来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for uridine-5′-diphosphate N-acetylglucosamine production through salvage pathway（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）是糖胺聚糖和人乳寡糖合成的关键前体，具有独特生物活性。本研究选取以GlcNAc为唯一碳源的补救合成途径，系统验证了来自尿苷合成、ATP合成、GlcNAc利用及UDP-GlcNAc下游代谢通路的5个代谢改造位点。最终获得菌株NGP7-1，UDP-GlcNAc产量达230.72 mg/L；优化GlcNAc添加量后产量进一步提升至319.23 mg/L，为目前单菌株报道最高水平。
研究背景
核苷酸糖由糖基部分与核苷二磷酸或核苷一磷酸组成，其中UDP-GlcNAc是最重要的核苷酸糖，由尿苷二磷酸与N-乙酰氨基葡萄糖经脱水缩合形成。UDP-GlcNAc在肿瘤免疫调节、肝癌代谢调控、非酒精性脂肪肝等代谢疾病干预以及抗真菌和抗结核药物开发中展现出独特活性。此外，UDP-GlcNAc也是糖胺聚糖和人乳寡糖等生物活性碳水化合物合成的必需前体。糖胺聚糖具有抗菌、抗高脂血症和缓解神经病变等生物活性；人乳寡糖作为母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分，已被证实可促进婴儿大脑发育，在婴儿配方奶粉中具有巨大应用潜力。代谢合成被认为是UDP-GlcNAc生产的经济策略，但现有产量仍难以满足生产需求。
研究方法
2.1 质粒构建
用于过表达的质粒（pET28a(+)、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1）及用于敲除的质粒（pEcCas和pTargetF）均保存于本实验室。本研究中涉及代谢改造过程的所有基因（表S1），除nahK、glmU和ppa外，均来源于大肠杆菌BL21(DE3)；其中nahK基因来源于长双歧杆菌（Bifidobacterium longum），glmU和ppa来源于多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）。
质粒构建流程如下：首先使用快速质粒小提试剂盒从模板菌株中提取目标质粒。随后使用2 × Phanta Master Mix（P525酶）通过PCR扩增目标基因，退火温度为55°C，延伸时间根据扩增片段长度确定，按2000 bp/min计算。扩增后的基因使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（C115酶）连接至不同过表达质粒，反应条件为50°C、30 min，构建重组质粒（表S2）。
CRISPR/Cas9质粒的构建与过表达质粒不同：使用CHOPCHOP网站（https://chopchop.cbu.uib.no/）从目标基因中选取合适的N20序列（位于AGG、TGG、CGG或GGG之前的20 bp核苷酸序列）。通过PCR扩增将这些N20序列插入pTargetF质粒的J23119启动子与gRNA序列之间，构建pTargetF-N20质粒。随后，选取目标基因上游500 bp和下游500 bp作为左右臂（L臂和R臂）。L臂和R臂经P525酶扩增和重叠连接后，由C115酶连接至pTargetF-N20的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点之间。为将nagE和prs整合至大肠杆菌染色体，目标基因nagE和prs需分别插入pTargetF-wecB和pTargetF-purR的L臂与R臂之间。
【数据】退火温度：55°C；延伸速率：2000 bp/min；连接反应：50°C、30 min；同源臂长度：各500 bp
2.2 菌株与培养条件
本实验室其他项目构建的工程菌株BL21-pET28a-nahK、BL21-pET28a-glmU和BL21-pET28a-ppa用于表达N-乙酰氨基己糖1-激酶（NahK）、UDP-GlcNAc焦磷酸化酶（GlmU）和焦磷酸酶（PPA）。本研究构建的其他工程菌株（表1）包括起始菌株NGP3-1及单基因、双基因和多基因修饰菌株。
菌株使用LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）培养，并添加相应抗生素进行筛选（氨苄青霉素：100 μg/mL；卡那霉素：50 μg/mL；氯霉素：34 μg/mL；链霉素：50 μg/mL；壮观霉素：50 μg/mL）（表1）。
酶表达流程：挑取单菌落接种于含5 mL LB培养基的15 mL试管中，37°C、200 rpm振荡培养8-12 h。随后将500 μL种子液转移至含50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中，37°C培养4-6 h至OD600达到0.6。加入终浓度为100 μM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）后，20°C培养16-18 h诱导酶表达。
UDP-GlcNAc发酵过程与酶表达类似，区别在于需接种2%种子液，且IPTG终浓度降至50 μM。
【数据】LB培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL、链霉素50 μg/mL、壮观霉素50 μg/mL；种子培养：37°C、200 rpm、8-12 h；诱导培养：37°C至OD600=0.6，IPTG 100 μM，20°C、16-18 h；发酵：2%接种量，IPTG 50 μM
2.3 UDP-GlcNAc合成途径的体外验证
本研究中所有酶均使用Ni-NTA superflow柱纯化，纯化过程按照先前报道的方法进行。为验证NahK活性和UDP-GlcNAc补救途径的可行性，分别构建了NahK单酶反应体系和NGP三酶反应体系（本研究涉及的所有酶反应体系见表S3）。两个体系均在40°C水浴中孵育24 h，随后沸水浴3 min终止反应。25°C、12000 rpm离心5 min后，收集上清液进行薄层色谱（TLC）和质谱（MS）分析。
TLC分析：取1 μL反应上清液（重复三次以确保清晰）及标准品（UDP-GlcNAc、GlcNAc）点样于TLC板，经展开（3个循环）后，用苯胺-二苯胺-磷酸试剂在86°C显色20 min，分析底物消耗和产物生成。MS分析由青岛雁博科技有限公司完成。
为进一步优化UDP-GlcNAc补救途径，将来源于大肠杆菌BL21(DE3)的尿苷一磷酸激酶（Umpk）、乙酸激酶（AckA）和核苷二磷酸激酶（Ndk）添加至NGP反应体系，构建了两个能以尿苷一磷酸（UMP）为底物直接合成UDP-GlcNAc的五酶反应体系。分别命名为NGPUA（NahK、GlmU、PPA、Umpk、AckA）和NGPUn（NahK、GlmU、PPA、Umpk、Ndk）。按照上述相同程序孵育和终止反应后，使用MS验证UDP-GlcNAc的合成。
【数据】反应温度：40°C；反应时间：24 h；终止：沸水浴3 min；离心：12000 rpm、25°C、5 min；TLC点样量：1 μL；显色：86°C、20 min
2.4 UDP-GlcNAc生产起始菌株的构建
体外验证了经UTP循环优化的补救途径（NGPUA和NGPUn体系）的可行性后，将该途径进一步引入大肠杆菌BL21(DE3)构建重组菌株，以筛选最优起始菌株。
首先，以过表达NahK、GlmU和PPA的NGP1菌株为基础，将携带NGPUA系统（含umpk和ackA基因，命名为pCDFDuet-1-umpk-ackA）和NGPUn系统（含umpk和ndk基因，命名为pCDFDuet-1-umpk-ndk）的重组质粒分别转化至NGP1，在体内建立NGPUA和NGPUn代谢系统，获得菌株NGP2-1和NGP2-2。
为缓解多质粒共表达可能造成的代谢负担，删除了UTP循环途径中的非必需基因（即umpk）。同时，将调控副产物去除和能量再生的协同辅助酶基因（ppa和ackA）克隆至低拷贝质粒pCDFDuet-1，构建重组质粒pCDFDuet-1-ppa-ackA和pCDFDuet-1-ppa-ndk——作为优化辅助质粒，用于微调辅助酶的表达强度。
随后，这两个辅助质粒分别与pACYCDuet-1-nahK-glmU（携带核心基因nahK和glmU）组合，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建菌株NGP2-3和NGP2-4。
此后，为提高核心途径基因（nahK和glmU）的表达效率，将这两个基因插入不同拷贝数的过表达质粒（pETDuet-1和pRSFDuet-1），构建pETDuet-1-nahK-glmU和pRSFDuet-1-nahK-glmU。每个核心质粒与优化的低拷贝辅助质粒pCDFDuet-1-ppa-ackA组合，共转化至大肠杆菌BL21(DE3)，生成菌株NGP3-1和NGP3-2。
在标准发酵条件下，系统评估了所构建菌株的生长稳定性和UDP-GlcNAc合成能力，确定NGP3-1作为后续代谢工程研究的起始菌株。
【数据】核心质粒：pACYCDuet-1-nahK-glmU、pETDuet-1-nahK-glmU、pRSFDuet-1-nahK-glmU；辅助质粒：pCDFDuet-1-ppa-ackA、pCDFDuet-1-ppa-ndk
2.5 代谢改造位点筛选
以NGP3-1为起始菌株，本研究通过单因素改造策略对4条关键代谢途径进行改造，以筛选提高UDP-GlcNAc产量的有效靶点。
对于UTP合成途径的改造，将携带不同拷贝数prs基因的重组质粒（pCDFDuet-1-ppa-prs-ackA、pACYCDuet-1-prs、pETDuet-1-nahK-prs-glmU）转化至NGP3-1，构建prs过表达菌株NGP4-U1、NGP4-U2和NGP4-U3。
研究结果
3.1 UDP-GlcNAc合成菌株的构建
UDP-GlcNAc的从头合成途径包含六步反应（图1A），这大大降低了产物的合成效率并增加了代谢改造的难度。因此，本研究聚焦于UDP-GlcNAc的补救途径（图1A）作为主要合成路线。
首先，在体外验证了UDP-GlcNAc补救途径的可行性（图S1）。NahK单酶反应的MS结果（图2A）表明中间产物GlcNAc-1-P（300.10 m/z）成功合成，证实NahK能有效将GlcNAc转化为GlcNAc-1-P。与单酶结果相比，NGP途径的结果（图2B）在605.99 m/z处出现峰（UDP-GlcNAc），证明三酶级联可以合成UDP-GlcNAc，为UDP-GlcNAc合成菌株的构建奠定了坚实基础。
基于体外结果，通过过表达nahK、glmU和ppa基因构建了NGP1。诱导表达后，将NGP1的裂解液替代NGP途径反应体系中的纯酶（表S3），并应用相同的反应条件。MS结果显示该体系中成功合成了UDP-GlcNAc（图S2A），证明三种酶的活性未因共表达而丧失。SDS-PAGE结果也确认三种酶均成功表达（图S2B）。
随后，在培养基中添加终浓度为1%的GlcNAc进行UDP-GlcNAc发酵。使用MS和HPLC对胞内和胞外产物进行定性和定量分析。MS结果显示UDP-GlcNAc出现显著峰，而胞外样品中未检测到相应峰（图2C）。HPLC结果进一步证实NGP1合成的UDP-GlcNAc主要定位于胞内（图2D）。这些结果表明UDP-GlcNAc成功合成且主要存在于细胞内（91.35 mg/L）。因此，本研究后续将重点提高UDP-GlcNAc的胞内产量。
【数据】GlcNAc-1-P：300.10 m/z；UDP-GlcNAc：605.99 m/z；GlcNAc添加浓度：1%；NGP1胞内UDP-GlcNAc：91.35 mg/L
3.2 UDP-GlcNAc补救途径的优化
作为广泛使用的糖供体，UDP-GlcNAc及其衍生物参与细胞内众多转糖基反应，这将导致UDP和UMP的大量浪费（图1B）。为解决这一问题，有必要在UDP-GlcNAc补救途径的基础上增强UDP和UMP的利用途径。
使用纯化酶在体外构建了NGPUA和NGPUn反应体系，以UMP为底物合成UDP-GlcNAc。经MS鉴定，NGPUA和NGPUn反应体系均在606 m/z附近出现清晰的UDP-GlcNAc峰。这些结果证明Umpk、AckA和Ndk能够实现UTP的循环利用（图3A和B）。
基于体外结果，将NGPUn和NGPUA系统应用于体内，构建了NGP2-1和NGP2-2菌株。它们的HPLC结果如图4A所示。其UDP-GlcNAc产量远低于NGP1，这可能归因于基因的过度过表达导致细胞应激过度。
由于大部分UDP-GlcNAc参与细胞壁肽聚糖的合成，尿苷在胞内主要以UDP形式存在，因此删除了NGP2-1和NGP2-2中过表达的umpk基因。此外，将ppa基因从pET28a(+)质粒转移至拷贝数更低的pCDFDuet-1质粒，构建pCDFDuet-1-ppa-ackA和pCDFDuet-1-ppa-ndk，用于构建菌株NGP2-3和NGP2-4。如图4A所示，NGP2-3的产量比NGP1高6.52%，达到99.66 mg/L。由于这种方法对UDP-GlcNAc产量的提升幅度很小，因此不被认为是NGP2-1和NGP2-2产量下降的主要原因。
考虑到pACYCDuet-1质粒中ACYC复制子的拷贝数仅为15-20，这导致nahK和glmU的表达水平较低。因此，主代谢途径容易被其他基因的过表达所干扰。使用拷贝数更高的pETDuet-1和pRSFDuet-1质粒构建了NGP3-1和NGP3-2菌株。其中，NGP3-1获得了最高的UDP-GlcNAc产量，达到107.27 mg/L，比NGP1提高了17.43%（图4B）。
【数据】NGP2-3产量：99.66 mg/L（较NGP1提高6.52%）；NGP3-1产量：107.27 mg/L（较NGP1提高17.43%）；pACYCDuet-1拷贝数：15-20
3.3 代谢改造位点筛选
基于NGP3-1菌株，验证了5个可能提高UDP-GlcNAc产量的代谢改造位点，分别位于UTP合成途径、GlcNAc利用途径、UDP-GlcNAc下游代谢途径和ATP合成途径（图1B）。
据报道，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸（PRPP）是核苷酸及其衍生物合成的限制因素。Wu等人通过过表达PRPP合成酶基因prs增强了尿苷合成。本研究将prs分别克隆至pCDFDuet-1-ppa-ackA、pACYCDuet-1和pETDuet-1-nahK-glmU中，获得pCDFDuet-1-ppa-prs-ackA、pACYCDuet-1-prs和pETDuet-1-nahK-prs-glmU。使用这些质粒分别构建了相应菌株NGP4-U1、NGP4-U2和NGP4-U3。如图5所示，NGP4-U1和NGP4-U2相比NGP3-1获得了更高产量。其中，NGP4-U2的UDP-GlcNAc产量达到197.98 mg/L（比NGP3-1高84.56%）。
许多研究发现PRPP合成途径的11个基因受到PRPP合成抑制基因（PurR）的抑制，尿苷转运系统也直接或间接受到purR的调控。为提高尿苷供应，使用CRISPR/Cas9系统敲除了purR，命名为BL21-1（图S3）。在37°C下测定生长曲线，确定purR基因敲除对大肠杆菌生长无显著影响（图S4）。基于BL21-1过表达nahK、glmU、ppa和ackA基因构建了NGP4-U4。与NGP3-1相比，UDP-GlcNAc产量提高了93.67%，达到207.75 mg/L。这些结果表明尿苷供应不足是UDP-GlcNAc产量低的主要原因之一。
ATP是UDP-GlcNAc合成补救途径中最重要的底物之一。为探索增强ATP供应对提高产量的潜力，在NGP3-1基础上过表达pfkA（EMP途径关键酶）构建菌株NGP4-A1。然而，UDP-GlcNAc产量仅达到108.47 mg/L，仅比NGP3-1高1.12%。这一微小提升表明，在以GlcNAc为唯一碳源的条件下，pfkA过表达无法有效增强ATP供应，因为EMP途径依赖葡萄糖来激活pfkA在糖酵解中的功能（图1B）。后续补充实验进一步证实，向发酵体系中添加葡萄糖会引发碳分解代谢物阻遏（CCR），导致UDP-GlcNAc产量下降。
研究表明，GlcNAc通过GlcNAc特异性转运蛋白（NAG，由nagE基因编码）进行转运和磷酸化。在此过程中，GlcNAc被磷酸化为GlcNAc-6-P，主要通过三条不同途径参与UDP-GlcNAc的补救合成，分别命名为Nayq、Napg和NaGl（图6A）。为提高大肠杆菌的胞外GlcNAc利用能力，在NGP3-1基础上过表达nagE基因构建NGP4-G1，UDP-GlcNAc产量显著提高（比NGP3-1高86.34%），达到199.89 mg/L。发酵后，NGP4-G1的GlcNAc含量（65.32 mg/L）显著低于NGP3-1。
【数据】NGP4-U2产量：197.98 mg/L（较NGP3-1提高84.56%）；NGP4-U4产量：207.75 mg/L（较NGP3-1提高93.67%）；NGP4-A1产量：108.47 mg/L（较NGP3-1提高1.12%）；NGP4-G1产量：199.89 mg/L（较NGP3-1提高86.34%）；NGP4-G1残留GlcNAc：65.32 mg/L
3.4 基于prs过表达的组合优化
基于上述单因素改造结果，prs过表达（NGP4-U2）和nagE过表达（NGP4-G1）均显著提高了UDP-GlcNAc产量。为进一步提升产量，本研究在prs过表达的基础上进行了组合优化。
将nagE过表达与prs过表达进行组合，构建了同时过表达prs和nagE的菌株。此外，将UDP-GlcNAc下游代谢途径的修饰也纳入组合策略中。通过逐步组合各有效改造位点，最终构建了多基因组合优化菌株。
【数据】原文未详述具体组合菌株的产量数值
3.5 多条件组合优化
在组合优化的基础上，进一步考察了基因组整合nagE对UDP-GlcNAc产量的影响。将nagE整合至大肠杆菌染色体后，UDP-GlcNAc产量进一步提升。最终获得的菌株NGP7-1在标准发酵条件下UDP-GlcNAc产量达到230.72 mg/L。
【数据】NGP7-1产量：230.72 mg/L
3.6 培养条件优化
在获得最优菌株NGP7-1后，对培养条件进行了系统优化。考察了GlcNAc添加量、IPTG添加量和培养时间对UDP-GlcNAc产量和OD600的影响。
在优化GlcNAc添加量后，UDP-GlcNAc产量达到319.23 mg/L，为单菌株获得的最高产量。
【数据】优化后UDP-GlcNAc产量：319.23 mg/L
讨论与解读
本研究选择UDP-GlcNAc补救合成途径作为主路线，绕过了六步从头合成途径的效率瓶颈。通过体外酶反应体系验证途径可行性后，系统筛选了UTP合成、ATP合成、GlcNAc利用及下游代谢途径中的5个改造位点。其中，prs过表达（提高84.56%）和nagE过表达（提高86.34%）效果最为显著，而pfkA过表达几乎无效（仅提高1.12%），这提示以GlcNAc为唯一碳源时EMP途径无法有效提供ATP。通过组合优化与培养条件调整，最终菌株NGP7-1产量达319.23 mg/L，为目前单菌株最高水平。
编译者解读： 本研究展示了典型的合成生物学"设计-构建-测试-学习"循环——从体外途径验证到体内多靶点组合优化，逻辑严谨。值得关注的是，作者巧妙利用尿苷循环回收策略解决UDP浪费问题，并系统比较了不同拷贝数质粒对代谢流的影响。不足之处在于pfkA改造的失败提示ATP供应仍是限制因素，若后续能引入不依赖葡萄糖的ATP再生模块，产量或可进一步提升。该策略对其它GlcNAc衍生糖的微生物合成具有参考价值。
参考来源
Sun H. Metabolic engineering of Escherichia coli for uridine-5′-diphosphate N-acetylglucosamine production through salvage pathway. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.02.008
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.02.008