来源：Exploring temperature-mediated plasmid replication as a reversible and switchable protein expression system in genetic Escherichia coli（Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engine）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
温度作为一种非侵入性物理信号，在合成生物学中日益受到关注。然而，以往的温度诱导系统多依赖于转录因子工程，温度对质粒复制本身的调控却鲜有探索。本研究首次系统考察了大肠杆菌中5种不同复制起点对温度的响应，发现pUC和RSF复制起点随温度升高而拷贝数增加，pSC101和CloDF13则相反。基于这一发现，研究团队构建了双质粒"可逆切换"系统，实现了sfGFP与RFP的温差调控表达，并成功应用于衣康酸的生物合成。
研究背景
合成生物学融合生物学、数学、力学、工程学与计算机科学等多学科手段，致力于解决关键问题。研究者通过操纵生物学的中心法则，使其可编程、可工程化，以服务于工业应用。在此背景下，多种诱导系统被开发用于在特定条件下开启或关闭细胞行为。化学诱导与物理诱导是微生物细胞中两类主要的诱导系统，其传感机制分为基于转录因子和基于适配体两大类。在大肠杆菌中，化学信号可通过pH、离子强度或特定分子（如乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、IPTG和AHL）进行调控。然而，化学诱导存在明显缺陷：诱导剂有毒且难以降解、成本高昂、存在非特异性脱靶效应，且下游纯化过程需去除外源化学物。物理诱导因此近年来受到广泛关注。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
本研究在大肠杆菌菌株培养全过程中使用LB和M9培养基。LB培养基含10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物；M9基础培养基含16 g/L (NH₄)₂SO₄、16 g/L Na₂HPO₄·12H₂O、3 g/L KH₂PO₄、2 g/L酵母提取物、1 g/L MgSO₄·7H₂O、0.01 g/L MnSO₄·7H₂O。M9培养基中所有盐类购自Sigma（美国）。葡萄糖和甘油购自Thermo Fisher Scientific（美国）。IPTG和考马斯亮蓝R-250购自Cyrusbioscience（台湾），柠檬酸购自JT Baker（美国）。
【数据】LB培养基：10 g/L NaCl + 10 g/L胰蛋白胨 + 5 g/L酵母提取物；M9培养基：(NH₄)₂SO₄ 16 g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 16 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、酵母提取物 2 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L、MnSO₄·7H₂O 0.01 g/L；试剂来源：Sigma、Thermo Fisher Scientific、Cyrusbioscience、JT Baker
2.2 质粒构建与转化
本研究所用菌株和质粒列于原文表1。质粒DNA使用FavorPrep质粒提取迷你试剂盒（FAVORGEN，台湾）提取。pCDF-JG、pRSF-JG和pSCA-JG通过插入不同复制起点和抗性标记基因构建，以EcoRI/PstI和EcoRI/SpeI限制性位点替换pSU-JG中的pUC ori。来自Aspergillus terreus的AtCadA和来自E. coli MG1655的EcAcnA的PCR片段由引物扩增，并按前述报道构建于pHCC中。EcAcnA片段经HindIII/SpeI和NdeI/SpeI双酶切，然后与经相同限制性位点酶切的pSB-T7-RFP和pHCC-duet连接。AtCadA片段经HindIII/EcoRI和HindIII/PstI双酶切，随后与经相同限制性位点酶切的pSB-T7-RFP和pHCC-duet连接。DNA片段通过DNA电泳系统（Major Science，美国）和Nano-300（MEDCLUB Scientific，台湾）分析。所有构建的质粒通过热激转化导入E. coli DH5α。表达不同荧光蛋白的pHCC-T7-sfGFP和pSB-T7-RFP质粒共转化至BL21(DE3)，所得菌株命名为HGLR。
【数据】质粒提取：FavorPrep试剂盒；酶切位点：EcoRI/PstI、EcoRI/SpeI、HindIII/SpeI、NdeI/SpeI、HindIII/EcoRI、HindIII/PstI；宿主菌：DH5α（热激转化）、BL21(DE3)（共转化）
2.3 报告基因的培养条件
本研究细菌培养使用Luria-Bertani（LB）培养基，含10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物。所有重组菌株在添加适当抗生素的LB平板上生长，终浓度分别为：氨苄青霉素（AmpR）100 μg/mL、氯霉素（CmR）25 μg/mL、卡那霉素（KanR）50 μg/mL、壮观霉素（SpcR）50 μg/mL。从琼脂平板挑取单菌落，接种于含抗生素的LB培养基中进行预培养。平板和液体培养物均在37°C、200 rpm振荡培养12小时。随后，将细胞接种到含4 mL含抗生素LB培养基的15-mL试管中，在相同条件下培养。为研究温度对含单质粒细胞的影响，使用30、37和42°C三种不同温度进行培养。对于双质粒系统，温度改为22、30和37°C以降低胁迫。所有细胞通过14,000×g离心5分钟收集，进一步用于生物量、蛋白质和荧光信号分析。
【数据】抗生素浓度：Amp 100 μg/mL、Cm 25 μg/mL、Kan 50 μg/mL、Spc 50 μg/mL；培养条件：37°C、200 rpm、12 h；单质粒温度：30/37/42°C；双质粒温度：22/30/37°C；离心：14,000×g、5 min
2.4 光密度（OD）与荧光强度
细胞生长通过使用分光光度计（Molecular Devices 384 PC，美国）测量600 nm处光密度（OD）进行监测。荧光强度通过SpectraMax M2微板读取器（Molecular Devices，Sunnyvale, CA）分析。sfGFP的激发和发射波长分别为480 nm和510 nm，RFP的激发和发射波长分别为585 nm和610 nm。
【数据】OD测量波长：600 nm；sfGFP激发/发射：480/510 nm；RFP激发/发射：585/610 nm
2.5 SDS-PAGE分析
采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白质表达。细胞通过14,000×g离心10分钟收集，用去离子水洗涤两次，并用去离子水和蛋白染料调整至OD600为4。使用10% SDS-PAGE按标准方案（80 V，30 min；120 V，70 min）观察蛋白质表达。最后，蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色可视化，并使用图像扫描仪（Biolab2000，台湾）扫描。
【数据】离心：14,000×g、10 min；OD600调整：4；SDS-PAGE：10%，80 V 30 min + 120 V 70 min；染色：考马斯亮蓝R-250
2.6 通过qPCR测定质粒拷贝数（PCN）
细胞通过14,000 rpm离心5分钟收集，用去离子水洗涤两次。细胞经100°C热处理5分钟裂解。上清液随后使用EvaGreen qPCR系统-ROX I（GeneDireX，美国）在StepOnePlus™实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）中进行定量聚合酶链反应（qPCR）分析。选择can基因、抗性基因CmR和AmpR作为内源参考基因和靶基因。PCN的计算定义为参考基因与靶基因之间的循环阈值（Ct）的2^(−ΔCt)。
【数据】离心：14,000 rpm、5 min；裂解：100°C、5 min；qPCR系统：EvaGreen qPCR System-ROX I + StepOnePlus™；PCN计算：2^(−ΔCt)
2.7 异源和同源蛋白表达的菌株与培养基
携带双质粒的菌株BL21(DE3)分别以不同质粒拷贝数表达异源AtCadA和同源EcAcnA。携带pHCC-EcAcnA和pSB-T7-AtCadA的菌株命名为HELA（即EcAcnA高拷贝、AtCadA低拷贝），携带pHCC-AtCadA和pSB-T7-EcAcnA的菌株命名为HALE（即AtCadA高拷贝、EcAcnA低拷贝）。它们在LB培养基中于37°C预培养12小时，然后按2%接种量加入含10 g/L甘油的改良M9培养基中，于37°C培养，此步骤参照前述研究。当OD600达到0.6至0.8时，加入0.1 mM IPTG诱导，随后培养物在22或30或37°C下培养12小时以验证蛋白质表达水平。
【数据】预培养：37°C、12 h；接种量：2%；培养基：改良M9 + 10 g/L甘油；诱导：0.1 mM IPTG；诱导时机：OD600 0.6–0.8；表达温度：22/30/37°C；表达时间：12 h
2.8 衣康酸生产与HPLC分析
为使用HELA和HALE进行全细胞生物催化，细胞收集后用ddH₂O洗涤两次，调整至OD600为90。加入1 mL含1 M柠檬酸（pH 5.5）的反应缓冲液，混合物在37°C、350 rpm下孵育8小时。衣康酸使用HPLC（Hitachi，日本）定量，采用Coregel 87H3有机酸柱（7.8 × 300 mm，9 μm，Concise，美国），柱温70°C，以8 mM H₂SO₄为流动相，流速0.4 mL/min，UV检测波长210 nm。
【数据】细胞密度：OD600 90；反应体系：1 mL含1 M柠檬酸（pH 5.5）；反应条件：37°C、350 rpm、8 h；HPLC条件：Coregel 87H3柱、70°C、8 mM H₂SO₄、0.4 mL/min、UV 210 nm
研究结果
3.1 不同复制起点的温度效应
已知多种因素影响质粒中蛋白质的表达水平，包括启动子、核糖体结合位点、复制起点和转录调控因子。除启动子外，复制起点也被报道对温度敏感。Jiang等人通过突变并在42°C下失活ATP依赖性DNA解旋酶Rep，调控了pBBR1MCS质粒中pBBR1 ori的复制。这些结果表明复制起点受与ORI结合的蛋白质和RNA调控，并对温度变化敏感。
为观察温度对不同ORI的影响，研究者在相同启动子和RBS下克隆了sfGFP表达，使用不同ORI（包括RSF1010、pSC101、CloDF、pUC和RSF），并将转化子在30、37和42°C下培养。结果显示，sfGFP的特异性荧光强度和PCN根据PCN与温度变化的相关性分为3组。第一组仅含RSF1010 ori，不同温度下荧光强度和PCN无显著差异。第二组含pSC101和CloDF ori，表现为温度抑制型质粒复制——荧光强度和PCN随温度升高而降低。尽管RSF1010 ori与CloDF13 ori被报道为同一家族且受RNase H调控，但ORI序列的差异导致了不同行为。对于pSC101 ori，特异性荧光从30°C的12,906 a.u.逐渐降至42°C的8,702 a.u.，PCN从52.7降至20.8，而OD600所代表的生物量仅从2.05轻微降至1.95。虽然Klumpp等人报道质粒拷贝数随生长速率加快而降低（因调节性RNA浓度升高），但本研究中pSCA-JG和pCDF-JG在不同温度下细胞生长相似而PCN降低，排除了细胞生长效应，使温度对质粒复制的影响更为明确。此外，pSC101已被报道为严紧型复制起点质粒，在42°C下因DNA引发酶DnaG受抑制而复制受阻。
第三组包括RSF和pUC ori，表现为温度诱导型复制——荧光和PCN随温度升高而增加。值得注意的是，pSU-JG的荧光强度在培养温度从30°C升至42°C后提高了7倍，PCN提高了2.44倍。虽然pBR322 ori及其衍生ORI的复制受Rom/Rop蛋白抑制，但pUC ori通过产生RNA II构象的温度依赖性改变获得了阻断与阻遏蛋白相互作用的突变，从而在更高温度下呈现更多质粒拷贝。有趣的是，源自RSF1030的RSF ori在所有温度下荧光强度最低，但PCN最高。pRSF-JG的低表达水平源于质粒DNA复制对核苷酸的需求所引发的代谢负担。因此，蛋白质表达可通过不同ORI在温度效应下进行调控，这是通过双质粒精细调控多基因表达的一种有前景的方法。
【数据】pSC101 ori：荧光12,906→8,702 a.u.（30→42°C），PCN 52.7→20.8，OD600 2.05→1.95；pUC ori：荧光提高7倍（30→42°C），PCN提高2.44倍
3.2 不同启动子与ORI的质粒拷贝数载体
在将双质粒系统应用于其他场景之前，研究者比较了J23100、J23109和T7启动子在不同温度下表达的sfGFP信号。有趣的是，3个菌株（即J23109+pUC ori、J23100+pUC ori和T7+RSF ori）的sfGFP信号均随温度升高而增强。对于J23109，特异性sfGFP从30°C的406 a.u.增至37°C的750 a.u.和42°C的1,504 a.u.，分别提高了1.8倍和3.7倍。对于J23100启动子，30°C与42°C之间的sfGFP强度比增加了3.1倍（即从6,800 a.u.增至20,900 a.u.）。结果显示Anderson启动子在温度升高时sfGFP信号增强，且两种菌株中pUC ori的PCN均升高。此外，含T7启动子的RSF ori也表现出与J23100启动子类似的趋势。T7启动子下的荧光强度从37°C的20,080 a.u.增至42°C的35,200 a.u.，PCN也相应增加。结果验证了pUC和RSF ori的复制在较高温度下可增强，与启动子类型无关。另一方面，需要将T7启动子工程化为温度诱导系统，作为热切换蛋白过表达的多功能工具。因此，下一步在双质粒系统中测试了T7启动子的应用。
【数据】J23109：406→750→1,504 a.u.（30→37→42°C），提高1.8倍和3.7倍；J23100：6,800→20,900 a.u.（30→42°C），提高3.1倍；T7：20,080→35,200 a.u.（37→42°C）
3.3 T7启动子在双质粒系统中作为可切换控制器
荧光报告基因是细胞中原位或体内监测和理解细胞行为的强大指标，已被用作不同疾病的早期检测生物传感器。另一方面，蛋白质过表达最有效的方法基于T7RNAP与T7启动子的正交配对。因此，研究者检验了T7启动子下sfGFP和RFP的热切换表达。sfGFP克隆于含"温度诱导型"RSF ORI的pHCC质粒中，而RFP插入含"温度抑制型"SC101 ORI的pSB4A3质粒中。双质粒系统设计用于检验BL21(DE3)中的"开关/关断现象"。由于低温常用于T7系统以获得更好的可溶性，本节使用22°C。
如图3所示，当温度从22°C升至37°C时，sfGFP强度增加了6倍，RFP强度降至10%。此外，PCN也呈现类似趋势——RSF ori在37°C时增加，pSC101 ori则减少。值得注意的是，双质粒系统中RSF ori的PCN增幅不如单质粒系统显著，而pSC101 ori的抑制在双质粒系统中更强。这是合理的——双质粒带来的代谢负担导致了pSC101和pUC ori在不同温度下的差异表现。总体而言，同一细胞中不同ORI在不同温度下对应的PCN变化构成了一种有前景的可切换控制方式，可用于生产多种蛋白质。因此，该设计被应用于下一节中功能性蛋白的化学合成表达。
【数据】sfGFP：22→37°C提高6倍；RFP：22→37°C降至10%；RSF ori PCN增加、pSC101 ori PCN减少
3.4 温度介导系统用于衣康酸生产
T7可逆开关/关断控制进一步应用于表达乌头酸酶（EcAcnA）和顺式乌头酸脱羧酶（AtCadA），通过新型基因调控工具生产可生物降解化学物质——衣康酸。如图4A所示，柠檬酸可通过EcAcnA和AtCadA转化为衣康酸。因此，通过改变两种酶的比例，生产可在衣康酸和顺式乌头酸之间来回切换。SDS-PAGE分析显示，在HELA菌株（即BL21(DE3)携带pHCC-EcAcnA和pSB4A3-AtCadA）中，温度从22°C升至37°C时EcAcnA增加而AtCadA减少（图4B左）。相反，HALE菌株（即BL21(DE3)携带pHCC-AtCadA和pSB4A3-EcAcnA）中EcAcnA的表达逐渐减少，而AtCadA从22°C到30°C和37°C逐渐增加（图4B右）。PCN和IA滴度在3个不同温度下的详细分析见原文。
【数据】HELA菌株：温度升高→EcAcnA↑、AtCadA↓；HALE菌株：温度升高→EcAcnA↓、AtCadA↑
讨论与解读
温度诱导系统因相对于化学诱导的优势而受到广泛关注，但以往需要特定的启动子工程和相应的调控因子。此外，基于转录因子的系统难以应用于蛋白质过表达。本研究基于一项新发现开发了简单的温度诱导系统设计：复制起点的拷贝数随温度升高而增加（pUC和pRSF）或减少（pSC101和pCloDF13）。温度敏感性质粒复制的表现与启动子选择无关，这使其更具通用性。最终，使用pRSF ori和pSC101 ori的双质粒T7系统实现了热可切换、可逆的蛋白质过表达——以绿色到红色荧光信号作为"交通灯演示"——并进一步应用于衣康酸生产。温度介导的复制起点可用于多样化的可逆可切换功能蛋白表达，对合成生物学社区高度可及，未来有望惠及工业应用。
编译者解读：该研究的核心价值在于将"温度"这一物理参数直接作用于质粒复制层面，而非传统的转录调控层面，为合成生物学提供了一种无需化学诱导剂的可逆表达工具。利用不同复制起点对温度的差异化响应构建"双色交通灯"系统，思路简洁而巧妙。将温度切换与代谢产物（衣康酸）生产耦合的验证，也展示了从调控元件到化学品的完整链条。不过，温度调控的响应时间和空间精度仍不及化学诱导，多基因协同的精细比例调控也有待进一步探索——这为后续在工业-scale发酵中优化温度切换策略留下了空间。
参考来源
Yi, Y.-C. (2023). Exploring temperature-mediated plasmid replication as a reversible and switchable protein expression system in genetic Escherichia coli. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. DOI: 10.1016/j.jtice.2023.104751
DOI: 10.1016/j.jtice.2023.104751