来源：Metabolic regulator discovery and application in Escherichia coli for recombinant collagen production based on nontargeted metabolomics（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
重组胶原蛋白在大肠杆菌中的工业化生产长期受限于发酵效率不足。本研究利用非靶向代谢组学系统比较产胶原蛋白菌株与对照菌株的代谢谱差异，锁定24种显著下调的代谢物，从中筛选出7种候选代谢调控因子。实验验证表明，尿嘧啶、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）和琥珀酸盐可显著提升重组胶原蛋白产量，单因子实验最高相对产量达180.3%。5-L生物反应器放大验证进一步确认了这些调控因子的工业应用潜力。
研究背景
重组胶原蛋白凭借高生物相容性、低免疫原性和可调控的理化性质，在生物医药、组织工程和美容护肤等领域展现出广阔前景。其生产依赖基因工程构建的工程菌株（如毕赤酵母、大肠杆菌等），通过发酵过程实现高产量表达。然而，工业生产的瓶颈依然突出：发酵效率不足——表现为产品产量低和副产物积累；结构-功能关系控制困难——如功能结构域暴露不充分。发酵效率受宿主代谢特性、诱导条件和环境参数协同影响。表达宿主与诱导条件的优化属于常规操作，技术成熟度高；但在培养环境中便捷地添加代谢调控因子来提升产物产量则缺乏理论依据，相关研究涉及的调控因子类型高度趋同。
研究方法
2.1 化学试剂
酵母提取物和胰蛋白胨购自OXOID公司。氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司。异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，货号II01302）购自北京索莱宝科技有限公司。以下化合物用作代谢调控因子：尿嘧啶（上海源叶，CAS: 66–22-8）、鸟嘌呤（上海源叶，CAS: 73–40-5）、琥珀酸盐（索莱宝，CAS: 110–15-6）、胆碱（上海源叶，CAS: 123–41-1）、磷脂酰丝氨酸（PS）（Jskchem，CAS: 51446–62-9）、磷脂酰乙醇胺（PE）（Macklin，CAS: 39382–08-6）和磷脂酰胆碱（PC）（D&B，CAS: 8002-43-5）。实际添加量根据试剂纯度计算。
【数据】试剂来源：OXOID、国药、索莱宝、上海源叶、Jskchem、Macklin、D&B；CAS号：66–22-8、73–40-5、110–15-6、123–41-1、51446–62-9、39382–08-6、8002-43-5
2.2 微生物菌株与培养基制备
含有不同黏蛋白型胶原蛋白基因变体（S1506、S1511、S1523和S1552）的质粒由本实验室构建。每个质粒随后在重组大肠杆菌BL21中表达。活化种子液以1.0%接种量接种。3小时后，当培养基OD600值达到0.8时，加入IPTG。发酵过程在100 mL LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、50 μg/mL卡那霉素、0.5 mM IPTG，pH 7.4）中进行振荡培养（220 rpm，16°C，24小时）。
【数据】接种量：1.0%；诱导时机：OD600=0.8；培养基：LB（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）；抗生素：50 μg/mL卡那霉素；IPTG：0.5 mM；pH：7.4；转速：220 rpm；温度：16°C；时间：24h
2.3 非靶向代谢组学
鉴于S15系列蛋白序列高度相似，本研究选择表达产量较低的S1552蛋白进行代谢组分析。研究低产量变体有助于检测重组蛋白表达、折叠或功能异常所引发的宿主特异性代谢扰动，从而帮助识别关键通路。微生物细胞密度通过平板计数法测定。含约1 × 10⁷个细菌细胞的培养基在4°C条件下离心（1000 × g，10分钟）。所得细胞沉淀立即浸入液氮中淬灭30秒。随后，样品用预冷PBS缓冲液（4°C）洗涤以去除残留培养基，再次离心（1000 × g，4°C，10分钟）去除PBS。最后，样品储存于−80°C。使用含氘代内标的提取液（甲醇：乙腈：水 = 2:2:1（v/v/v））从样品中提取代谢物。极性代谢物分析采用UHPLC系统（Vanquish，Thermo Fisher Scientific）偶联Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）和Orbitrap Exploris 120质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行LC-MS/MS分析。数据由北京擎科生物科技有限公司分析。
【数据】细胞数量：约1×10⁷；离心条件：4°C、1000×g、10min；液氮淬灭：30s；储存温度：−80°C；提取液配比：甲醇:乙腈:水=2:2:1；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1mm×50mm，1.7μm）
2.4 基于非靶向代谢组学的差异代谢物培养基优化
基于非靶向代谢组学分析，重点关注与对照组相比水平降低的典型差异代谢物。基于成本考量（表1），选择7种化合物作为潜在代谢调控因子。浓度梯度设置如下：尿嘧啶（10、50、100、500、1000 μM）、鸟嘌呤（10、50、100、500、1000 μM）、琥珀酸盐（0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 g/L）、胆碱（0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 g/L）、PS（0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 g/L）、PE（0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 g/L）和PC（0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 g/L）。
【数据】尿嘧啶梯度：10–1000 μM；鸟嘌呤梯度：10–1000 μM；琥珀酸盐梯度：0.01–1.0 g/L；胆碱梯度：0.05–1.0 g/L；PS梯度：0.01–0.5 g/L；PE梯度：0.01–0.5 g/L；PC梯度：0.01–0.5 g/L
2.5 生长曲线测定
重组S1552菌株在LB中于37°C、220 rpm条件下活化12小时（1% v/v）。随后将培养物划线于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB琼脂平板上，37°C倒置培养20小时直至形成单菌落。挑取分离良好的单菌落接种于50 mL烧瓶中的30 mL LB中，37°C、220 rpm培养12小时制备种子培养物。种子培养物以1%（v/v）接种量接种新鲜LB，在相同条件下培养。种子培养基在LB中37°C培养至OD600达到0.8，随后加入IPTG和代谢调控因子，在16°C下培养24小时。代谢调控因子如下：100 μM尿嘧啶、0.05 g/L PE、0.1 g/L PC或0.1 g/L琥珀酸盐。细菌生长曲线通过每2小时收集菌液测定OD600获得。
【数据】活化条件：37°C、220rpm、12h；平板培养：37°C、20h；种子培养：37°C、220rpm、12h；接种量：1%（v/v）；诱导OD600：0.8；诱导温度：16°C；诱导时间：24h；调控因子浓度：尿嘧啶100μM、PE 0.05g/L、PC 0.1g/L、琥珀酸盐0.1g/L；取样间隔：2h
2.6 荧光染料检测
离心收集的细菌用冷PBS洗涤并重悬于20 mL PBS缓冲液中。随后，经琥珀酸盐或尿嘧啶处理的细菌细胞（S1552）用荧光素二乙酸酯（FDA；HY-D0719）染色，而经PC或PE处理的细胞用DiI（HY-D0083，MedChemExpress，美国）染色。每种染料的染色浓度为20 μM。染色样品使用BD Accuri C6流式细胞仪（Becton，美国）分析。
【数据】重悬体积：20mL PBS；染料：FDA（HY-D0719）、DiI（HY-D0083）；染色浓度：20μM；仪器：BD Accuri C6流式细胞仪
2.7 多种代谢调控因子的组合
根据各代谢调控因子浓度与重组胶原蛋白产量的关系，选择具有显著增产效果的代谢调控因子，设计多种代谢调控因子的组合方案，详见表2。
【数据】组合方案：见表2（原文未详述具体组合）
2.8 纯化与蛋白测定
收集100 mL重组菌培养物，超声破碎（400 W）后过滤。将pH调至4.0并孵育2小时后，收集上清液。使用Ni-IDA磁珠（南京玉珠龙生物）从上清液中纯化S15系列胶原蛋白。蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒（PC0020，索莱宝）测定。分离的蛋白通过4–12% FastPAGE™预制胶（TSP024，擎科）进行SDS-PAGE分析，分子量使用PageRuler预染蛋白Ladder（26616，Thermo）估算。
【数据】培养体积：100mL；超声功率：400W；pH：4.0；孵育时间：2h；纯化介质：Ni-IDA磁珠；定量试剂盒：BCA（PC0020）；凝胶：4–12% FastPAGE™预制胶
2.9 5-L生物反应器放大培养
培养体积进一步放大至5 L以满足工业化需求。种子培养基为标准LB配方。发酵培养基（g/L）：20 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、13.5 g/L KH₂PO₄、1 g/L MgSO₄、8 g/L甘油；补料培养基（g/L）：80 g/L酵母提取物、40 g/L胰蛋白胨、13.5 g/L KH₂PO₄、4 g/L MgSO₄、400 g/L甘油。培养基均在115°C灭菌30分钟。生物反应器初始装入2.7 L发酵培养基，维持37°C，用氨水调节培养pH至5.0。对数生长期的二级种子培养物以10%（v/v）接种量接种至5-L生物反应器，补加100 μg/mL卡那霉素和12 mL微量元素。初始发酵阶段，当溶解氧因营养耗竭而升高时启动连续补料以维持生物量增长。在对数生长期通过降温至25°C并添加0.5 mM IPTG诱导蛋白表达。搅拌速度和通气速率经优化以维持溶解氧在20%–30%之间。发酵结束后，目标蛋白经Ni-IDA磁珠纯化并用BCA定量试剂盒定量。
【数据】发酵体积：5L；发酵培养基：20g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、13.5g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄、8g/L甘油；补料培养基：80g/L酵母提取物、40g/L胰蛋白胨、13.5g/L KH₂PO₄、4g/L MgSO₄、400g/L甘油；灭菌条件：115°C、30min；初始装液：2.7L；温度：37°C；pH：5.0（氨水调节）；接种量：10%（v/v）；卡那霉素：100μg/mL；微量元素：12mL；诱导温度：25°C；IPTG：0.5mM；溶解氧：20%–30%
2.10 统计分析
使用GraphPad Prism软件分析数据。所有数据均为三次重复的均值。采用单因素方差分析（ANOVA）评估多组间差异的显著性。p < 0.05被认为具有统计学意义。多重事后比较采用Tukey's HSD检验以确定差异的具体来源。最终数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。
【数据】统计方法：单因素ANOVA + Tukey's HSD；显著性阈值：p<0.05；数据呈现：mean±SD，三次重复
研究结果
3.1 重组胶原蛋白的发酵
在我们此前的研究中，当发酵时间为12小时时，重组大肠杆菌中S1506、S1511、S1523和S1552的产量分别为0.22 ± 0.05 g/L、0.18 ± 0.08 g/L、0.15 ± 0.11 g/L和0.08 ± 0.02 g/L。为更好地凸显调控因素的影响，发酵时间延长至24小时，重组大肠杆菌中S1506、S1511、S1523和S1552的产量分别测定为0.52 ± 0.05 g/L、0.39 ± 0.05 g/L、0.34 ± 0.06 g/L和0.21 ± 0.03 g/L（图2）。
【数据】12h产量：S1506为0.22±0.05g/L、S1511为0.18±0.08g/L、S1523为0.15±0.11g/L、S1552为0.08±0.02g/L；24h产量：S1506为0.52±0.05g/L、S1511为0.39±0.05g/L、S1523为0.34±0.06g/L、S1552为0.21±0.03g/L
3.2 非靶向代谢组学分析
由于S1506、S1511、S1523和S1552的胶原蛋白重复片段序列完全一致，选择产生较低水平S1552的重组大肠杆菌菌株进行代谢组学分析，而仅含原始质粒pET-28a(+)的大肠杆菌菌株作为对照组。采用LC-MS进行非靶向代谢物检测。共检测到25,233种代谢物，其中447种通过数据库匹配鉴定，占总数的1.8%（图3A）。主成分分析（PCA）显示，前三个主成分（PC1：36.8%，PC2：22.1%，PC3：14.9%）合计占总方差的73.8%，有效区分两组样本，样品按组明显聚类（图3B）。以VIP（变量投影重要性）> 1和p < 0.05为标准，S1552菌株与对照菌株之间鉴定出51种差异代谢物（图3C）。其中，S1552菌株有27种代谢物水平高于对照菌株，24种代谢物水平低于对照菌株。根据下调代谢物，优先选择7种潜在靶标化合物——尿嘧啶、鸟嘌呤、琥珀酸盐、胆碱、PE、PS和PC进行进一步分析（图4和图5）。
重组胶原蛋白生物合成过程中某些代谢物水平的下降，本质上反映了合成、消耗、转化和调控等多过程之间动态平衡的净结果。这种下降也可能源于多种因素，如代谢通量向竞争途径的重新分配、能量状态改变引发的代谢重编程，或细胞反馈抑制机制。这些代谢物代表了优化大肠杆菌重组胶原蛋白生产的潜在代谢调控因子。两组样品间差异代谢物的KEGG通路分析显示，核苷酸代谢、嘌呤代谢、氧化磷酸化、ABC转运蛋白、柠檬酸循环（TCA循环）、泛酸和辅酶A生物合成以及代谢通路等显著富集（图3D和E）。
这7种化合物在细菌细胞的生理活性中表现出显著差异。尿嘧啶在微生物系统中具有多种功能，包括促进生长、增强生物合成和调节毒力。作为代谢前体，它使农杆菌属的生物量显著增加3.0倍，并提高猴头菇的菌丝产量。在农杆菌中，尿嘧啶作为UTP的前体，提升UDP-葡萄糖水平并上调关键酶的表达。此外，尿嘧啶代谢作为铜绿假单胞菌群体感应的核心调控因子，影响其所有三种已知信号通路，并调节与毒力相关的表型，如生物膜形成和绿脓菌素产生。琥珀酸盐是三羧酸（TCA）循环中间体，主要作为关键代谢调控因子，有效促进特定微生物产物的合成。在以甘油生产1,3-丙二醇（1,3-PDO）的工程大肠杆菌中，添加10 mM琥珀酸盐使1,3-PDO滴度从7.2 g/L提高至9.9 g/L，同时使NADH/NAD⁺比率提高43%。此外，在重组氨基乙酰丙酸合酶的发酵优化中，初始琥珀酸盐浓度被确定为影响酶活性的关键因素。鸟嘌呤是DNA/RNA的嘌呤组分，氧化后生成8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG），触发DNA修复机制。在细菌细胞膜的组成和功能中，PE是大肠杆菌内膜的主要成分。它不仅维持膜结构稳定性，还因其形成非层状结构的倾向，促进SecA等膜蛋白的高效结合。此外，PE在脂蛋白成熟过程中充当关键的酰基供体。PS是PE的直接生物合成前体。相比之下，PC是典型的真核膜脂，并非大肠杆菌的天然组分。然而，通过基因工程引入外源生物合成途径可以生产PC。在此过程中，胆碱作为关键底物，通过PC合酶途径与CDP-二酰甘油结合生成PC。工程化PC显著改变细菌膜特性，例如增强对宿主抗菌肽的抵抗力，可能有助于免疫逃逸，同时也作为膜蛋白研究中生物技术领域的重要工具。这些化合物通过代谢网络相互关联：胆碱代谢整合PC/PE合成，琥珀酸盐通过乙酰辅酶A促进TCA循环活性，PS/PC相互转化协调膜动力学。它们的作用涵盖核酸稳定性、能量代谢、膜功能和信号转导，共同凸显其作为多靶点干预点的潜力。
【数据】检测代谢物总数：25,233；鉴定代谢物数：447（占1.8%）；PC1：36.8%、PC2：22.1%、PC3：14.9%（合计73.8%）；差异代谢物：51种（27种上调、24种下调）；尿嘧啶使农杆菌生物量增加3.0倍；10mM琥珀酸盐使1,3-PDO滴度从7.2g/L提高至9.9g/L、NADH/NAD⁺比率提高43%
3.3 差异代谢物对发酵的影响
基于S1552的代谢组学分析，鉴定出7种具有潜在调控功能的化合物，并设置了五个浓度梯度。特别值得注意的是，PS、PE和PC的分子结构可产生几乎无限的变体。这种多样性源于sn-1和sn-2位脂肪酸链的多种可能组合，这些脂肪酸链在碳链长度和不饱和度上各不相同（图5）。从实际角度出发，本研究聚焦于市场上常见且来源可靠的结构形式。
S1506、S1511、S1523和S1552是蛋白序列高度相似的胶原蛋白。添加外源代谢调控因子后，这四种胶原蛋白表现出高度一致的剂量依赖性调控模式。向培养基中添加特定代谢调控因子对胶原蛋白合成表现出显著的浓度依赖性调控效应（图6）。
实验数据显示，在尿嘧啶（10–1000 μM）、PE（0.01–0.5 g/L）和PC（0.01–0.5 g/L）的梯度浓度干预下，胶原蛋白产量呈现典型的钟形曲线变化。100 μM尿嘧啶 supplementation诱导最大胶原蛋白合成效率，相对产量水平为180.3 ± 3.9%（S1506）、164.6 ± 17.3%（S1511）、157.5 ± 17.7%（S1523）和143.4 ± 14.7%（S1552）。PE在0.05 g/L时达到峰值胶原蛋白产量，相对产量为167.3 ± 8.0%（S1506）、154.3 ± 11.1%（S1511）、163.3 ± 11.2%（S1523）和147.0 ± 12.6%（S1552）。PC在0.1 g/L时达到最大效果，相对产量为153.0 ± 8.5%（S1506）、141.7 ± 9.7%（S1511）、151.7 ± 6.5%（S1523）和141.4 ± 10.1%（S1552）。尿嘧啶被广泛用于提高农杆菌属中葡聚糖或出芽短梗霉中普鲁兰多糖的产量，因为它显著影响糖酵解和丙酮酸代谢。这是首次发现尿嘧啶对重组蛋白具有显著促进作用。PC和PE对重组胶原蛋白的促进作用此前亦未见报道。
【数据】尿嘧啶最佳浓度：100μM（相对产量：S1506为180.3±3.9%、S1511为164.6±17.3%、S1523为157.5±17.7%、S1552为143.4±14.7%）；PE最佳浓度：0.05g/L（相对产量：S1506为167.3±8.0%、S1511为154.3±11.1%、S1523为163.3±11.2%、S1552为147.0±12.6%）；PC最佳浓度：0.1g/L（相对产量：S1506为153.0±8.5%、S1511为141.7±9.7%、S1523为151.7±6.5%、S1552为141.4±10.1%）
讨论与解读
通过系统比较产胶原蛋白大肠杆菌菌株与非产胶原蛋白对照菌株的代谢组学图谱，本研究将显著下调的代谢物鉴定为潜在代谢调控因子。LC-MS非靶向代谢组学揭示胶原蛋白表达菌株中有24种代谢物显著下调，涉及核苷酸代谢、嘌呤代谢、氧化磷酸化和柠檬酸循环（TCA循环）等生物学过程。7种经济高效的化合物被选入浓度梯度实验。尿嘧啶、琥珀酸盐、PE和PC对S15系列重组胶原蛋白合成表现出积极作用，实现了显著的产量提升。然而，采用单因子实验各自最优浓度构建的组合添加系统未能产生协同效应，反而相比单药方案表现出明显的抑制响应，这可能是由于共享代谢节点或细胞资源的竞争所致。尿嘧啶、琥珀酸、PE和PC作为工业代谢调控因子的潜力通过5-L生物反应器中的连续补料分批发酵得到验证，且正效应在生物反应器系统中更为显著。
编译者解读：该研究展示了代谢组学驱动策略在工业发酵优化中的实用价值——从"盲试"转向"数据指引"的调控因子筛选范式。选择低产量变体S1552作为分析对象是巧妙的设计，放大了代谢扰动的可检测性。但组合调控的拮抗效应提醒我们，代谢网络的多节点干预并非简单叠加，需要更精细的剂量配比与动态调控策略。从合成生物学角度看，将代谢调控因子的发现与工程菌株改造相结合，或可进一步提升重组胶原蛋白的生产经济性。
参考来源
Zhao Z. Metabolic regulator discovery and application in Escherichia coli for recombinant collagen production based on nontargeted metabolomics[J]. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.176959
DOI: 10.1016/j.cej.2026.176959