来源：Efficient biosynthesis of serotonin and melatonin through combinatorial metabolic engineering in Escherichia coli（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
血清素和褪黑素是两种源自色氨酸的神经调节分子，在食品工业中具有广阔应用前景，但其微生物合成长期受制于低效率、依赖动物源辅因子及产物胞内毒性等问题。本研究在大肠杆菌中开创性地构建了一条不依赖四氢生物蝶呤（BH4）的新型褪黑素生物合成途径，通过酶工程改造限速酶色氨酸羟化酶（Tph）、系统优化代谢网络及转运工程，最终在5-L生物反应器中实现血清素1.92 g/L和褪黑素3.40 g/L的产量——这是迄今报道的大肠杆菌褪黑素最高产量。
研究背景
血清素（5-羟色胺）和褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是重要的吲哚胺分子，在人类情绪调节、睡眠-觉醒周期和神经内分泌活动中发挥关键调控作用。这些化合物在神经系统疾病治疗、植物育种和免疫调节领域的应用日益广泛，推动了全球市场的快速扩张。褪黑素可从多种动物、植物和微生物中分离获得，其生物合成以色氨酸为底物、血清素为关键中间体，经由四条潜在途径完成。合成起始于色氨酸羟化酶（Tph）催化的羟基化反应生成5-羟基色氨酸（5-HTP），随后由色氨酸脱羧酶（Tdc）催化脱羧生成血清素。然而，传统微生物合成路线依赖BH4辅因子，该辅因子在大肠杆菌中无法内源合成，严重制约了合成效率。本研究旨在通过组合代谢工程策略，在大肠杆菌中构建不依赖BH4的血清素和褪黑素合成途径。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所构建的菌株详见表S1。大肠杆菌DH5α用作DNA克隆宿主；重组蛋白表达和代谢工程应用采用大肠杆菌BL21(DE3)和C41(DE3)作为表达宿主。所有工程菌株均源自大肠杆菌BL21(DE3)和C41(DE3)，通过迭代遗传修饰获得。
常规克隆和种子液制备使用Luria–Bertani（LB）培养基，含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L氯化钠，pH调至6.5。摇瓶发酵采用Terrific Broth（TB）培养基，每升含：12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、4 mL/L甘油、2.31 g/L KH₂PO₄和12.54 g/L K₂HPO₄，pH调至6.5。根据需要添加抗生素，浓度分别为：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、链霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL。
补料分批发酵采用改良R（MR）培养基，含葡萄糖20 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.8 g/L、酵母提取物5 g/L，另含6.67 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、0.8 g柠檬酸和5 mL/L痕量金属溶液，pH调至6.5。痕量金属溶液含1.35 g/L CaCl₂、2.2 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.58 g/L MnSO₄·4H₂O、1 g/L CuSO₄·5H₂O、0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.2 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O、10 mL/L 35% HCl和4 g/L FeSO₄·7H₂O。
TB培养基优化中，系统评估了关键参数的影响，包括诱导时间（12、14、16、18、20、22、24和26 h）、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L）、色氨酸浓度（0、1.25、2.5、3.75和5 mmol/L）和发酵温度（25、30和37°C）。优化后的TB培养基组成为：2.5 mmol/L色氨酸、0.8 mmol/L IPTG、1 mmol/L 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、0.8 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）、1 mmol/L Fe(NH₄)₂·(SO₄)₂·7H₂O和0.8 mmol/L抗坏血酸。
色氨酸和5-羟色胺购自上海麦克林，5-羟基色氨酸和褪黑素购自上海源叶生物科技，5-氨基乙酰丙酸购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，pH 6.5；TB培养基：12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、4 mL/L甘油、2.31 g/L KH₂PO₄、12.54 g/L K₂HPO₄，pH 6.5；MR培养基：20 g/L葡萄糖、0.8 g/L MgSO₄·7H₂O、5 g/L酵母提取物，pH 6.5；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、链霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL；IPTG浓度梯度：0.2–1.0 mmol/L；色氨酸浓度梯度：0–5 mmol/L；温度梯度：25、30、37°C
2.2 质粒与DNA操作
为构建pET-Tdc、pRSF-Tph、pRSF-COMT和pRSF-SANT质粒，参与血清素和褪黑素生物合成的主要酶基因经密码子优化以适配大肠杆菌表达，由南京金斯瑞生物科技从头合成。这些基因包括：Actinomadura luzonensis DSM 43766 Luz15（色氨酸羟化酶，OM250071.1）、Candidatus Koribacter versatilis Ellin 345 Tdc（色氨酸脱羧酶，NC_008009.1）、Sus scrofa SNAT（血清素N-乙酰转移酶，XP_005656968.1）和Oryza sativa COMT（咖啡酸O-甲基转移酶，NM_001403482.1）。此外，在Tph、Tdc、SNAT和COMT酶的氨基末端引入了6×His标签。
初始单步酶促生物合成途径使用两种相容质粒pRSFDuet-1和pETDuet-1构建。为实现过表达工程，以大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增YhjV基因，随后将扩增片段插入pCDFDuet-1和pACYDuet-1两个不同表达载体中。本研究产生的所有质粒详见表S1。
构建pRSF-MBP∗Tph D300A-Tdc、pET-Tdc-MBP∗Tph D300A、pRSF-COMT-SANT和pET-COMT-SANT质粒时，将目标基因分别克隆至pETDuet-1的NcoⅠ/BamHⅠ和pRSFDuet-1的NdeⅠ/XhoⅠ限制性位点，产生一系列异源蛋白表达质粒（表S1）。PCR扩增后，MBP标签片段经序列验证，随后通过Gibson组装连接至Tph酶N端。此外，使用特异设计引物在pETDuet-1质粒上进行定点突变，以修饰色氨酸羟化酶编码核苷酸序列。
为实现tnaA、yddG或speD基因敲除，采用基于CRISPR-Cas9的改良pEcCas/pEcgRNA系统。靶向基因敲除的sgRNA借助在线工具设计并克隆至pEcgRNA质粒。相应的同源修复模板（含约500 bp同源臂，从靶位点侧翼基因组区域扩增）通过融合PCR生成。最后，将pEcCas、pEcgRNA和修复模板共转化至宿主菌后，通过平板抗生素抗性筛选推定基因敲除突变体，并经菌落PCR和DNA测序确认。
Prime STAR Max Premix聚合酶购自Takara（大连），限制性内切酶购自Thermo Scientific（Waltham）。基因组DNA使用天根（北京）试剂盒提取。生工生物工程（上海）提供质粒小提纯化试剂盒和DNA纯化试剂盒。
【数据】限制性位点：NcoⅠ/BamHⅠ、NdeⅠ/XhoⅠ；同源臂长度：约500 bp；Tph来源：A. luzonensis DSM 43766（OM250071.1）；Tdc来源：C. versatilis Ellin 345（NC_008009.1）；SNAT来源：猪（XP_005656968.1）；COMT来源：水稻（NM_001403482.1）
2.3 培养条件
摇瓶培养中，重组菌株在含相应抗生素的LB培养基中于37°C过夜培养（12 h）。随后取500 μL种子液接种至含50 mL基础发酵培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、220 rpm振荡培养3.5 h。随后加入0.8 mmol/L IPTG诱导蛋白表达，继续在30°C下培养22 h。
补料分批发酵使用装载3 L MR培养基（添加5 g/L色氨酸）的5 L生物反应器。流程始于将单菌落接种至LB培养基，37°C、220 rpm振荡培养12 h。菌液接种至MR培养基培养至OD600约2.0。所得二级种子液以10%接种量接入发酵罐。温度初始设为37°C，当OD600达到约20时降至30°C，并以0.8 mmol/L IPTG诱导。补料分批发酵中OD600约20时诱导的选择基于初步优化——诱导时更高的细胞密度可提高体积产率。pH通过添加50% NH₄OH自动维持在7.0，溶解氧通过调节搅拌速度（400–800 rpm）和3 L/min空气流速控制在30%空气饱和度。
补料溶液含700 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、5 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物和5 g/L (NH₄)₂SO₄，采用pH-stat法和动态葡萄糖补料策略输送。90-h补料分批发酵过程中，通过持续抗生素选择维持质粒稳定性——抗生素同时添加在初始培养基和补料流中。该策略确保选择压力且不增加额外代谢负担。
【数据】摇瓶：250 mL摇瓶/50 mL培养基、37°C、220 rpm、3.5 h、0.8 mmol/L IPTG、30°C、22 h；5-L反应器：3 L MR培养基、5 g/L色氨酸、接种量10%、37°C→30°C、OD600约20诱导、0.8 mmol/L IPTG、pH 7.0（50% NH₄OH）、DO 30%、搅拌400–800 rpm、空气3 L/min、90 h；补料液：700 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、5 g/L色氨酸、5 g/L酵母提取物、5 g/L (NH₄)₂SO₄
研究结果
3.1 大肠杆菌中血清素生物合成途径的构建
为实现血清素在大肠杆菌中的异源合成，选取来自Actinomadura luzonensis的色氨酸羟化酶基因（Tph）和来自Candidatus Koribacter versatilis的色氨酸脱羧酶基因（Tdc）构建血清素生物合成途径。使用pETDuet-1（中拷贝数）和pRSFDuet-1（高拷贝数）载体在E. coli BL21(DE3)和C41(DE3)宿主菌中表达Tph和Tdc基因，获得四种工程菌株：SE-B1（含质粒pET-Tdc-Tph）、SE-B2（含质粒pRSF-Tph-Tdc）、SE-C1（含质粒pET-Tdc-Tph）和SE-C2（含质粒pRSF-Tph-Tdc）（图2A）。
优化了色氨酸（Trp）、5-羟基色氨酸（5-HTP）和血清素的HPLC-UV定量分析方法。通过优化，三种物质可在10 min内完成定量分析（R² > 0.999），保留时间分别为8.46 min、4.74 min和5.45 min（图2B）。
测定了工程菌株的生物量和血清素滴度。结果表明，四种工程菌株的生物量相近（OD600约15），但血清素合成滴度相差2.13倍（图2C，SE-B1：64.11 mg/L；SE-C2：136.83 mg/L）。其中，重组菌株SE-B1在48 h时血清素滴度为64.74 mg/L，而SE-C1和SE-C2在同一发酵周期内分别合成136.83 mg/L和108.23 mg/L血清素。这些结果表明宿主和质粒拷贝数对血清素合成有显著影响。
SDS-PAGE分析显示，重组菌株TP-CD（含质粒pET-Tdc）和SE-CP（含质粒pRSF-Tph）中Tdc蛋白（54.3 kDa）可溶表达良好，而Tph蛋白（44.8 kDa）表达水平极低（图S1）。同时，菌株SE-CP中中间产物5-羟基色氨酸在48 h时仅积累69.06 mg/L（图S2），表明Tph介导的羟基化步骤构成途径的主要瓶颈。
采用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签提高Tph在大肠杆菌中的表达水平。MBP通过内在的分子伴侣样活性增强融合伙伴的溶解度——在折叠过程中与疏水区域瞬时相互作用以防止聚集，而非改变亚细胞定位。结果表明，SE-1（含质粒pET-Tdc-MBP∗Tph）的血清素产量提高至168.33 mg/L，较重组菌株SE-C1增加23.02%（图2D）。SDS-PAGE证实该融合策略显著提高了Tph的可溶表达（图S3，87.5 kDa）。结果表明，提高Tph的可溶表达是增强血清素合成的有效方法。
【数据】HPLC保留时间：Trp 8.46 min、5-HTP 4.74 min、serotonin 5.45 min；R² > 0.999；SE-B1：64.11 mg/L（48 h）；SE-C1：136.83 mg/L；SE-C2：108.23 mg/L；OD600约15；Tdc：54.3 kDa；Tph：44.8 kDa；5-HTP积累：69.06 mg/L；SE-1：168.33 mg/L（+23.02%）；MBP∗Tph：87.5 kDa
3.2 Tph蛋白工程改造以增强血清素生物合成
为进一步优化Tph酶的催化性能，基于AlphaFold预测结构进行了理性设计（图3A）。结构分析揭示了关键功能基序，如heme结合口袋和涉及残基Y106、Y109、H375和R295的底物激活位点。在此基础上，选取位于预测底物结合腔内、距吲哚环3 Å半径内的一组残基进行饱和突变。随后，D300位点在虚拟饱和突变预测中被证明有效（图S4）。
筛选结果表明，D300A突变体（SE-2菌株，含质粒pET-Tdc-Tph D300A）的血清素滴度达到198.11 mg/L，较SE-C1对照菌株提高44.78%（图3B）。推测将体积庞大、带负电荷的天冬氨酸残基（Asp300）替换为紧凑的非极性丙氨酸（Ala）可能通过双重机制发挥作用：（1）减弱与底物吲哚环的静电排斥以促进底物结合；（2）优化底物和heme辅因子的空间取向和构象灵活性。这些结构调整共同促进更有利的羟基化过渡态，从而加速反应动力学并提高产物收率。
将MBP标签融合至重组菌株SE-2中的pET-Tdc-Tph D300A，获得工程菌株SE-3（含pET-Tdc-MBP∗Tph D300A），48 h后血清素产量达到217.09 mg/L，较SE-2菌株提高9.58%。由于Tph纯化存在技术困难，未测定体外动力学参数；突变体活性增强由体内证据支持，包括滴度和比生产率的提高。
【数据】D300A突变体（SE-2）：198.11 mg/L（+44.78%）；SE-3（MBP∗Tph D300A）：217.09 mg/L（+9.58%）；突变位点：D300A；关键残基：Y106、Y109、H375、R295；筛选半径：3 Å
3.3 减少前体色氨酸损失以增强大肠杆菌血清素生产
由tnaA编码的色氨酸酶催化的内源色氨酸降解途径，以及YddG转运蛋白介导的外排系统，显著降低了E. coli胞内色氨酸库（图3C）。为增强内源色氨酸供应，在重组菌株SE-3中敲除tnaA基因获得重组菌株SE-4（ΔtnaA）；在SE-3中敲除yddG基因获得菌株SE-5（ΔyddG）；在SE-3中同时敲除tnaA和yddG基因获得双敲除菌株SE-6（ΔtnaAΔyddG）。TP-2由C41ΔtnaA转化pRSF-Tph质粒获得，TP-3通过将pRSF-MBP∗Tph转化至C41ΔtnaA构建，以通过MBP融合增强Tph溶解度。
发酵结果表明，双敲除菌株SE-6产量最高，48 h血清素产量为357.01 mg/L，较重组菌株SE-3（217.09 mg/L）提高64.45%（图3D）。单敲除菌株SE-4和SE-5在48 h的血清素滴度分别为323.49 mg/L和232.66 mg/L，较对照菌株SE-3分别提高49.01%和7.17%。这些发现表明，同时阻断色氨酸降解和外排可产生协同效应，最大化可用于转化的前体库。这些敲除未对细胞增殖产生负面影响（OD600约15）。
【数据】SE-6（ΔtnaAΔyddG）：357.01 mg/L（+64.45%）；SE-4（ΔtnaA）：323.49 mg/L（+49.01%）；SE-5（ΔyddG）：232.66 mg/L（+7.17%）；对照SE-3：217.09 mg/L；OD600约15
3.4 大肠杆菌中褪黑素生物合成途径的构建
利用高效血清素生产菌株SE-6，通过引入来自Sus scrofa的血清素N-乙酰转移酶（SNAT）和来自Oryza sativa的咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）构建褪黑素生物合成途径（图4A）。通过SDS-PAGE验证了SNAT（24.3 kDa）和COMT（40.6 kDa）在大肠杆菌中的可溶表达（图S5）。
为验证不同质粒组合对褪黑素生产的影响，使用两种相容质粒（pETDuet-1和pRSFDuet-1）进行合成模块的模块化组装。在策略A（菌株MT-1A）中，血清素模块（Tdc、MBP∗Tph D300A）保留在pETDuet-1载体中，褪黑素模块（SNAT、COMT）置于pRSFDuet-1载体中。在策略B（菌株MT-2B）中，血清素模块保留在pRSFDuet-1载体中，褪黑素模块置于pETDuet-1载体中。
结果表明，基于C41(DE3) ΔtnaA底盘的两个工程菌株MT-1A和MT-2B均成功合成褪黑素。其中，菌株MT-1A的褪黑素滴度显著高于MT-2B，表明质粒拷贝数组合对多酶级联反应的代谢通量分配具有重要影响。褪黑素合成途径的构建验证了不依赖BH4的新型合成路线的可行性。
【数据】SNAT：24.3 kDa；COMT：40.6 kDa；策略A：血清素模块在pETDuet-1、褪黑素模块在pRSFDuet-1；策略B：血清素模块在pRSFDuet-1、褪黑素模块在pETDuet-1；底盘：C41(DE3) ΔtnaA
讨论与解读
本研究通过整合代谢工程策略，在大肠杆菌中成功构建了无需BH4辅因子的高效血清素和褪黑素生产系统。研究系统性地解决了多个途径瓶颈：通过MBP融合标签和D300A定点突变改善了限速酶Tph的溶解度与催化活性；通过敲除tnaA和yddG基因减少了前体色氨酸的降解与外排；通过模块化质粒组合优化了四酶级联（Tph、Tdc、SNAT、COMT）的表达平衡；并采用转运工程促进产物外排以缓解胞内毒性。最终在5-L生物反应器中通过补料分批发酵获得血清素1.92 g/L和褪黑素3.40 g/L。尽管补料分批发酵实现了高滴度，但工业放大仍面临氧传递、底物水解和诱导剂成本等挑战。
编译者解读：该研究的核心价值在于摆脱了真核生物羟化酶对BH4辅因子的依赖——这一策略直接绕开了大肠杆菌无法内源合成BH4的天然瓶颈，使原核宿主合成褪黑素成为可能。从合成生物学应用角度看，Tph的MBP融合与D300A突变组合是典型的"可溶表达+活性优化"双管齐下策略，对其它难表达膜蛋白或金属酶的改造具有方法论参考意义。值得注意的是，研究采用体内滴度而非体外酶动力学数据来间接验证突变效果，这虽是技术限制下的务实选择，但后续若能突破Tph的体外纯化难题，将有助于更精准地指导酶工程迭代。此外，5-L发酵罐规模的数据为工业化放大提供了扎实的过程工程参数，但碳源成本与诱导策略的进一步优化仍是产业化落地需要面对的现实问题。
参考来源
Wan, D. (2026). Efficient biosynthesis of serotonin and melatonin through combinatorial metabolic engineering in Escherichia coli. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108730
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108730