来源：Pheromone-mediated quorum sensing enables dynamic regulation of cordycepin biosynthesis in Cordyceps militaris（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虫草素是一种具有广泛药理活性的核苷类化合物，其生物合成受多层代谢机制严格调控。本研究在蛹虫草（Cordyceps militaris）中重构了信息素介导的群体感应（QS）系统，实现信号响应型虫草素生物合成调控。通过系统发育与保守结构域分析，研究者发现蛹虫草信息素受体PreB与转录因子SteA和酿酒酵母Ste2/Ste12存在跨物种功能兼容性。借助色氨酸响应型启动子PARO9驱动α-信息素表达，该系统在高细胞密度下特异性激活关键生物合成基因cns1和cns2，使虫草素产量达226.5 mg/L，较野生型提高175.9%。进一步通过2A肽介导的多基因共表达与前体供给工程改造，虫草素产量提升至447.9 mg/L，增幅达445.3%。
研究背景
在代谢工程与合成生物学领域，提高目标代谢物合成是微生物细胞工厂设计的核心目标。为高效重定向代谢流，常需减弱竞争途径活性并强化目标生物合成模块。传统静态工程策略依赖固定基因组修饰，如基因敲除或组成型过表达，缺乏对细胞或环境动态变化的响应能力，往往导致代谢失衡和有毒中间体积累，最终限制生产力。动态调控策略则能实现时间依赖和信号响应的基因控制，促进细胞生长与代谢物高效合成的平衡。群体感应介导的动态调控通过信号分子协调群体行为与基因表达，已在原核生物中得到广泛应用。在真核生物尤其是真菌中，群体感应研究仍相对有限。Williams等人在酿酒酵母中改造了天然信息素通讯系统，开发出正反馈QS回路——α-信息素被G蛋白偶联受体Ste2识别后激活下游信号通路。然而，将此类系统移植到丝状药用真菌并用于天然代谢途径的动态调控，此前尚未见报道。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株汇总于补充材料。野生型蛹虫草菌株购自上海微生物保藏中心。基因工程菌株通过靶向遗传修饰构建。野生型和重组菌株均接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板（26 g/L马铃薯葡萄糖肉汤，15 g/L琼脂），25°C培养7天。随后将菌丝块（0.8 cm²）转移至含100 mL发酵培养基（20 g/L葡萄糖、10 g/L胰蛋白胨、0.5 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、0.5 g/L K₂HPO₄、1.0 g/L甘氨酸、100 mg/L头孢呋辛钠盐）的250 mL锥形瓶中。培养物于25°C、150 rpm振荡培养3天制备种子液。摇瓶发酵时，按3%（v/v）接种量将种子液接入100 mL发酵培养基（250 mL锥形瓶），25°C、150 rpm培养7天。种子培养3天后，按3%（v/v）接种量转接至新鲜培养基，并在转接时添加色氨酸。选择该时间点是为了在群体感应回路和次生代谢诱导前积累充足生物量。本研究未对诱导时机进行系统优化。
大肠杆菌DH5α购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，在添加卡那霉素（终浓度100 mg/L）的Luria–Bertani（LB）培养基中37°C培养14–16小时。根癌农杆菌AGL-1购自上海茂康生物科技有限公司，在添加卡那霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的LB培养基中28°C培养2–3天。
【数据】培养基：PDA（26 g/L PDB+15 g/L琼脂）；发酵培养基：20 g/L葡萄糖+10 g/L胰蛋白胨+0.5 g/L KH₂PO₄+0.5 g/L MgSO₄·7H₂O+0.5 g/L K₂HPO₄+1.0 g/L甘氨酸+100 mg/L头孢呋辛钠；温度：25°C；转速：150 rpm；时间：种子培养3天+发酵7天；接种量：3%（v/v）；大肠杆菌：LB+卡那霉素100 mg/L，37°C，14–16 h；农杆菌：LB+卡那霉素50 mg/L+利福平25 mg/L，28°C，2–3天
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用质粒和引物汇总于补充材料。原始质粒pCAMBIA-PgpdA-EGFP-Tcbh1-Hyg-PtrpC（含荧光报告基因egfp和潮霉素B抗性 cassette）由浙江大学的蔡黎念博士惠赠。质粒pCAMBIA-PgpdA-mfα1-PFUS1-EGFP-Hyg（北京擎科生物科技有限公司合成）用于验证群体感应通路的功能。为构建色氨酸响应的群体感应回路以实现虫草素生物合成的动态调控，合成了质粒pCAMBIA-PARO9-mfα1-PFUS1-Hyg（北京擎科生物科技有限公司）。虫草素生物合成关键基因cns1（CCM_04436）和cns2（CCM_04437）以及前体合成基因nt5e（CCM_02831）的核苷酸序列从NCBI数据库获取。设计基因特异性引物，通过PCR从蛹虫草基因组中扩增相应片段。重组质粒使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V3（诺唯赞，南京）构建，在大肠杆菌DH5α中扩增并经测序验证（北京擎科生物科技有限公司）。测序正确的重组质粒转化至根癌农杆菌AGL-1用于真菌转化。
为确定最佳抗生素筛选压力，将野生型蛹虫草接种于含不同浓度潮霉素B（0、50、100、150、200和250 μg/mL）的PDA平板上培养，以确定转化子筛选的最适浓度。重组蛹虫草菌株通过农杆菌介导转化获得。潮霉素B抗性且抗性基因PCR阳性的转化子在含潮霉素B的PDA平板上连续传代以确保遗传稳定性。每个构建体至少随机选取3个经PCR验证的独立ATMT转化子进行表型表征。
【数据】质粒：pCAMBIA-PgpdA-mfα1-PFUS1-EGFP-Hyg和pCAMBIA-PARO9-mfα1-PFUS1-Hyg；基因：cns1（CCM_04436）、cns2（CCM_04437）、nt5e（CCM_02831）；潮霉素B筛选浓度梯度：0、50、100、150、200、250 μg/mL；转化方法：农杆菌介导转化（ATMT）；每个构建体转化子数：≥3个
2.3 生物信息学分析
对酿酒酵母和蛹虫草的信息素受体及转录因子同源物进行分析，相应蛋白序列从NCBI数据库获取。分析物种包括蛹虫草及其相关昆虫病原真菌（冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis、球孢白僵菌Beauveria bassiana）、酵母（酿酒酵母S. cerevisiae、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis、白色念珠菌Candida albicans）、模式丝状真菌（粗糙脉孢菌Neurospora crassa、构巢曲霉Aspergillus nidulans、烟曲霉Aspergillus fumigatus、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、里氏木霉Trichoderma reesei、大孢粪壳菌Sordaria macrospora）、其他代表性子囊菌门物种（产黄青霉Penicillium chrysogenum、球毛壳菌Chaetomium globosum、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、拟青霉Paecilomyces variotii、辣椒炭疽菌Colletotrichum higginsianum、鹅柄孢壳菌Podospora anserina）以及外群类玉米黑粉菌Mycosarcoma maydis。系统发育树使用MEGA（版本12）以邻接法（NJ）构建，1,000次bootstrap重复。保守结构域信息同样从NCBI获取，保守区域对应的氨基酸序列经比对后进行序列比较和结构域分析。多序列比对使用MEGA 12中集成的ClustalW完成。
【数据】物种数：19种；建树方法：邻接法（NJ）；bootstrap重复：1,000次；软件：MEGA 12；比对工具：ClustalW
2.4 蛹虫草中EGFP荧光的观察与定量
将无菌玻璃盖玻片（20 mm × 20 mm）以约45°角插入接种相应重组菌株的PDA平板中。培养物于25°C避光培养至菌丝长过插入位点。小心取出盖玻片，在荧光显微镜下观察。为获得更清晰图像，选取单根菌丝进行观察和记录。
含质粒pCAMBIA-PARO9-mfα1-PFUS1-Hyg的重组蛹虫草菌株在添加不同浓度色氨酸的发酵培养基中培养。发酵液离心收集菌丝体，用PBS缓冲液（pH 7.2）洗涤3次，冷冻干燥至恒重。干燥菌丝体在液氮中研磨成细粉，取0.2 g粉末悬浮于20 mL PBS中。悬浮液在冰上超声处理并离心，取上清液用于荧光测量。EGFP荧光强度使用荧光分光光度计（F7000，日立，日本）测量，激发波长488 nm，发射波长509 nm。所有荧光强度均归一化至相应蛋白浓度。
【数据】盖玻片规格：20 mm × 20 mm；插入角度：约45°；培养温度：25°C；PBS缓冲液：pH 7.2；样品量：0.2 g粉末/20 mL PBS；激发波长：488 nm；发射波长：509 nm；仪器：F7000荧光分光光度计（日立）
2.5 RNA提取与RT-qPCR分析
野生型和重组蛹虫草菌株接种于液体发酵培养基中，25°C避光、150 rpm振荡培养7天。收集菌丝体后，使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（诺唯赞，南京）提取总RNA。以500 ng总RNA为模板，使用HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR（诺唯赞，南京）合成互补DNA（cDNA）。实时荧光定量PCR使用SupRealQ Ultra Hunter SYBR qPCR Master Mix（U+）（诺唯赞，南京）在ABI QuantStudio 5 Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美国）上进行。蛹虫草的延伸因子1-α基因tef1（CCM_00809）作为内参。相对mRNA表达水平采用2^–ΔΔCt法计算。
【数据】RNA提取试剂盒：FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit；逆转录：500 ng总RNA，HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix；qPCR试剂：SupRealQ Ultra Hunter SYBR qPCR Master Mix（U+）；仪器：ABI QuantStudio 5；内参基因：tef1（CCM_00809）；计算方法：2^–ΔΔCt法；培养条件：25°C、150 rpm、7天
2.6 虫草素的生产与检测
发酵液离心后用0.22 µm滤膜过滤。虫草素定量使用Agilent 1260 HPLC系统（Agilent Technologies，加利福尼亚，美国），配备Welch Ultimate AQ-C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 µm）。流动相为85%水和15%甲醇。进样量10 µL，柱温40°C，流速1 mL/min。
【数据】滤膜孔径：0.22 µm；HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18（4.6 × 250 mm，5 µm）；流动相：85%水+15%甲醇；进样量：10 µL；柱温：40°C；流速：1 mL/min
研究结果
3.1 蛹虫草中群体感应系统的设计与构建
基于19种真菌物种的信息素受体和转录因子构建了系统发育树。分析显示，蛹虫草的信息素受体PreB（NCBI登录号：XP_006671955）和转录因子SteA（NCBI登录号：XP_006666663）与酿酒酵母的信息素受体Ste2（NCBI登录号：NP_116627）和转录因子Ste12（NCBI登录号：QHB09078）在进化上距离较远，凸显了丝状真菌与酵母之间的进化分歧（图1A-B）。然而，蛹虫草与其他昆虫病原真菌如球孢白僵菌和冬虫夏草紧密聚类，表明昆虫病原真菌中信息素受体和转录因子高度保守。酵母类群（包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和白色念珠菌）形成独立分支，说明酵母型Ste2和Ste12经历了显著的序列分化。粗糙脉孢菌、构巢曲霉和禾谷镰刀菌等丝状真菌形成另一分支，与蛹虫草相邻，表明蛹虫草PreB和SteA更接近丝状真菌类型，尤其是里氏木霉（图1A-B）。
使用NCBI工具对蛹虫草PreB和SteA以及酿酒酵母Ste2和Ste12进行保守结构域分析（图1C）。PreB和SteA均含有真菌信息素交配因子STE2 G蛋白偶联受体结构域（NCBI登录号：pfam02116）。Ste12和Ste2均具有STE样转录因子结构域（NCBI登录号：pfam02200），而Ste12还拥有锌指双结构域（NCBI登录号：pfam13465），与其更高级的进化特征一致。保守结构域的氨基酸序列比对显示SteA和Ste12之间具有63.6%的同一性（见补充材料）。虽然信息素受体PreB和Ste2保守结构域之间的氨基酸序列同一性相对较低，但两者均具有G蛋白偶联受体（GPCR）的结构特征，提示功能高度保守。这些发现表明酿酒酵母的α-信息素可能在蛹虫草中发挥功能。
为验证酿酒酵母α-信息素信号通路是否在蛹虫草中有功能，我们构建了携带群体感应系统的报告质粒pCAMBIA-PgpdA-mfα1-PFUS1-EGFP-Hyg（图2C）。在该系统中，α-信息素的组成型表达预期激活内源PreB–SteA信号通路，启动PFUS1驱动的EGFP表达。重组菌株通过农杆菌介导转化获得。潮霉素B敏感性测试表明，野生型菌株在含200 μg/mL潮霉素B的PDA平板上被完全抑制（见补充材料）；因此使用该浓度筛选转化子。抗生素筛选和转化子筛选的额外验证数据见补充材料。重组菌株CM-G1通过hyg抗性基因的PCR扩增确认，并在荧光显微镜下表现出强烈的绿色荧光，而野生型菌株未观察到荧光（图2D）。
这些结果证实α-信息素通路在蛹虫草中功能保守。这一发现建立了与真菌调控网络兼容的跨王国合成QS回路。与以往在酿酒酵母中改造整个信息素信号级联的研究不同，我们的设计依赖蛹虫草内源的PreB–SteA模块，仅引入α-信息素和PFUS1启动子。据我们所知，这是首次证明信息素介导的QS回路能功能适配丝状药用真菌，并直接应用于天然虫草素途径的动态调控。
【数据】信息素受体PreB登录号：XP_006671955；转录因子SteA登录号：XP_006666663；Ste2登录号：NP_116627；Ste12登录号：QHB09078；保守结构域同一性：SteA与Ste12为63.6%；潮霉素B完全抑制浓度：200 μg/mL
3.2 使用诱导型启动子优化动态调控系统
蛹虫草发酵需要制备种子液以激活菌丝生长。为实现培养过程中的群体感应激活，我们将PgpdA替换为色氨酸响应型启动子PARO9，构建了色氨酸诱导的QS回路（图3A）。在该设计中，扩增阶段添加色氨酸即激活QS回路。构建质粒pCAMBIA-PARO9-mfα1-PFUS1-Hyg并通过农杆菌介导转化导入蛹虫草。重组菌株CM-A1经hyg抗性基因PCR扩增确认。
为确定系统激活的最适色氨酸浓度，我们使用荧光分光光度计测量了不同色氨酸浓度下的EGFP荧光强度。结果表明，荧光强度在80 µg/mL色氨酸时达到峰值，比不添加色氨酸的对照组高4.8倍（图3B）。菌株CM-A1的生物量与野生型（WT）菌株相当，表明重组菌株维持正常生长。然而，当色氨酸超过80 μg/mL时，EGFP荧光逐渐下降。一个合理的解释是，过量的α-信息素产生造成生长负担，进而降低报告基因输出。这一趋势与酿酒酵母中的观察一致——高α-信息素水平可通过细胞周期阻滞抑制生长。值得注意的是，在蛹虫草中该效应被解释为一般的生长抑制负担，而非典型的G1期阻滞证据。需要指出的是，生物量减少仅在初步浓度筛选时的过量色氨酸浓度下观察到，而在用于虫草素生产的优化色氨酸水平下，工程菌株的生物量与野生型相当。
为进一步验证80 µg/mL色氨酸下的EGFP表达，我们进行了RT-qPCR分析。结果显示该条件下EGFP转录水平显著升高（图3C）。报告基因的时间进程监测揭示了明显的动态诱导模式。添加色氨酸后12小时EGFP水平仍较低，而荧光在72至96小时之间显著增加，表明PFUS1的激活需要上游信息素信号的充分积累（见补充材料）。此外，在未添加色氨酸的培养物中也观察到基础水平的EGFP表达，这可能是由于发酵培养基的有机氮源（胰蛋白胨）中存在色氨酸，导致泄漏表达。当菌株CM-A1在添加80 µg/mL色氨酸的PDA培养基上生长并在荧光显微镜下观察时，再次检测到强烈的绿色荧光（图3D）。荧光显微镜用于报告基因激活的定性可视化，而PFUS1驱动的EGFP表达通过RT-qPCR定量验证。
这些结果表明，所设计的动态调控系统具有清晰且稳健的诱导特性和响应性，证实了使用色氨酸响应型启动子PARO9在蛹虫草中精确激活群体感应通路的可行性。此外，为确定在胰蛋白胨培养基中观察到的PFUS1基础活性是回路固有的还是培养基依赖性的，将菌株CM-A1在缺乏氨基酸的硫酸铵基础培养基中培养。在该条件下，未观察到EGFP荧光。
【数据】最适色氨酸浓度：80 µg/mL；荧光强度提升：4.8倍（vs无色氨酸对照）；EGFP转录水平：显著升高；诱导时间：72–96 h荧光显著增加；12 h时EGFP水平仍低
3.3 动态调控系统在虫草素生产中的应用
基于上述结果，我们将动态调控系统应用于蛹虫草中虫草素的生物合成（图4A）。虫草素生物合成途径中，cns1和cns2是关键的生物合成基因。将质粒pCAMBIA-PARO9-mfα1-PFUS1-Hyg导入蛹虫草后，重组菌株CM-A1在添加80 µg/mL色氨酸的发酵培养基中培养7天。HPLC分析显示，CM-A1菌株的虫草素产量达到226.5 mg/L，较野生型提高了175.9%（图4B）。这一结果表明，动态调控系统能在高细胞密度下特异性激活cns1和cns2基因的表达，从而显著提升虫草素产量。
为进一步提升虫草素产量，我们通过2A肽介导的多基因共表达策略，将cns1和nt5e基因共表达（图5A）。nt5e编码5'-核苷酸酶，参与虫草素前体的供给。共表达菌株的虫草素产量进一步攀升至447.9 mg/L，较野生型提高了445.3%（图5B）。这一结果证实，动态调控结合前体供给工程能协同提升虫草素的生物合成效率。
【数据】虫草素产量（CM-A1菌株）：226.5 mg/L；较野生型提高：175.9%；共表达cns1+nt5e后产量：447.9 mg/L；较野生型提高：445.3%；发酵时间：7天；色氨酸浓度：80 µg/mL
讨论与解读
本研究成功在蛹虫草中构建了信息素介导的群体感应系统，并将其应用于虫草素生物合成的动态调控。通过整合诱导型启动子PARO9与信息素响应型启动子PFUS1，在不影响真菌生长的前提下实现了关键信号组分的可控表达。动态调控策略显著改善了代谢流分配，与共表达和前体途径优化相结合后，虫草素产量达到447.9 mg/L。这些结果证明信息素信号可在丝状真菌中功能适配，为次级代谢的高效调控提供了通用生物工具。该策略为药用真菌生物制造提供了实用的调控模块，可进一步适配于规模化发酵的过程优化。
编译者解读
本研究巧妙地将酿酒酵母的α-信息素通讯机制"移植"到丝状药用真菌蛹虫草中，利用跨物种保守的GPCR信号通路构建了可诱导的群体感应回路。方法上的亮点在于仅引入α-信息素和PFUS1启动子两个元件，依赖宿主内源PreB–SteA模块完成信号感知与传导，大幅降低了异源系统的装配复杂度。色氨酸响应型启动子的引入使QS激活时机可通过培养基成分精准控制，为丝状真菌的动态调控提供了新范式。然而，当前系统仍依赖外源诱导剂（色氨酸），尚未实现完全自主的密度依赖调控；且基础泄漏表达的存在提示启动子选择仍有优化空间。未来若能在蛹虫草中筛选出天然密度响应启动子，将有望实现无需诱导剂的自主动态调控。
参考来源
Zhang Q. Pheromone-mediated quorum sensing enables dynamic regulation of cordycepin biosynthesis in Cordyceps militaris. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133915
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133915