来源：Breaking the bottleneck of the α-ketopimelate pathway to boost adipic acid synthesis in Escherichia coli via metabolic and enzymatic engineering（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
己二酸是生物可降解塑料的核心单体，全球年产量超300万吨，但传统石化路线排放大量强温室气体N₂O。本研究在大肠杆菌中重构α-酮庚二酸（AKP）生物合成途径，通过启动子适配筛选、副产物乙酸调控、限速酶高柠檬酸合酶的理性设计与分子动力学改造，将摇瓶产量提升至0.79 g/L，5 L发酵罐补料分批发酵达3.89 g/L。研究还借助酶动力学与分子模拟揭示了突变体Nivf(G345S)催化活性提升的分子机制。
研究背景
己二酸是六碳二元羧酸中生产规模最大、贸易额最高的平台化合物之一，广泛应用于食品、医药、聚酯及化工领域，尤其在聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）、聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA）等可降解塑料的合成中不可或缺。目前全球己二酸年产量已超过300万吨，并以年均3%–5%的速度持续增长，预计2030年市场规模将达182亿美元。现行生产主要依赖石油基路线——KA油（环己醇与环己酮混合物）的硝酸催化氧化，该工艺能耗高且排放大量温室气体N₂O，其增温潜势约为二氧化碳的300倍。因此，利用可再生原料通过生物转化合成己二酸成为替代化学合成法的研究热点。AKP途径作为一条可行的生物合成路线，其限速酶高柠檬酸合酶的催化活性不足是制约产量的核心瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与培养基
大肠杆菌DH5α用于质粒构建与扩增，大肠杆菌MG1655(DE3)作为己二酸合成途径表达底盘菌株。本研究所用菌株列于补充材料表S1。种子培养采用Luria-Bertani（LB）培养基，含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L氯化钠。己二酸合成发酵培养基为优化M9培养基，含葡萄糖20 g/L、酵母提取物5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、Na₂HPO₄ 6 g/L、NH₄Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L，微量元素包括1 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂和1.0 mg/L维生素B1。
【数据】菌株：E. coli DH5α、E. coli MG1655(DE3)；培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、优化M9（葡萄糖20 g/L、酵母提取物5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、Na₂HPO₄ 6 g/L、NH₄Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、1 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂、1.0 mg/L维生素B1）
2.2 质粒构建
所用质粒与引物列于补充材料表S2和表S3。所有限制性内切酶购自NEB，PCR回收试剂盒、质粒微量扩增试剂盒和胶回收试剂盒购自OMEGA。来源于Methanococcus jannaschii的AKSA、AKSA-1392、AKSA-1564基因，来源于Azotobacter vinelandii的Nivf基因，以及来源于Lactococcus lactis的Kivd基因，经密码子优化后由Genewiz合成。HCS与HICDH从Saccharomyces cerevisiae基因组扩增获得，Ynel从E. coli MG1655(DE3)基因组扩增获得。以pZE质粒为第一载体骨架，将HCS、HCIDH和HA基因插入XbaI和NotI位点，依次组装形成载体pZE-HCS-HA-HICDH。同理，以pCS质粒为第二载体骨架，将Kivd和Ynel基因插入KpnI和HindIII位点，依次组装形成载体pCS-Kivd-Ynel。两个组装质粒经酶切验证后转化入宿主菌E. coli MG1655(DE3)用于己二酸合成。此外，携带强表达T7启动子的pET30和pACYCduet质粒被用于替换pZE和pCS以控制上述基因的表达，从而应用启动子适配筛选策略促进己二酸合成。
【数据】载体：pZE（XbaI/NotI位点）、pCS（KpnI/HindIII位点）、pET30、pACYCduet；基因来源：M. jannaschii（AKSA、AKSA-1392、AKSA-1564）、A. vinelandii（Nivf）、L. lactis（Kivd）、S. cerevisiae（HCS、HICDH）、E. coli MG1655(DE3)（Ynel）
2.3 菌株培养
工程菌接种于4 mL含0.1%（v/v）抗生素（100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素、30 μg/mL氯霉素）的LB培养基中，于37°C、200 rpm旋转摇床过夜培养完成种子培养。随后，将1 mL种子液接种于含250 mL锥形瓶的50 mL优化M9培养基中，添加与上述相同浓度的抗生素，于37°C、200 rpm条件下培养。以600 nm波长吸光度（OD600）表征细胞增殖。当OD600达到1.0时，加入0.25 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导基因表达，继续在30°C、180 rpm条件下培养72 h完成发酵。5 L生物反应器（上海百仑生物科技有限公司）装液3 L优化M9培养基进行补料分批发酵。过程分两阶段：第一阶段，2%（v/v）种子液接种至含0.1%（v/v）抗生素的发酵培养基中，于37°C、200 rpm、3.0 vvm条件下培养3 h，OD600约为1.0；第二阶段，加入0.25 mM IPTG，培养条件改为30°C、200 rpm、1.5 vvm以实现己二酸生产。培养24 h后向发酵罐补加20 g/L葡萄糖，持续监测己二酸积累及细胞生长，直至72 h发酵结束。
【数据】种子培养：4 mL LB、37°C、200 rpm、过夜；发酵培养：50 mL M9（250 mL摇瓶）、37°C、200 rpm、OD600≈1.0时加0.25 mM IPTG、30°C、180 rpm、72 h；5 L反应器：3 L M9、2%接种量、第一阶段37°C/200 rpm/3.0 vvm/3 h、第二阶段30°C/200 rpm/1.5 vvm、24 h补加20 g/L葡萄糖、72 h结束；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素、30 μg/mL氯霉素
2.4 蛋白纯化与体外酶活测定
对突变体与野生型Nivf进行酶动力学分析，实施蛋白纯化与体外酶活测定。突变体与野生型Nivf分别组装至pET30载体并转化E. coli MG1655(DE3)，接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB试管中，于37°C、200 rpm旋转摇床培养。过夜培养物转接至50 mL LB培养基，当OD600达到0.6–0.8时加入0.1 mM IPTG诱导，随后于18°C旋转摇床继续培养12 h。细胞培养物经离心收集，重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），以超声波细胞破碎仪处理。粗酶液经4°C、8000 rpm离心5 min获得，随后经镍柱亲和层析和超滤获得纯化蛋白。目标蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证，浓度以Bradford法测定。突变体与野生型Nivf的活性采用2,6-二氯酚靛酚（DCIP）光度法测定。测定体系含50 mM HEPES（pH 7.5）、0.1 mM DCIP、0.25 mM AcCoA、100 mM α-酮戊二酸和100 mM α-酮戊二酸，总体积1 mL，于30°C预平衡5 min，使DCIP与商业AcCoA中的游离CoA充分反应以消除游离CoA对后续测定的干扰。加入0.05 mg纯化酶启动反应，分析OD600变化计算DCIP还原量。动力学参数（kcat和Km）通过将初速度数据拟合至Michaelis-Menten方程确定。
【数据】诱导条件：0.1 mM IPTG、OD600 0.6–0.8、18°C、12 h；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）；离心：8000 rpm、5 min、4°C；酶活测定体系：50 mM HEPES（pH 7.5）、0.1 mM DCIP、0.25 mM AcCoA、100 mM α-酮戊二酸、100 mM α-酮戊二酸、总体积1 mL、30°C预平衡5 min、0.05 mg纯化酶
2.5 分子对接与分子动力学分析
使用AlphaFold2预测Nivf的三维结构，并使用PyMOL（版本3.1.5.1）与Saccharomyces cerevisiae的高柠檬酸合酶（HCS）进行结构比对，以鉴定保守催化区和调控区。使用YASARA（版本21.12.19）将α-酮戊二酸和α-酮己二酸对接至Nivf中，以确定关键残基。同时，使用共识预测器PredictSNP1预筛选Nivf变体。使用CAVER Analyst 2.0软件进行隧道分析，使用Pymol 2.4.1版进行系统分析和可视化。结合自由能通过gmx_mmpbsa计算，公式如下：ΔG_bind = ΔG_complex − ΔG_receptor − ΔG_ligand，其中G_receptor和G_ligand分别表示溶剂中孤立受体和配体的自由能，G_complex表示受体-配体复合物的总自由能。
【数据】软件：AlphaFold2、PyMOL 3.1.5.1、YASARA 21.12.19、PredictSNP1、CAVER Analyst 2.0、Pymol 2.4.1；结合自由能公式：ΔG_bind = ΔG_complex − ΔG_receptor − ΔG_ligand
2.6 分析方法
细胞增殖通过紫外-可见分光光度计测定光密度（OD600）评估。发酵液于12,000 rpm离心10 min，取上清液进行代谢物分析。配备紫外检测器的HPLC（Shimadzu）在210 nm波长下鉴定产物己二酸和副产物乙酸。同时，配备示差折光检测器（设定50°C）的HPLC用于检测葡萄糖消耗。分析采用Bio-Rad Aminex HPX-87H离子交换柱，以5 mM H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL/min，柱温55°C。所有数据至少来自三次独立实验进行统计分析，显著性使用GraphPad PRISM软件确定。
【数据】HPLC条件：UV检测器210 nm、示差折光检测器50°C、Bio-Rad Aminex HPX-87H柱、5 mM H₂SO₄、流速0.6 mL/min、柱温55°C；离心：12,000 rpm、10 min；独立实验次数：≥3
研究结果
3.1 AKP途径的外源引入与优化实现己二酸合成
已有报道显示AKP途径已被工程化用于合成高值二元羧酸及其衍生物。本研究将其用于己二酸生产。将来源于S. cerevisiae的异源酶高柠檬酸合酶（HCS）、顺式高乌头酸酶（HA）和高异柠檬酸脱氢酶（HICDH），以及来源于L. lactis的α-酮酸脱羧酶（KivD）引入E. coli MG1655(DE3)。同时过表达内源半醛脱氢酶（Ynel），获得含异源AKP途径的工程菌AA-1，在M9培养基中培养72 h后产生10 mg/L己二酸。这表明AKP途径成功引入，但己二酸产量较低，可能归因于外源基因表达水平低和酶活性低。
质粒拷贝数和启动子是影响基因表达水平的关键因素。pZE和pCS质粒采用lac启动子，通常被认为是中等强度启动子。同时，pZE质粒基于高拷贝PUC载体骨架改造，而pCS质粒采用低拷贝pSC101载体。推测中等强度启动子和低拷贝质粒可能导致关键酶表达不足。pET30和pACYCduet质粒含T7启动子，具有极高的转录效率，有利于强表达。pET30含pBR322复制起点，属中等拷贝质粒；pACYCduet含p15A复制起点，同样为中等拷贝质粒。因此，采用pET30和pACYCduet替换pZE和pCS，考察对己二酸合成的影响。将不同质粒组合转入E. coli MG1655(DE3)，测定上述酶的表达水平和己二酸产量。结果表明，T7启动子刺激下所有基因均呈现更高表达水平（图S1）。携带pET30-HCS-HA-HICDH和pACYCduet-KivD-Ynel的工程菌AA-4表现出最佳的己二酸生产效率，产量提高至32.2 mg/L（图1B）。
虽然通过T7启动子增强表达水平后己二酸合成有所改善，但产量仍然较低。因此，对工程菌AA-4的发酵曲线进行了详细分析（图1C）。观察到IPTG诱导后细胞早期生长迅速，培养72 h后OD600达到12.4。除积累32.4 mg/L己二酸外，令人意外地发现副产物乙酸高达10 g/L。乙酸是大肠杆菌培养中常见的副产物。Pta-AckA途径是乙酸合成的主要代谢途径，其中乙酰辅酶A通过磷酸转乙酰酶（pta）转化为乙酰磷酸，随后由乙酸激酶（acka）转化为乙酸。Liu等人报道，大肠杆菌中敲除AckA使乙酸积累减少约66%，目标产物乙醇酸产量提高1.5倍。因此，本研究采用相同策略，利用CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中敲除AckA，构建新型底盘菌株AA-5。随后将上述关键酶引入新型底盘获得AA-6，考察对己二酸合成的影响（图1D）。结果表明，AckA敲除不影响细胞生长，乙酸积累降至约1–2 g/L。同时，己二酸产量升至约52.8 mg/L，较AA-4菌株提高1.6倍（图1D）。这表明下调乙酸合成将碳通量转向AKP途径，从而增加己二酸合成。
【数据】AA-1产量：10 mg/L（72 h、M9培养基）；AA-4产量：32.2 mg/L；AA-4 OD600：12.4（72 h）；AA-4乙酸：10 g/L；AA-5乙酸：1–2 g/L；AA-6产量：52.8 mg/L（较AA-4提高1.6倍）；AckA敲除效果：乙酸减少约66%、乙醇酸产量提高1.5倍（文献数据）
3.2 AKP途径关键酶的理性设计与改造加速己二酸合成
#### 3.2.1 Kivd酶改造提高底物特异性
Kivd是一种可催化不同链长α-酮酸的α-酮酸脱羧酶。其广泛的底物识别使其可参与多种代谢途径，但较差的底物特异性严重限制了目标产物的合成效率。目前已有研究报道对Kivd进行工程化改造以提高其底物特异性。F381和V461位点参与辅酶硫胺素焦磷酸（ThDP）的结合，并构成Kivd的α-酮酸底物结合口袋。Wang等人对Kivd进行饱和突变以提高6-氨基己酸的合成效率，发现突变体Kivd（F381Y，V461I）对α-酮-7-氨基庚酸的特异性提高，使6-氨基己酸产量从24 mg/L提高至170 mg/L。据此，本研究采用已报道的Kivd（F381Y）和Kivd（F381Y，V461I）变体，评估其与工程化AKP途径的兼容性，将其引入AA-6菌株替换pACYCduet质粒中的野生型Kivd，获得工程菌AA-7和AA-8。结果显示，AA-7的己二酸产量达到131 mg/L。相比之下，工程菌AA-8进一步提高至148 mg/L，约为工程菌AA-6的2.84倍（图1E）。这些结果表明，突变体Kivd（F381Y，V461I）确实显著提高了对α-酮庚二酸的特异性和催化效率，从而促进己二酸合成。
【数据】Kivd（F381Y）AA-7产量：131 mg/L；Kivd（F381Y，V461I）AA-8产量：148 mg/L（为AA-6的2.84倍）；文献数据：6-氨基己酸从24 mg/L提高至170 mg/L
#### 3.2.2 限速酶高柠檬酸合酶的理性设计提高催化活性
AKP途径源自赖氨酸生物合成途径，其中高柠檬酸合酶已被证明是该途径的限速酶。因此，它被认为是影响己二酸合成的重要因素。据报道，来源于Methanococcus jannaschii的高柠檬酸合酶AKSA、AKSA-1392和AKSA-1564，以及来源于Azotobacter vinelandii的Nivf具有较高的催化性能。因此，将这些酶引入AA-8菌株替换pET30质粒中的HCS，获得工程菌AA-9、AA-10、AA-11和AA-12，考察其对己二酸合成的影响（图1F）。结果表明，Nivf相比HCS表现出更优性能，获得最高己二酸产量165 mg/L。根据以往报道，赖氨酸和α-酮酸竞争性抑制高柠檬酸合酶活性。提高α-酮酸与高柠檬酸合酶之间的相对亲和力可降低其对赖氨酸的敏感性。Kang等人采用理性设计策略改造了来源于S. cerevisiae的高柠檬酸合酶（HCS），获得的突变体HCS（A367S）显著提高了产物L-哌啶酸的产量。本研究采用相同方法改造野生型Nivf。
首先，利用AlphaFold2预测Nivf的三维结构，并通过PyMOL与来源于S. cerevisiae的HCS进行结构比对（图2A、2B），以鉴定可能影响催化活性的关键残基。通过分子动力学模拟和底物对接分析，预测了七个可能影响Nivf催化活性的突变位点（图2C）。随后构建了七个Nivf突变体并进行了活性筛选。其中，突变体Nivf（G345S）表现出最高的催化活性提升。结构分析显示，G345S突变位于底物结合口袋附近，该突变可能通过增强底物亲和力提高催化效率（图2D）。进一步通过分子动力学模拟比较了野生型Nivf与突变体Nivf（G345S）的三维结构动态变化（图3）。
图3A显示，野生型Nivf与突变体Nivf（G345S）的RMSD分析表明，突变体在模拟过程中表现出更稳定的构象。图3B的RMSF分析显示，突变体在关键活性位点区域的残基波动幅度较小，表明结构刚性增强。图3C和3D比较了野生型与突变体在氢键数方面的波动幅度，突变体表现出更多的氢键相互作用，有助于稳定底物结合构象。
【数据】Nivf最优产量：165 mg/L；突变位点数：7个；最优突变体：Nivf（G345S）；RMSD/RMSF分析：突变体构象更稳定、活性位点波动更小、氢键数更多
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略在大肠杆菌中实现了己二酸的高效生物合成。首先，通过启动子适配筛选（以T7启动子替换lac启动子）将己二酸产量从10 mg/L提升至32.2 mg/L；其次，敲除乙酸合成关键基因AckA将碳通量导向目标途径，产量进一步提升至52.8 mg/L；随后，引入底物特异性提高的Kivd突变体（F381Y，V461I）使产量达到148 mg/L；最后，通过计算机辅助理性设计获得限速酶Nivf的G345S突变体，将摇瓶产量推高至0.79 g/L。5 L发酵罐补料分批发酵最终实现3.89 g/L的己二酸产量。酶动力学与分子模拟分析表明，Nivf（G345S）在蛋白结构稳定性、氢键数量及酶-底物结合效率方面均具有显著优势。该研究克服了AKP途径的限速瓶颈，为包括己二酸在内的高值二元羧酸的微生物合成提供了平台。
编译者解读：本研究的技术路线呈现清晰的"阶梯式"优化逻辑——从表达强度、副产物分流、底物特异性到限速酶催化效率逐层递进，每一步均有可量化的产量提升数据支撑，这种系统化思维值得合成生物学研究借鉴。尤其值得关注的是，计算机辅助设计与分子动力学模拟的深度介入，使酶工程改造不再是随机突变筛选，而是基于结构信息的精准设计。G345S突变对蛋白稳定性和氢键网络的改善机制具有普适参考价值。不足之处在于，3.89 g/L的产量距离工业化要求仍有差距，且发酵过程中乙酸副产物的完全消除尚未实现。未来若能将AKP途径与更高效的碳通量分配策略结合，有望进一步突破产量天花板。
参考来源
Ning Y. Breaking the bottleneck of the α-ketopimelate pathway to boost adipic acid synthesis in Escherichia coli via metabolic and enzymatic engineering. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.133942
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.133942