPEX5-PTS1转运系统。选取过氧化物酶体基质蛋白Pcs60的C末端信号肽（TFAKSSRNKSKL）作为内源对照，因其末端包含经典三肽SKL（Hasan et al., 2013; Lametschwandtner et al., 1998; Ma et al., 2011）。红色荧光蛋白（RFP）与内源PTS1融合，绿色荧光蛋白（GFP）与PTS1在C末端分别融合。随后将转运系统配对整合至酿酒酵母BY4741中，分别获得菌株F1（RFP-PTS1和GFP-PTS1）、F2（ScPEX5、RFP-PTS1和GFP-PTS1）、F1Q（RFP-PTS1、GFP-PTS1和ScPEX5缺失）和F2Q（ScPEX5、RFP-PTS1、GFP-PTS1*和ScPEX5缺失）。
如图1B所示，比较菌株F1和F2的荧光结果，绿色荧光仅在菌株F2的过氧化物酶体基质中观察到，表明PTS1能被ScPEX5识别而不能被ScPEX5识别；此外，比较菌株F1Q和F2Q的荧光结果，菌株F1Q和F2Q的过氧化物酶体基质中均未检测到红色荧光，表明PTS1能被ScPEX5识别而不能被ScPEX5识别。基于上述发现，可以得出结论：在酿酒酵母中初步构建了正交蛋白转运系统PEX5-PTS1*。
然而，已有报道指出PEX5在酿酒酵母中介导十九种具有不同C末端信号肽的蛋白转运至过氧化物酶体基质（Rosenthal et al., 2020）。为评估ScPEX5的特异性，根据C末端三肽特征将信号肽分为十类（Rosenthal et al., 2020），见表S2，并通过荧光蛋白共定位实验对剩余九种信号肽进行验证。如图S2所示，ScPEX5无法识别任何内源信号肽，证明了ScPEX5-PTS1系统的正交性。
【数据】ScPEX5*总氨基酸数：702；N末端序列：第1–313位；C末端序列：第340–728位；内源对照信号肽：TFAKSSRNKSKL；测试内源信号肽数量：9种
3.2 通过PTS1*优化提高ScPEX5*-PTS1*的转运效率
如图2B所示，菌株F2和F2Q的过氧化物酶体基质和细胞质中均观察到绿色荧光，表明ScPEX5-PTS1配对的转运效率较低。前期研究中，PDV的产量和颜色被用作评估过氧化物酶体信号识别强度的指标——通过在细胞质中表达VioA和VioB酶，同时将末端酶（VioE）靶向至过氧化物酶体，有效将VioE与其底物吲哚-3-丙酮酸（IPA）亚胺二聚体隔离，导致途径通量可测量地降低（DeLoache et al., 2016）。
因此，本研究在酿酒酵母菌株BY4741中重构了PDV途径（图2A），并将VioE与不同信号肽融合，分别获得菌株LC01（无vioE）、LC02（vioE）、LC03（vioE-PTS1）和LC04（vioE-PTS1）。随后根据不同菌株中PDV的产量评估转运效率（图2B和C）。酵母颜色按从深到浅的梯度排列，顺序为LC02、LC04、LC03和LC01（图2B），与图2C中测得的PDV产量相对应。结果表明，内源转运系统ScPEX5-PTS1的转运效率高于ScPEX5-PTS1*。
已有报道指出PTS1相邻的N末端氨基酸序列影响蛋白导入效率（Noguchi et al., 2013）。为提高ScPEX5-PTS1系统的转运效率，我们利用PDV高通量筛选系统筛选了九肽文库（9AA文库），该文库使用（DNK）₉引物构建。9AA文库的设计旨在平衡正负电荷残基的频率并降低终止密码子的频率（DeLoache et al., 2016）。将VioE-9AA_DNK序列文库转化至菌株LC01后，菌株颜色从浅到深变化，反映了靶向过氧化物酶体的vioE导入效率差异（图3A）。
随后，与菌株LC05相比，选取浅色菌株进行测序以获得9AA连接肽序列。去除含终止密码子的序列后，共获得265个独特克隆的连接肽序列。ePTS1（LGRGRRSKL）信号肽已被工程化改造，并被证明是分选蛋白至酵母过氧化物酶体的最有效内源人工信号肽（DeLoache et al., 2016）。因此，根据ePTS1和内源PTS1（来自Pcs60）的强度，将筛选到的连接肽序列分为三类，如图3B所示。第一类包括荧光强度小于或等于ePTS1的序列，第二类包括介于ePTS1和PTS1之间的序列，第三类包括所有其他序列。此外，从这三类中随机选取信号肽测定PDV产量（图3C和D）。基于检测到的PDV产量，筛选获得最优信号肽oPTS1（YERVTTMTNYQSYY）。同时鉴定到一个与ePTS1转运能力相近的PTS1变体，命名为mPTS1*（LCLDSSSSSYQSYY）。
已有报道表明连接肽序列中的碱性氨基酸有利于强度提升（DeLoache et al., 2016）。然而，本研究发现oPTS1序列中含有的碱性氨基酸较少。随后，使用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/）对这三类信号肽进行保守序列分析。结果表明连接肽序列的保守性有限（图S3）。但考虑到字母的大小和显著性，推测第5、7和9位氨基酸对转运系统的功能影响更为显著。因此，设计并测试了人工优化序列uPTS1（SDNFWTTTSYQSYY），但其PDV滴度高于含ePTS1的菌株（数据未显示）。这表明ScPEX5*与信号肽之间的结合关系与内源转运系统存在显著差异，其深入的转运增强机制仍需进一步研究。
【数据】筛选获得独特克隆数：265个；oPTS1序列：YERVTTMTNYQSYY；mPTS1序列：LCLDSSSSSYQSYY；uPTS1*序列：SDNFWTTTSYQSYY；ePTS1序列：LGRGRRSKL
3.3 不同信号肽在酿酒酵母过氧化物酶体中合成甲羟戊酸的应用
为研究不同信号肽在实际代谢途径中的表现，将MVA途径的乙酰辅酶A酰基转移酶（AtoB）、HMG-CoA合酶（HMGS）和截短的HMG-CoA还原酶（tHMG1）定位于过氧化物酶体，并将MVA途径的甲羟戊酸激酶（MK）、磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）定位于细胞质，构建了MVA合成菌株。MVA在酸性环境中易内酯化为甲羟戊酸内酯（C₆H₁₀O₃, MVAL）（Wegner et al., 2021），因此MVA的产量以MVAL的产量表示（图4A）。
将不同信号肽（PTS1、PTS1、mPTS1和oPTS1）与AtoB融合，构建了菌株LC10、LC11、LC12和LC13。摇瓶发酵结果表明，含oPTS1的菌株LC13的MVAL产量最高，达到1.48 g/L，高于含ePTS1的菌株LC14（1.15 g/L）和含PTS1的菌株LC10（0.77 g/L）。含mPTS1的菌株LC12产量为1.21 g/L，含PTS1的菌株LC11产量为0.95 g/L。这些结果表明，oPTS1*在MVA合成中的表现优于已报道的ePTS1。
【数据】LC13（oPTS1）MVAL产量：1.48 g/L；LC14（ePTS1）MVAL产量：1.15 g/L；LC10（PTS1）MVAL产量：0.77 g/L；LC12（mPTS1）MVAL产量：1.21 g/L；LC11（PTS1*）MVAL产量：0.95 g/L
3.4 酵母过氧化物酶体和细胞质中α-蛇麻烯的从头合成
α-蛇麻烯是一种存在于蛇麻草中的倍半萜化合物，具有多种药理活性。本研究将ZSS1基因（编码α-蛇麻烯合酶）与不同信号肽融合，在过氧化物酶体和细胞质中分别表达，构建了不同菌株。通过过氧化物酶体和细胞质工程的组合策略，进一步提高α-蛇麻烯的产量（图5A）。
首先，将ZSS1与oPTS1融合定位于过氧化物酶体，构建菌株LC15，其α-蛇麻烯产量为2.35 g/L。将ZSS1与PTS1融合定位于过氧化物酶体，构建菌株LC16，产量为1.82 g/L。将ZSS1定位于细胞质（无信号肽），构建菌株LC17，产量为1.65 g/L。随后，将过氧化物酶体定位的ZSS1（ZSS1-oPTS1）与细胞质定位的ZSS1（ZSS1）共表达，构建菌株LC18，α-蛇麻烯产量达到3.12 g/L，显著高于单独定位的菌株。
进一步将LC18应用于5 L生物反应器补料分批发酵。在优化的发酵条件下，α-蛇麻烯产量达到17.33 g/L，生产率为0.22 g/L/h。这一结果远高于已报道的酵母中α-蛇麻烯产量，证明了过氧化物酶体工程策略在萜类化合物合成中的巨大潜力。
【数据】LC15（ZSS1-oPTS1*）产量：2.35 g/L；LC16（ZSS1-PTS1）产量：1.82 g/L；LC17（ZSS1-细胞质）产量：1.65 g/L；LC18（双定位）产量：3.12 g/L；5 L发酵罐产量：17.33 g/L；生产率：0.22 g/L/h
讨论与解读
本研究成功构建了酿酒酵母过氧化物酶体正交蛋白转运系统ScPEX5-oPTS1。通过融合ScPEX5的N末端与AtPEX5的C末端获得杂合转运蛋白ScPEX5，结合筛选得到的优化信号肽oPTS1，该系统对内源过氧化物酶体转运系统表现出严格的正交性。在MVA和α-蛇麻烯的合成中，oPTS1均优于已报道的ePTS1信号肽，证明该系统在实际代谢工程应用中的有效性。通过将过氧化物酶体与细胞质工程相结合，在5 L生物反应器中实现了17.33 g/L的α-蛇麻烯产量，为萜类化合物的高效合成提供了新策略。
编译者解读：本研究的关键创新在于构建了"正交化"的蛋白转运系统——这解决了细胞器代谢工程中长期存在的"交通拥堵"问题。传统策略往往直接利用内源转运系统，导致竞争性抑制和效率瓶颈。ScPEX5-oPTS1系统的正交性设计使外源途径蛋白可以"专线"进入过氧化物酶体，不干扰内源蛋白转运。从合成生物学应用角度看，该系统的模块化特征（转运蛋白+信号肽可独立更换）使其具有较好的可移植性，未来或可推广至其他真核底盘。但需注意，uPTS1*的意外表现提示该系统的转运机制尚未完全阐明，碱性氨基酸富集假设的局限性值得后续研究关注。
参考来源
Zhang C. Construction of an orthogonal transport system for Saccharomyces cerevisiae peroxisome to efficiently produce sesquiterpenes. Metabolic Engineering, 2024. DOI: 10.1016/j.ymben.2024.07.010
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.07.010