来源：Systems metabolic engineering of Escherichia coli for the high-level production of deoxyviolacein, a natural colorant（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
脱氧紫色杆菌素是一种具有多种生物活性的天然色素，在化妆品和制药领域应用广泛。然而，天然生产菌株可能引发致命的人类感染，限制了其可持续生产。本研究以L-色氨酸高产大肠杆菌为底盘，通过引入并优化脱氧紫色杆菌素合成途径、多模块代谢工程改造、构建L-色氨酸生物传感器并结合TIGR文库精细调控代谢通量，最终工程菌株以葡萄糖为底物积累12.18 g/L脱氧紫色杆菌素，达到目前报道的竞争性水平。
研究背景
紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素是微生物次生代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎等多种生物活性，在食品、化妆品和制药领域有广泛的工业应用。它们还可作为天然着色剂用于食品添加剂、染料和织物，相比石油基合成色素具有更低的潜在健康风险。紫色杆菌属（Chromobacterium）是生产紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的最著名菌属，其合成基因簇由vioABCDE五个相邻基因组成，同向转录。生物合成以L-色氨酸为起点，首先由VioA催化氧化转化为吲哚-3-丙酮酸亚胺，再经VioB和VioE依次催化转化为原脱氧紫色杆菌酸。生成紫色杆菌素需要VioD和VioC的催化，而脱氧紫色杆菌素的合成仅需VioC参与，因此基因簇缩短为vioABCE。由于紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素独特的生物活性，高效生产这些天然色素的方法引起了广泛关注。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
大肠杆菌JM109作为质粒构建的宿主菌株。大肠杆菌Mut为L-色氨酸生产菌株，由野生型菌株大肠杆菌W3110经多轮常压室温等离子体（ARTP）诱变获得。大肠杆菌Trp为L-色氨酸超高产菌株，由大肠杆菌Mut菌株经多维工程改造获得，作为脱氧紫色杆菌素生产的起始菌株。大肠杆菌菌株在LB培养基中、37°C、220 rpm条件下培养。质粒pTrc99a、pSC101和pACYCDeut用于优化脱氧紫色杆菌素合成基因簇vioABCE的表达，pUC19用于构建L-色氨酸特异性生物传感器。质粒pREDCas9和pGRB用于基因组操作。根据需要添加以下抗生素进行菌株筛选：壮观霉素（50 µg/mL）、氨苄青霉素（100 µg/mL）、卡那霉素（100 µg/mL）和氯霉素（20 µg/mL）。
【数据】菌株：E. coli JM109、E. coli Mut、E. coli Trp；培养基：LB；温度：37°C；转速：220 rpm；抗生素浓度：壮观霉素50 µg/mL、氨苄青霉素100 µg/mL、卡那霉素100 µg/mL、氯霉素20 µg/mL
2.2 质粒与菌株的构建
异源基因片段，包括来自紫色杆菌（C. violaceum）的脱氧紫色杆菌素合成基因簇vioABCE、来自运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的glf（编码葡萄糖促进扩散蛋白）和glk（编码葡萄糖激酶）、以及来自短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）的xfpK（编码磷酸酮醇酶），均由AZENTA（中国苏州）合成。本研究所有基因组工程均使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑进行。首先，为构建质粒pDVIO-1、pDVIO-2和pDVIO-3，使用相应引物扩增并融合vioA和vioB，融合DNA片段通过Gibson assembly克隆至pTrc99a、pACYCDeut和pSC101中，分别生成质粒pTrc99a-vioAB、pACYCDeut-vioAB和pSC101-vioAB。随后，vioC和vioE基因融合后分别与线性化的pTrc99a-vioAB、pACYCDeut-vioAB和pSC101-vioAB连接。为优化基因簇vioABCE的表达，用于VioABCE表达的启动子Ptrc分别被替换为启动子PBBa_J23105、PBBa_J23118、PBBa_J23101和PBBa_J23100。采用一步定点质粒诱变方案。简言之，使用相应的引物对pDVIO-105-F1/R1、pDVIO-118-F1/R1、pDVIO-101-F1/R1和pDVIO-100-F1/R1对质粒pDVIO-1进行反向PCR扩增。PCR产物用DpnI消化并转化至大肠杆菌JM109。通过DNA测序确认具有正确启动子的菌落。
为功能验证基因组测序鉴定的突变基因，在大肠杆菌Mut菌株中对每个突变基因进行基于质粒的过表达。以定点突变trpE fbr（Q71K）为例，从大肠杆菌W3110基因组扩增trpE，克隆至线性化的pTrc99a中构建pTrc99a-trpE。随后对质粒pTrc99a-trpE进行反向PCR扩增。PCR产物经DpnI消化后转化至大肠杆菌JM109。通过DNA测序确认具有正确突变的菌落。其他含有定点突变的功能基因也采用上述方法克隆至pTrc99a中。
【数据】异源基因来源：C. violaceum、Z. mobilis、B. breve；启动子：Ptrc、PBBa_J23105、PBBa_J23118、PBBa_J23101、PBBa_J23100；基因编辑方法：CRISPR/Cas9；克隆方法：Gibson assembly；限制酶：DpnI
2.3 从头测序
对大肠杆菌Mut菌株进行全基因组测序时，先将活化的单菌落接种至10 mL LB培养基中，于37°C过夜培养。然后将培养物接种至50 mL LB培养基中，于37°C培养10小时。收集全部细胞沉淀并冷冻于液氮中。总DNA提取和从头测序由AZENTA完成。
【数据】菌株：E. coli Mut；培养基：LB；体积：10 mL（过夜）、50 mL（10 h）；温度：37°C；测序方式：全基因组从头测序
2.4 L-色氨酸特异性生物传感器的构建
为构建L-色氨酸响应型生物传感器，构建质粒pUChyp-0用于杂合启动子测试。具体而言，使用引物pUC19-100-gfp-F1/R1和pUC19-100-gfp-F2/R2，将受启动子PBBa_J23100控制的gfp基因扩增并连接至线性化的pUC19质粒。构建的质粒转化至大肠杆菌JM109，以100 µg/mL氨苄青霉素抗性筛选。通过PCR和DNA测序验证正确菌落。以质粒pUChyp-0为模板，使用相应引物通过Gibson assembly生成含有杂合启动子P100-1、P100-2和P100-3的质粒。通过DNA测序验证正确菌落。
为构建启动子PBBa_J23100的随机突变文库，使用引物在相应位置引入简并碱基，构建了四个文库。转化子在平板上铺展并接种至96孔板进行过夜培养。最后，使用酶标仪鉴定荧光值较高的突变体。将获得的启动子P100mut插入gfp基因上游，使用引物pUC19-100mut-gfp-F1/R1和pUC19-100mut-gfp-F2/R2克隆至载体pUC19中。以构建的质粒pUChyp-4为模板，其他质粒pUChyp-5–13的构建过程与上述相同。所有构建的质粒随后转化至TrpR+菌株，以测定其对不同浓度L-色氨酸的响应范围。简言之，携带不同质粒的菌株在含有0–20 mM不同浓度梯度L-色氨酸的基本培养基中培养。过夜培养后，使用酶标仪测定生物传感器的响应范围。基本培养基含有1 g/L NH4Cl、6 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、5 µM MgSO4·7H2O、2 µM CaCl2和20%（w/v）葡萄糖。
【数据】载体：pUC19；筛选标记：100 µg/mL氨苄青霉素；L-色氨酸浓度梯度：0–20 mM；基本培养基组分：1 g/L NH4Cl、6 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、5 µM MgSO4·7H2O、2 µM CaCl2、20%（w/v）葡萄糖；检测仪器：酶标仪
2.5 TIGR文库的构建
TIGR文库按照此前报道的方法进行表征。为将TIGR文库应用于脱氧紫色杆菌素生产，将TIGR序列插入aroG Q151F与ppsA之间，以及ppsA与tktA之间。扩增aroG Q151F的DNA片段并克隆至pACYCDeut载体中，生成质粒pDuet-aroG Q151F。将tktA和TIGR序列的DNA片段以及ppsA和TIGR序列的DNA片段通过PCR融合，形成TIGR-ppsA-TIGR-tktA。将融合片段插入质粒pDuet-aroG Q151F中，构建最终的aroGQ151F-TIGR-ppsA-TIGR-tktA文库。含有不同TIGR序列的质粒文库转化至大肠杆菌Trp菌株进行后续筛选。
【数据】插入位点：aroG Q151F与ppsA之间、ppsA与tktA之间；载体：pACYCDeut；文库结构：aroGQ151F-TIGR-ppsA-TIGR-tktA；宿主菌株：E. coli Trp
2.6 脱氧紫色杆菌素生产的摇瓶和补料分批发酵
脱氧紫色杆菌素生产的摇瓶和补料分批发酵按照此前报道的方法进行，并作少量修改。活化菌落接种至30 mL种子培养基中，于30°C、230 rpm培养10小时。培养后，将5 mL种子培养物转移至25 mL发酵培养基中进行摇瓶发酵。当培养物的OD600达到0.6–0.8时，加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导基因表达。
对于补料分批发酵，活化菌落先在50 mL LB培养基中预培养，于37°C生长10小时。然后将全部培养物接种至含有2 L种子培养基的5 L生物反应器中。当种子培养物生长至OD600为10–12时，保留约400 mL培养物，转移至另一份2 L发酵培养基中，于30°C进行脱氧紫色杆菌素生产。发酵6小时后，补充1 mM IPTG诱导基因表达。通过调节搅拌速度和通气速率将溶解氧维持在约30%。通过添加25%（v/v）NH3·H2O将pH维持在7.0。通过以适当速率添加80%葡萄糖溶液，将葡萄糖浓度维持在0.5–1.5 g/L。
【数据】摇瓶发酵：种子培养基30 mL、30°C、230 rpm、10 h；接种量：5 mL/25 mL；诱导剂：1 mM IPTG；诱导时机：OD600 0.6–0.8；补料分批发酵：5 L反应器、2 L种子培养基、接种后OD600 10–12、转移体积约400 mL/2 L发酵培养基、30°C、IPTG 1 mM（6 h后）、溶解氧约30%、pH 7.0（25% NH3·H2O）、葡萄糖0.5–1.5 g/L（80%葡萄糖溶液）
2.7 分析方法
通过测量OD600监测细胞密度。
【数据】检测方法：OD600
研究结果
3.1 构建产脱氧紫色杆菌素的大肠杆菌菌株
由于L-色氨酸是脱氧紫色杆菌素生物合成的主要前体，此前构建的L-色氨酸超产菌株大肠杆菌Trp被用作高效合成脱氧紫色杆菌素的工程宿主。大肠杆菌Trp是通过多维工程改造开发的。具体而言，首先通过将核糖开关生物传感器与ARTP诱变相结合，筛选获得L-色氨酸生产菌株大肠杆菌Mut。在此基础上，通过启动子和N端编码序列工程增强L-色氨酸合成相关酶的表达水平。此外，对转运、降解、辅因子供应和副产物合成模块进行了改造。最终构建了L-色氨酸积累能力大幅提升的大肠杆菌Trp菌株。
选择来自紫色杆菌的合成基因簇vioABCE，在大肠杆菌中构建异源脱氧紫色杆菌素合成途径。在此，密码子优化版本的vioABCE基因通过质粒过表达在大肠杆菌中表达（图1B）。使用三种载体（pTrc99a、pACYCDuet和pSC101）确定最适合基因簇表达的载体系统。因此，构建了三种重组质粒pDVIO-1、pDVIO-2和pDVIO-3，在Ptrc启动子控制下表达vioABCE opt操纵子，并分别转化至大肠杆菌Trp菌株，形成菌株dVio1、dVio2和dVio3。摇瓶分析表明，dVio1菌株表现出更高的脱氧紫色杆菌素产量，为0.86 g/L，超过dVio2（0.72 g/L）和dVio3（0.65 g/L）菌株，且vioABCE基因的异源表达对细胞生长无负面影响。作为对照，初始大肠杆菌Trp菌株中未检测到脱氧紫色杆菌素。这些结果表明在大肠杆菌中成功开发了异源脱氧紫色杆菌素生物合成途径。
此外，开发了多种策略来优化脱氧紫色杆菌素生产（图1B）。首先，通过将高拷贝载体pTrc99a上原有的Ptrc启动子替换为具有不同强度的不同组成型启动子（BBa_J23105、BBa_J23118、BBa_J23101和BBa_J23100），优化vioABCE opt基因簇的表达水平，并将其引入基础菌株中，形成四个不同菌株dVio4-7。摇瓶培养表明，四个工程菌株的脱氧紫色杆菌素产量均低于菌株dVio1。因此，选择含有质粒pDVIO-1的菌株dVio1进行后续途径优化。
为每个异源基因（vioA、vioB、vioC和vioE）开发了四个核糖体结合位点（RBS）文库，通过向引物中引入简并碱基实现，并用于确定协调基因表达水平的最佳组合。这四个基因及其相关RBS文库组装后插入载体pTrc99a中，随后引入基础菌株构建最终的突变文库。由于脱氧紫色杆菌素具有显著的颜色，采用比色筛选法轻松区分高产菌株。保留颜色最深（前2%）的细胞进行进一步表征。其中，三个菌株被命名为dVio8、dVio9和dVio10，经24深孔板发酵培养基培养后验证为最佳生产菌株，产量较高。摇瓶发酵确认中，菌株dVio9表现出优良表型，脱氧紫色杆菌素产量为1.15 g/L，而dVio8和dVio10的滴度较低，分别为0.98 g/L和1.02 g/L。总之，通过优化大肠杆菌中脱氧紫色杆菌素合成关键基因vioABCE的表达，获得了有前景的候选菌株dVio9，产量显著提升约33.72%（图1C）。这些结果与RT-qPCR数据一致，菌株dVio9中vioABCE四个基因的转录水平较菌株dVio1提高了4.52倍至7.31倍。
【数据】脱氧紫色杆菌素产量：dVio1为0.86 g/L、dVio2为0.72 g/L、dVio3为0.65 g/L；RBS文库筛选后：dVio9为1.15 g/L、dVio8为0.98 g/L、dVio10为1.02 g/L；产量提升：约33.72%；转录水平提升：4.52–7.31倍
3.2 通过大肠杆菌Trp菌株基因组景观鉴定高效靶点
脱氧紫色杆菌素的成功生产表明大肠杆菌Trp菌株是异源合成脱氧紫色杆菌素的合适底盘。然而，其基因组特征尚未阐明，这限制了目标菌株的进一步改造。为解决这一问题，进行了基因组测序，以更好地理解大肠杆菌Mut菌株的内在代谢特征，并鉴定新的工程靶点以提高目标产物产量。
基因组规模鉴定显示全基因组共有54个突变。其中，44个突变位于ORF区域，10个突变位于非ORF区域。这些突变基因大致可分为四类：与L-色氨酸生物合成相关的突变、参与调控L-色氨酸生物合成的潜在转录因子、细胞表型和中心代谢相关突变，以及其他细胞过程相关突变。
为进一步鉴定有利于L-色氨酸生物合成的基因组变化，将位于ORF中改变氨基酸序列的38个突变在大肠杆菌Mut菌株中进行功能验证。所有38个突变基因均克隆至载体pTrc99a中生成质粒pTRP-MT-1–38，并分别转化至大肠杆菌Mut菌株，形成菌株TRP1-38。摇瓶发酵表明，少数突变有利于L-色氨酸合成，而其他突变显示中性效应。例如，在大肠杆菌Mut菌株中过表达14个突变（包括AroGQ151F、TrpEQ71K、SerAP215T和PlsCK228R）对L-色氨酸生产有有益影响，但贡献程度不同。提前终止的基因（包括SulAL51X、TyrRR253X、YdgIQ439X、CsrAE46X、MtrR70X和Ppcfs）也被过表达以确定其在L-色氨酸合成中的作用，结果导致L-色氨酸产量显著下降，表明这些基因的破坏可能产生积极影响。另有18个突变被鉴定为中性。
在正向突变中，以下两个突变显著增强了L-色氨酸生产：AroGQ151F（编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶，DAHP合酶）和TrpEQ71K（编码邻氨基苯甲酸合成酶）。摇瓶发酵表明，过表达AroGQ151F将L-色氨酸产量从2.15 g/L提高至3.32 g/L。含有质粒pTRP-MT-16的大肠杆菌Mut菌株积累2.87 g/L L-色氨酸，总产量提高33.49%（图2A）。
为揭示TrpEQ71K和AroGQ151F突变对L-色氨酸合成的贡献，对野生型蛋白TrpE和AroG与其靶分子结合的构象进行了结构建模分析（图2B和2C）。对AroGQ151F和AroGL179S的结合能进行了比较，发现AroGQ151F的结合能为2.68 KJ/mol，而AroGL179S仅为0.13 KJ/mol。通常，较高的结合能导致结构更不稳定。小分子L-苯丙氨酸更可能从AroGQ151F的结合口袋中脱离，从而解除L-苯丙氨酸对AroGQ151F的反馈抑制。为揭示TrpEQ71K增强L-色氨酸生物合成的机制，对野生型TrpE和TrpEQ71K与效应分子L-色氨酸进行了MD模拟。如图2C所示，与野生型TrpE的构象相比，TrpEQ71K的结构表现出相对闭合的构象，这可能导致其活性位点口袋的结构变化，从而阻止与其小分子的正常结合。因此，通过将Q71残基替换为K，TrpE的反馈抑制在一定程度上得到缓解。
【数据】全基因组突变数：54个（ORF区44个、非ORF区10个）；功能验证突变数：38个；正向突变数：14个；中性突变数：18个；AroGQ151F过表达：L-色氨酸产量从2.15 g/L提高至3.32 g/L；TrpEQ71K过表达：L-色氨酸产量2.87 g/L，提高33.49%；结合能：AroGQ151F为2.68 KJ/mol、AroGL179S为0.13 KJ/mol
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程成功开发了一株脱氧紫色杆菌素超高产大肠杆菌菌株。首先，在L-色氨酸超产菌株中构建并优化了脱氧紫色杆菌素合成途径，通过基因组测序鉴定了AroG和TrpE的新颖抗反馈抑制位点。随后，进行多模块工程改造以增强脱氧紫色杆菌素产量。通过代谢通量优化和生物传感器引导策略，工程菌株实现了目前具有竞争力的脱氧紫色杆菌素滴度（12.18 g/L）和生产率（0.169 g/L/h）。未来研究应聚焦于优化途径效率、探索新的代谢工程工具，以及改进生物传感器应用，以促进增值芳香族化合物的微生物生产。
编译者解读：该研究展示了系统代谢工程策略在天然产物微生物制造中的完整范式——从底盘菌株的基因组解析出发，结合生物传感器辅助的高通量筛选与TIGR文库精细调控，实现了代谢通量的精准分配。12.18 g/L的产量达到目前报道的竞争性水平，证明了以L-色氨酸为前体的芳香族化合物在大肠杆菌中高效生产的可行性。值得注意的是，研究将ARTP诱变与基因组重测序相结合，反向挖掘有益突变位点，这种"诱变-筛选-解析-再工程"的策略对非模式菌株的代谢工程改造具有借鉴意义。然而，目前仍以葡萄糖为单一碳源，未来若能拓展至廉价底物并进一步缩短发酵周期，将更有利于工业化推广。
参考来源
Tang M. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for the high-level production of deoxyviolacein, a natural colorant. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132584
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132584