来源：Adaptive laboratory evolution induces cell wall alterations for succinic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
琥珀酸是一种重要的平台化合物，但其高浓度对酵母细胞的抑制作用限制了发酵效率。本研究通过适应性实验室进化（ALE）策略，成功获得能够在40 g/L琥珀酸条件下生长的酿酒酵母进化菌株。全基因组测序鉴定出11个基因突变，其中6个与细胞壁功能相关。研究揭示了MNN4基因缺失和GAS1E267K突变通过重塑细胞壁结构增强琥珀酸耐受性的分子机制，为低pH条件下琥珀酸的高效生物发酵提供了新的菌株改造靶点。
研究背景
随着全球气候变化影响加剧，利用可再生资源生产重要工业化学品成为研究热点。琥珀酸被公认为可从可再生生物质中获取的关键平台化学品，是1,4-丁二醇、γ-丁内酯、四氢呋喃和聚丁二酸丁二醇酯等高价值衍生物的前体。琥珀酸的生产菌株包括曼海姆产琥珀酸菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母等。已有研究表明，谷氨酸棒杆菌菌株产琥珀酸滴度可达146 g/L，超过曼海姆产琥珀酸菌PALKmsmdhG11Q的134.25 g/L。然而，生产过程中需要大量碱性物质维持发酵液pH为6.5，随后还需使用大量H₂SO₄进行琥珀酸提取，这严重影响了过程的经济可行性。因此，开发能够在低pH条件下耐受高浓度琥珀酸的菌株是提高发酵效率的关键方向。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株列于表S1。酿酒酵母CEN.PK 113-5D用于进化实验。工程菌株基于IMX581开发，IMX581是来源于CEN.PK 113-5D的Cas9整合菌株。大肠杆菌DH5α用于质粒构建。LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）用于培养大肠杆菌DH5α，添加或不添加100 μg/mL氨苄青霉素，培养条件为37°C、250 rpm。不含尿嘧啶的合成限定培养基（SD-URA）（20 g/L葡萄糖、1.7 g/L酵母氮碱（不含氨基酸）、5 g/L (NH₄)₂SO₄、0.77 g/L完全补充混合物（CSM，不含尿嘧啶））用于酵母菌株筛选和培养。必要时，向SD-URA培养基中添加40 mg/L尿嘧啶以将其转化为SD培养基。YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）用于酵母菌株培养，添加或不添加200 μg/mL G418。必要时，添加20 g/L琼脂制备固体培养基。
【数据】培养基：LB、SD-URA、SD、YPD；氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；G418浓度：200 μg/mL；温度：37°C（大肠杆菌）；转速：250 rpm；葡萄糖：20 g/L
2.2 质粒构建与引物
本研究所用质粒列于表S1。pROS13质粒作为模板用于扩增KanMX4敲除表达盒，上下游同源臂各为41 bp。GTR-CRISPR/Cas9系统用于MNN4、MNN5、HDA1和GAS1的敲除，该系统参照前期研究。含有20 bp gRNA的引物用于扩增质粒pYZ463。OCH1和CBK1的点突变和敲除质粒按照前期描述的方法构建。本研究所用引物列于表S1。
【数据】同源臂长度：41 bp；gRNA长度：20 bp
2.3 菌株构建
为筛选含有KanMX4标记的菌株，使用补充200 mg/L G418的YPD培养基。基因敲除构建中，使用引物扩增带有靶区域上下游各100 bp同源臂的供体DNA。点突变菌株构建中，使用引物扩增包含靶区域同源臂和预期突变的供体DNA。设计两个互补寡核苷酸作为修复片段，引入预期突变并使PAM位点失活。酵母转化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG方法。菌株构建通过测序确认。
【数据】G418浓度：200 mg/L；同源臂长度：100 bp；转化方法：LiAc/SS carrier DNA/PEG
2.4 适应性实验室进化
将菌株CEN.PK 113-5D的单菌落接种到SD培养基中，在摇床培养箱中过夜培养。次日，将培养物稀释至初始光密度（OD₆₀₀）约0.1，转移到补充30 g/L SA的SD培养基中。该设置用于三个独立摇瓶的连续传代，分别命名为H1、H2和H3。传代间隔根据菌株生长状态调整，每次传代起始OD₆₀₀约为0.1。SA浓度逐步递增。当进化菌株在45 g/L SA存在下表现出稳健生长时，进化过程完成。随后，将进化菌株划线接种到SD + 40 g/L SA平板上，培养2至3天。从这些平板中随机选取2至3个生长良好的单菌落进行进一步实验分析。生长速率常数（R）按以下公式计算：R = n/t = (log₂x₂ - log₂x₁)/(t₂ - t₁)，其中R为生长速率常数，n为酵母世代数，t为繁殖所需时间（小时），x₂为时间t₂时的最终种群大小（细胞密度），x₁为时间t₁时的初始种群大小（细胞密度）。
【数据】起始SA浓度：30 g/L；进化终点SA浓度：45 g/L；初始OD₆₀₀：约0.1；进化时间：约40天；平板培养时间：2-3天
2.5 全基因组测序与分析
将进化菌株和对照菌株CEN.PK 113-5D接种到20 mL YPD培养基中，过夜培养至OD₆₀₀约3。使用快速真菌基因组DNA分离试剂盒提供的方案从酵母细胞中提取基因组DNA。全基因组测序和分析由上海桑尼生物科技有限公司完成。原始数据可从欧洲核苷酸档案库下载，登录号为PRJEB81478。使用CEN.PK 113-7D基因组进行序列比对。进化菌株中鉴定到的突变列于表S2。
【数据】培养体积：20 mL YPD；OD₆₀₀：约3；测序机构：桑尼生物（上海）；数据库登录号：PRJEB81478
2.6 分析方法
从YPD平板挑取单菌落接种到含20 mL SD培养基的摇瓶中，于30°C、200 rpm条件下过夜培养。随后将菌株接种到40 mL SD培养基中（含或不含20 g/L SA），初始OD₆₀₀约为0.1。在不同时间点（0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h）收集1-2 mL样品。将培养物稀释至适当浓度后，使用分光光度计（Yoke Instrument，中国）通过OD₆₀₀测定细胞密度。剩余样品（>0.8 mL）在8000 rpm离心1分钟，经0.22 μm滤膜过滤获得上清液用于进一步分析。使用高效液相色谱（HPLC）（岛津公司，日本）分析不同生长阶段上清液中的代谢物浓度。分析条件如下：色谱柱HPX-87H（Bio-Rad）；流动相：5 mM H₂SO₄；柱温和流速分别设置为45°C和0.6 mL/min。
【数据】SA浓度：20 g/L；初始OD₆₀₀：约0.1；取样时间点：0、4、8、12、24、36、48、60、72、84 h；离心：8000 rpm、1 min；滤膜：0.22 μm；色谱柱：HPX-87H；流动相：5 mM H₂SO₄；柱温：45°C；流速：0.6 mL/min
2.7 琥珀酸耐受性分析
为评估菌株对SA的耐受性，从YPD平板挑取单菌落接种到含20 mL SD培养基的摇瓶中，于30°C、200 rpm条件下过夜培养。将培养物稀释10倍，使用分光光度计（Yoke Instrument，中国）测定OD₆₀₀。随后，在48孔板中，每孔加入1 mL含不同浓度SA（20 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L）的SD培养基。将每孔的细胞密度调整至初始OD₆₀₀约为0.1。将平板置于微孔板振荡器（MIULAB，中国）中，于30°C、600 rpm条件下培养48小时。之后，将培养物稀释至适当浓度，再次使用分光光度计（Yoke Instrument，中国）测定细胞密度。
【数据】SA浓度梯度：20、30、35、40、45 g/L；初始OD₆₀₀：约0.1；温度：30°C；转速：600 rpm；时间：48 h
2.8 酵母裂解酶处理
为评估菌株对酵母裂解酶的敏感性，从SD平板挑取单菌落接种到含20 mL SD培养基（含20 g/L SA）的摇瓶中，于30°C、200 rpm条件下培养两天。使用分光光度计（Yoke Instrument，中国）测定细胞密度，然后离心收集细胞沉淀（约2 × 10⁷个细胞）。沉淀用PBS洗涤两次，离心去除上清液。将细胞重悬于200 μL酵母裂解酶测定缓冲液中[50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、4% PEG（8000）和2 U酵母裂解酶]。取150 μL细胞悬液转移到96孔白板中，使用微孔板读数器（SpectraMax iD3，Molecular Devices，美国）测定OD₆₀₀。
【数据】SA浓度：20 g/L；培养时间：2天；细胞数量：约2 × 10⁷；Tris-HCl：50 mM（pH 7.5）；NaCl：150 mM；EDTA：5 mM；PEG（8000）：4%；酵母裂解酶：2 U；样品体积：150 μL
2.9 蛋白质结构分析
Gas1p的结构从UniProt获取（https://www.uniprot.org/），登录号为P22146，并使用AlphaFold进行预测。底物结构从BRENDA数据库获取（https://www.brenda-enzymes.org/）。使用PyMOL 2可视化静电分子势能表面和反应原子间的距离。
【数据】UniProt登录号：P22146；结构预测工具：AlphaFold；可视化工具：PyMOL 2
2.10 统计分析
所有实验均进行三次重复。使用双尾t检验和方差分析进行统计分析，使用Microsoft Excel 2019完成。数据以平均值±标准差表示，显著性水平标注为 P < 0.05、 P < 0.01和 P < 0.001。
【数据】重复次数：3；统计方法：双尾t检验、方差分析；显著性水平：P<0.05，P<0.01，P<0.001
研究结果
3.1 适应性实验室进化及进化菌株的分离
在启动ALE之前，确定适合酿酒酵母群体进化的SA浓度至关重要。我们将亲本菌株CEN.PK 113-5D接种到含不同SA浓度的SD培养基中评估其耐受性。在20 g/L SA（pH = 2.75）条件下，细胞密度约为对照组的30%，而更高的SA浓度进一步抑制细胞生长（图1A）。基于这些结果，我们选择30 g/L SA作为进化适应的起始浓度。经过约40天的连续传代，SA浓度逐步增加至45 g/L（图1B）。三个独立进化的菌株系列（H1、H2和H3）能够在含40 g/L SA的培养基中生长，而对照菌株不能生长（图1C）。此外，亲本菌株CEN.PK 113-5D在30 g/L SA条件下几乎不能生长，在更高浓度下完全不能生长，而进化菌株系列的单克隆表现出对这些更高SA条件的耐受性（图1D）。这些菌株还表现出对其他二羧酸（戊二酸、己二酸和庚二酸）的耐受性，其中菌株H2-2在酸胁迫条件下表现出相对较低的抑制（图S1）。该实验通过ALE成功开发出能够在高浓度SA导致的低pH（<3）培养基中生长的菌株。
【数据】20 g/L SA时细胞密度：对照组的约30%；起始SA浓度：30 g/L；终点SA浓度：45 g/L；进化时间：约40天；pH：2.75（20 g/L SA）
3.2 进化菌株的表型特征
进化菌株系列表现出增强的酸耐受性，促使我们详细检查它们在20 g/L SA条件下的代谢响应——该条件下亲本菌株CEN.PK 113-5D也能生长。在不含SA的培养基中，H1和H2的生长水平与CEN.PK 113-5D相似，而H3的生长明显降低。在SA存在下，所有进化菌株相比CEN.PK 113-5D均表现出增强的生长（图2A和B）。在不含SA的培养基中，所有菌株在24小时内完成葡萄糖摄取，这与先前报道的CEN.PK背景菌株C0的表现一致。然而，SA的引入将摄取时间延长至48小时。值得注意的是，在此时间之后，菌株CEN.PK 113-5D的葡萄糖利用显著降低，与细胞密度接近最大值的时间吻合（图2C和D）。进化菌株系列在24小时时乙醇产量达到峰值。菌株C0的乙醇产量在24小时也达到约8 g/L。与在不含SA的SD培养基中培养的菌株相比（图2E），SA的添加对乙醇消耗产生负面影响（图2F）。具体而言，CEN.PK 113-5D菌株在SA存在下几乎丧失代谢乙醇的能力。相比之下，进化菌株保留了一定的乙醇同化能力，在发酵36至84小时期间消耗约3 g/L乙醇。这表明进化菌株中的突变可能赋予代谢优势，使其能够在SA胁迫下继续利用乙醇。有趣的是，在SD培养基中，菌株H2在48小时内完全消耗甘油，比CEN.PK 113-5D和C0快24小时。菌株H1也能够利用甘油，而H3不能，这可能解释了其生长减少的原因（图2G）。在SA存在下，所有菌株在初始产生后均不能利用产生的甘油作为碳源，三个进化菌株表现出不同的甘油滴度，表明存在多样的代谢适应（图2H）。在24小时完全消耗葡萄糖后，SA产量迅速增加。CEN.PK 113-5D输出的SA量略高于H1和H2，而H3产生最高水平（图2I）。这一过程能量需求很高。结果表明，外源添加的SA未被显著消耗（图2J）。这些发现表明，细胞外碳源摄取和利用的变化为进化菌株在SA富集环境中提供了生存优势。需要进一步研究阐明这些适应的潜在机制。为更详细地探索这些机制，我们接下来进行了全基因组测序。
【数据】SA浓度：20 g/L；葡萄糖完全消耗时间（无SA）：24 h；葡萄糖完全消耗时间（有SA）：48 h；乙醇峰值时间：24 h；C0乙醇产量：约8 g/L；进化菌株乙醇消耗量：约3 g/L（36-84 h）；H2甘油完全消耗时间：48 h（比对照快24 h）；培养时间：84 h
3.3 测序分析鉴定与细胞壁完整性相关的突变
对三个进化群体中每个群体的1至2个高性能突变体进行全基因组测序，揭示了进化克隆中的突变（详细突变信息见表S2）。这些突变通过PCR扩增和测序重新验证（图3A）。对三个群体中11个突变靶标的GO富集分析表明，主要与蛋白质N-连接糖基化、高尔基体和转移酶等过程相关（图S2）。MNN4和MNN5发生导致功能丧失的突变，而OCH1存在错义突变。这些是参与酵母细胞壁甘露聚糖生物合成的关键基因。酵母细胞壁的复杂结构由β-葡聚糖与几丁质和甘露糖蛋白交联组成，形成影响形态和机械强度的稳健三维框架。OCH1对于通过掺入α-1,6-连接的甘露糖残基启动完整甘露聚糖外链的生物合成至关重要，这是形成含50至200个单元的高甘露糖多糖链所必需的。相反，MNN4和MNN5主要参与第一个α-1,2-甘露糖侧链的修饰。全局表达研究表明，与细胞表面传感器相关的基因（如WSC3和MID2）在SA胁迫下显著上调。推测甘露聚糖上这些侧链修饰的变化可能显著增强酵母对SA的耐受性（图S3）。酿酒酵母中的RAM信号网络对细胞存活至关重要。它包括两个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Cbk1p和Kic1p。此外，四个相关蛋白Mob2p、Tao3p/Pag1p、Hym1p和Sog2p也是该网络的组成部分（图S4A）。研究表明，KIC1的缺失或过表达分别导致酵母细胞壁中β-1,6-葡聚糖水平的降低或升高。在H3中鉴定到Kic1p的特异性突变（KIC1P188S），该突变不存在于H1和H2中。值得注意的是，在H1和H2中观察到Cbk1p的不同突变（CBK1F471L、CBK1V675F），表明RAM通路可能在SA耐受性中发挥关键作用。Kic1p可以磷酸化下游激酶Cbk1p，后者激活锌指转录因子Ace2p。Ace2p的功能丧失突变先前已在乳酸耐受突变体中被鉴定。此外，条件性Cbk1p突变体导致Och1p在高尔基体内的错误定位，导致糖基化缺陷。这些激酶突变提示与细胞壁完整性（CWI）存在潜在联系；然而，这些突变的功能意义需要进一步研究。在H1中鉴定到Gas1p的特异性突变（GAS1E267K），该突变不存在于H2和H3中。GAS1基因编码β-1,3-葡聚糖转移酶，该酶催化细胞壁中β-1,3-葡聚糖链的合成。GAS1的转录在pH高于4.0时下调，在pH低于该阈值时显著上调。此外，GAS1的敲除降低酵母生长速率，而其过表达增强酿酒酵母对低pH环境的耐受性。总体而言，我们的分析在三个进化群体中均鉴定到与CWI相关的突变。
【数据】鉴定突变总数：11个；进化群体数：3个；细胞壁相关突变基因：6个；甘露聚糖链长度：50-200个单元
3.4 突变对细胞壁功能的影响
为进一步验证细胞壁相关突变对SA耐受性的贡献，我们构建了携带单个突变的工程菌株。在30 g/L和35 g/L SA条件下，Δmnn4菌株表现出显著增强的耐受性，而Δmnn5和OCH1突变体未表现出明显改善（图3D-P）。GAS1E267K突变体在35 g/L SA条件下也表现出增强的生长。这些结果证实MNN4缺失和GAS1E267K突变是赋予SA耐受性的关键遗传因素。
【数据】SA浓度：30 g/L、35 g/L；培养时间：48 h；温度：30°C
3.5 细胞壁结构变化的表征
酵母裂解酶处理实验显示，Δmnn4菌株对酵母裂解酶的敏感性增加，表明细胞壁结构发生了改变。GAS1E267K突变体的β-1,3-葡聚糖链结构发生变化，通过静电分子势能表面分析发现，突变改变了底物相互作用的距离，有效重塑了细胞壁中的β-1,3-葡聚糖链。这些物理修饰共同增强了细胞壁的完整性和对SA的耐受性。
【数据】酵母裂解酶用量：2 U；缓冲液成分：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、4% PEG（8000）
3.6 理性工程改造
基于上述发现，我们构建了组合突变菌株J06（Δmnn4 GAS1E267K）。该菌株在含SA的培养基中表现出比单突变菌株更强的生长能力，表明MNN4缺失和GAS1E267K突变具有协同效应。细胞壁结构变化的示意图显示了这些突变如何共同重塑细胞壁的甘露聚糖侧链和β-1,3-葡聚糖链。
【数据】组合突变：Δmnn4 + GAS1E267K；SA浓度：30 g/L、35 g/L；培养时间：48 h；温度：30°C
讨论与解读
本研究通过ALE策略成功获得了能够在40 g/L SA条件下生长的酿酒酵母进化菌株，并鉴定出11个基因突变，其中6个与细胞壁功能相关。MNN4基因的缺失损害甘露糖侧链并显著增加对SA的抗性；GAS1E267K突变通过改变静电分子势能表面和减少底物相互作用距离，有效重塑细胞壁中的β-1,3-葡聚糖链。这些发现强调了细胞壁在增强酵母对SA耐受性中的核心作用，为低pH条件下SA生产的菌株工程改造提供了明确靶点。
编译者解读： 该研究巧妙地将ALE与全基因组测序相结合，从进化菌株中锁定细胞壁重塑这一核心耐受机制，方法学上具有示范意义。MNN4与GAS1的组合改造策略为工业菌株的理性设计提供了直接靶点——细胞壁完整性在有机酸耐受中的核心地位再次得到验证。值得关注的是，进化菌株还表现出对多种二羧酸的交叉耐受性，这暗示细胞壁重塑可能是一个广谱的酸耐受策略。然而，从实验室表型到工业发酵条件的转化仍需考量高渗、传质等因素的交互影响。后续研究若能解析细胞壁重塑与膜转运蛋白的协同调控，将有望进一步突破低pH发酵的瓶颈。
参考来源
Qin L. Adaptive laboratory evolution induces cell wall alterations for succinic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132302
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132302