来源：De novo biosynthesis of halogenated benzoxazinoids in Nicotiana benthamiana（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
卤代反应能显著改善天然产物的生物活性与药代动力学性质，但化学卤代条件苛刻、选择性差。本研究以本氏烟草为底盘，通过前体定向与全新合成两种策略，筛选22种苯并噁嗪类（BXD）生物合成酶，实现了多种氯代与氟代BXD的植物体内生产。研究还引入细菌色氨酸卤化酶模块，打通了从色氨酸出发的氯代吲哚体内合成路径，首次在植物中实现了氯代BXD的从头生物合成。
研究背景
天然产物是药物、除草剂及新化合物的重要化学骨架来源。然而，这些分子往往需要化学修饰以增强其生物利用度、膜渗透性和结合亲和力。卤代是最常见的修饰方式之一——引入氟、氯、溴、碘等卤素原子可改变分子的极性、尺寸和亲脂性，从而调节生物活性。超过250种FDA批准药物含氯原子，25%以上的药物含氟；2010年以来上市的新农用化学品中约80%含卤素。化学卤代通常需要剧烈反应条件和有毒试剂，区域选择性和立体选择性也往往不理想。酶促卤代则提供了更可持续的替代方案，具有高区域选择性和立体选择性。苯并噁嗪类化合物（BXDs）是来源于吲哚的植物特殊代谢物，其卤代衍生物具有令人期待的医药和农化应用前景。
研究方法
2.1 化学试剂
本研究使用的所有化学品，除非另有说明，均购自Sigma Aldrich、Thermo Fisher Scientific或东京化成工业（TCI），纯度达分子生物学级或更高。
2.2 植物材料与生长条件
本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种植于温室中，光周期为16小时光照/8小时黑暗，温度20-24°C，相对湿度60%。用于瞬时表达的植株在农杆菌介导转化前生长3-4周。
2.3 克隆
目标基因序列从NCBI获取，以cDNA或Twist Bioscience合成的合成基因为模板进行PCR扩增。基因扩增使用Platinum SuperFi II PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific），按制造商说明操作。PCR产物用DNA Clean and Concentrator-5（Zymo）纯化。使用In-Fusion HD Cloning（Takara Bio）将基因克隆至p3Ω1载体（BsaI-HF酶切，New England Biolab）用于本氏烟草表达，或pOPINF载体（HindIII-HF/KpnI-HF酶切，New England Biolab）用于大肠杆菌表达。Golden Braid组装法用于将PCR产物克隆至p3α1载体，使用BsaI-HF和T4连接酶（New England Biolab）（Sarrion-Perdigones et al., 2013）。化学感受态大肠杆菌TOP10通过热激法转化。细胞涂布于含适当筛选抗生素的LB-琼脂平板，37°C培养。单菌落接种于含适当抗生素的液体LB培养基，37°C、220 rpm振荡过夜。质粒提取使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System kit（Promega），插入基因序列经Sanger测序确认。已克隆的Bx基因（p3Ω1或pCambia2300载体用于本氏烟草表达，pOPINF用于大肠杆菌表达）来自Florean et al.（2025b, 2023）。引物和基因序列分别见SI Table 1和SI Table 2。
【数据】培养基：LB；温度：37°C；转速：220 rpm；载体：p3Ω1/pOPINF/p3α1/pCambia2300
2.4 农杆菌介导的本氏烟草转化
序列确认的质粒通过电穿孔法转化农杆菌GV3101（Goldbio），使用Micropulser（BioRad；1.8 V；电容=250微法拉；电阻R=200欧姆）。细胞涂布于含适当抗生素的LB-琼脂平板，28°C培养48小时。单菌落转化通过菌落PCR确认。对于本氏烟草瞬时转化，转化的农杆菌单菌落接种于含适当抗生素的液体LB培养基，28°C、200 rpm过夜。细胞经4000 rpm离心收集，重悬于浸润培养基（10 mM MES，10 mM MgCl₂，100 μM乙酰丁香酮（现加），pH 5.7）至OD₆₀₀=1.0，28°C、200 rpm孵育1.5-2.5小时。多个基因构建共浸润时，各农杆菌溶液等体积混合。使用无针1 mL注射器从叶片背面浸润3-4周龄本氏烟草叶片。为增强表达，每个共浸润混合物中加入编码沉默抑制子P19的构建。前体定向生物合成中，转化后2-3天，将外源底物（用不含乙酰丁香酮的浸润培养基稀释至终浓度500 μM）浸润至转化叶片。全新生物合成中，转化叶片用补充1 mM KCl的浸润培养基浸润。瞬时转化植株保持在16小时光照/8小时黑暗光周期，20-24°C。农杆菌浸润后5天（产物形成达到平台期，SI Fig. 2），收获浸润叶片进行代谢物提取。大规模代谢物提取时，制备1 L农杆菌共浸润混合物。将装有共浸润混合物的烧杯置于真空干燥器中，植株倒置浸没其中。土壤用塑料圆盘覆盖以防止过量吸收共浸润液。施加两轮真空循环（真空30秒，释放10秒）。若浸润不完全，用无针1 mL注射器补充浸润叶片。2-3天后，使用真空浸润法浸润底物。
【数据】电转化参数：1.8 V，250 μF，200 Ω；浸润培养基：10 mM MES/10 mM MgCl₂/100 μM乙酰丁香酮，pH 5.7；OD₆₀₀=1.0；孵育：28°C、200 rpm、1.5-2.5 h；前体浓度：500 μM；KCl浓度：1 mM；收获时间：浸润后5天；光周期：16 h光照/8 h黑暗；温度：20-24°C
2.5 植物材料代谢物提取
采集的植物材料在液氮中速冻，用碳化钨珠在TissueLyser II（Qiagen）上研磨成细粉。液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-qTOF）分析中，组织样品（100 mg ± 10%）用500 μL甲醇（LC-MS级）提取。样品涡旋混匀，室温振荡孵育15分钟，随后台式离心机最大转速离心15分钟。上清液用PTFE滤膜（0.2 μm，Thermo Fisher Scientific）或PTFE滤板（0.4 μm，Thermo Fisher Scientific）过滤。样品保存于-20°C待分析。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析中，样品在液氮中速冻，用碳化钨珠在TissueLyser II（Qiagen）上研磨成细粉。植物材料用200 μL己烷提取，超声处理10分钟。样品最大转速离心15分钟，取100 μL上清液于-20°C保存待分析。大规模分离卤代HBOA-Glc时，收集的叶片在液氮中速冻，用电动锤磨机粉碎。植物组织用100%甲醇（3倍过量v/w）提取，室温搅拌30分钟。粗提液用两层Miracloth（Merck-Millipore）过滤两次。旋转蒸发仪减容，重悬于5 mL 60%甲醇/水。重悬提取液经固相萃取（SPE）处理，使用Oasis PRiME HLB 6 cc Vac Cartridge（Waters），流穿液于4°C保存供进一步化合物分离。
【数据】样品量：100 mg ± 10%；提取溶剂：500 μL甲醇（LC-MS级）/200 μL己烷；提取时间：15 min（室温振荡）/10 min（超声）；离心：最大转速15 min；滤膜：0.2 μm或0.4 μm PTFE；大提溶剂：100%甲醇（3倍过量v/w）；SPE柱：Oasis PRiME HLB 6 cc
2.6 LC-qTOF质谱分析
液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-qTOF）分析使用Thermo Scientific UltiMate 3000超高效液相色谱（UHPLC）系统耦合Impact II UHR-Q-ToF（超高效分辨率四极杆飞行时间）质谱仪（Bruker Daltonics），方法如前所述（Florean et al., 2023）。简要而言，化合物使用Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱（100 × 2.1 mm，2.6 μm；100 Å）在35°C下分离。含0.1%甲酸的水（A）和乙腈（B）作为流动相，流速0.3 mL/min，进样量2 μL。色谱分离程序：5% B保持1分钟，7分钟内升至50% B，100% B保持2.5分钟，5% B保持2.5分钟。质谱采集在负ESI模式下进行。毛细管电压-3500 V，端板偏移-500 V，雾化器压力2.0 bar，干燥气为氮气，温度250°C，流速10 L/min。采集在12 Hz下进行，m/z范围80-1000，数据依赖MS2模式，主动排除窗口1分钟。碰撞能量使用阶梯选项模式（20-50 eV）。使用甲酸钠-异丙醇溶液进行MS校准。非卤代BXD标准品配制成20 μM溶液（100%甲醇）。定量分析使用相同的色谱分离方法，但MS数据在全扫描模式下采集，采集频率5 Hz，m/z范围100-1000。BXD降解产物（BOAs）的分离按先前报道的方法进行（Thoenen et al., 2024）。简要而言，样品使用Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱（100 × 2.1 mm，2.6 μm；100 Å）在40°C下分析。含0.1%甲酸的水（A）和乙腈（B）作为流动相，流速0.6 mL/min，进样量2 μL。
【数据】色谱柱：Kinetex XB-C18（100 × 2.1 mm，2.6 μm；100 Å）；柱温：35°C（/40°C BOA分析）；流动相：0.1%甲酸水/乙腈；流速：0.3 mL/min（/0.6 mL/min BOA分析）；进样量：2 μL；ESI负模式；毛细管电压：-3500 V；雾化器压力：2.0 bar；干燥气：250°C、10 L/min；采集范围：m/z 80-1000（定量：m/z 100-1000）
研究结果
3.1 具有宽松底物特异性的BX酶鉴定——前体定向合成氯代与氟代BXD
为筛选适合生产多种卤代BXD的BX酶组合，研究人员测试了来自玉米（Z. mays）、A. squarrosa、L. galeobdolon、C. orientalis、S. dulcis和W. religiosa的22种已知BX酶对卤代BXD前体和途径中间体的底物混杂性。这些酶以不同组合在本氏烟草中瞬时表达，通过叶片浸润方式供给商业可得的氯代和氟代吲哚异构体（4-Cl-吲哚、5-Cl-吲哚、7-Cl-吲哚；7-Cl-吲哚啉-2-酮（7-Cl-I2O）；4-F-吲哚、5-F-吲哚、6-F-吲哚、7-F-吲哚）作为底物。酶逐步评估其将卤代吲哚分别转化为卤代3HI2O-Glc、HBOA-Glc、DIBOA-Glc和DIMBOA-Glc的能力。由于此前鉴定的BX2-3酶可将吲哚直接转化为3HI2O（Florean et al., 2023, 2025b），卤代I2O的生物合成未被监测；而是测定3HI2O-Glc的形成。TRIBOA-Glc因在LC-MS中离子化效率差未直接定量，但监测了其向DIMBOA-Glc的转化。由于卤代BXD标准品无法从商业渠道获得，卤代BXD通过高分辨质谱和MS2碎裂分析进行鉴定，以非卤代BXD标准品作对比。此外，选定的卤代HBOA-Glc异构体和DIBOA-Glc异构体要么从植物组织中分离，要么通过化学合成获得，并经NMR结构确认（SI Figs. 4-11），用作真实标准品。
ZmBx2和ZmBx3与ZmBx8、LgBx8共表达时，卤代吲哚底物向卤代3HI2O-Glc异构体的转化率高于AsBx2-3、LgBx2-3和CoBx2-3与ZmBx8、LgBx8共表达的组合（图2，SI Figs. 12和13）。
为探究细胞色素P450酶ZmBX2和ZmBX3为何优于FMO酶AsBX2-3、CoBX2-3和LgBX2-3，研究人员生成了结构模型，并与氯代和氟代吲哚及吲哚啉-2-酮（I2O）进行了对接模拟。分析显示FMO活性位点中并无明显的空间位阻可解释其对Cl-和F-取代吲哚类似物的较低活性（SI Fig. 14）。事实上，FMO酶的活性位点口袋似乎比P450酶更大。然而，FMO活性位点通常更为亲水，而P450活性位点含有更高比例的疏水残基，这可能有利于与卤代底物的相互作用（Shinada et al., 2019）。此外，P450酶较小的活性位点口袋可能将吲哚类似物更靠近血红素铁，从而促进羟基化反应（SI Fig. 14）。最后，P450酶更强的氧化能力可能进一步促进带有吸电子取代基（如卤素原子）底物的羟基化。ZmBX2和ZmBX3对所有测试底物表现出相似的底物转化效率（图2，SI Figs. 12和13），因此被选用于后续筛选。
随后，ZmBx8、LgBx8、ZmBx2和ZmBx3与ZmBx4、AsBx4、LgBx4、CoBx4、WrBx4或SdBx4共表达，评估卤代HBOA-Glc的形成。测试的BX4酶表现出不同的底物混杂性，但ZmBX4、CoBX4和WrBX4的组合能够生产在芳环所有位置氯代和氟代的HBOA-Glc（图2，SI Figs. 12和13）。之后，ZmBx8、LgBx8、ZmBx2、ZmBx3、ZmBx4、CoBx4和WrBx4与ZmBx5、AsBx5、LgBx5或CoBx5共表达，结果显示ZmBX5和LgBX5能高效生产7-Cl和8-Cl-DIBOA-Glc，以及6-F-DIBOA-Glc、7-F-DIBOA-Glc和8-F-DIBOA-Glc（图2，SI Figs. 12和13）。
为评估BX6和BX7酶的底物混杂性，ZmBx6、AsBx6、ZmBx7和AsBx7的不同组合与ZmBx8、LgBx8、ZmBx2、ZmBx3、ZmBx4、CoBx4、WrBx4、ZmBx5和LgBx5共表达。其中，ZmBX6、AsBX6和ZmBX7的组合成功生产了8-Cl-DIMBOA-Glc，以及6-F和8-F-DIMBOA-Glc（图2，SI Figs. 12和13）。
综上，BX酶筛选揭示ZmBX8、LgBX8、ZmBX2、ZmBX3、ZmBX4、CoBX4、WrBX4、ZmBX5、LgBX5、ZmBX6、AsBX6和ZmBX7的组合适合从不同位置卤代的吲哚底物生产多种卤代BXD异构体。使用该酶组合并向本氏烟草饲喂相应卤代吲哚前体后，定量了代表性卤代BXD，获得5.56 ± 2.27 μg/g鲜重（FW）的5-Cl-HBOA-Glc、22.9 ± 11.5 μg/g FW的5-F-HBOA-Glc、3.06 ± 0.898 μg/g FW的7-Cl-DIBOA-Glc、17.7 ± 2.29 μg/g FW的7-F-DIBOA-Glc、10.7 ± 5.67 μg/g FW的8-Cl-DIMBOA-Glc、1.39 ± 0.284 μg/g FW的6-F-DIMBOA-Glc和5.02 ± 3.17 μg/g FW的8-F-DIMBOA-Glc（SI Fig. 15）。
由于缺乏足量的卤代BXD真实标准品，定量基于相应的非卤代类似物进行。因此，所报告的浓度应视为近似值，因为卤素的存在可能影响质谱离子源中的电离效率。此外，使用非卤代标准品时，在较低稀释倍数下植物样品中基质效应明显（SI Fig. 16），导致检测到的标准品信号下降10-80%，具体取决于化合物和基质稀释水平。因此，上述卤代BXD的值可能被低估（SI Fig. 16）。平均而言，氟代吲哚比氯代吲哚更有效地掺入BXD产物中，产率往往更高。这可能是由于氟的原子半径比氯小，对吲哚类似物在酶活性位点口袋中结合的位阻干扰较小。然而，根据卤素取代基在吲哚芳环上的位置不同，掺入效率存在显著差异，这可能反映了卤素诱导的分子电子分布改变（SI Fig. 12）。
【数据】5-Cl-HBOA-Glc：5.56 ± 2.27 μg/g FW；5-F-HBOA-Glc：22.9 ± 11.5 μg/g FW；7-Cl-DIBOA-Glc：3.06 ± 0.898 μg/g FW；7-F-DIBOA-Glc：17.7 ± 2.29 μg/g FW；8-Cl-DIMBOA-Glc：10.7 ± 5.67 μg/g FW；6-F-DIMBOA-Glc：1.39 ± 0.284 μg/g FW；8-F-DIMBOA-Glc：5.02 ± 3.17 μg/g FW；基质效应导致信号下降：10-80%
3.2 本氏烟草中氯代BXD的从头生物合成
相比向本氏烟草浸润化学合成的卤代吲哚底物，通过卤化酶活性进行体内生物合成是更可持续的替代方案（Maurer et al., 1983）。尽管尚未鉴定出能够氟化吲哚或吲哚相关骨架的卤化酶，但已有多种吲哚特异性卤化酶被报道，可催化吲哚的氯化、溴化和碘化（Ismail et al., 2019; Neubauer et al., 2018, 2021; Sana et al., 2021）。然而，这些酶在吲哚吡咯环的C2和C3位进行卤代，从而阻断了BXD生物合成所必需的位置。另一种先前报道的在植物中从头生产卤代吲哚类似物的策略是使用细菌色氨酸卤化酶——这类酶卤代色氨酸的芳环，随后由细菌色氨酸酶将卤代色氨酸裂解为卤代吲哚（Fräbel et al., 2018）。
本研究采用了这一策略，使用多种色氨酸卤化酶，包括PyrH（来自 Streptomyces rugosporus 的色氨酸C5卤化酶）、ThdH（来自 S. albogriseolus 的色氨酸C6卤化酶）和RebH（来自 Lechevalieria aerocolonigenes 的色氨酸C7卤化酶）（Milbredt et al., 2014; Onaka et al., 2003; Schnepel and Sewald, 2017; Yeh et al., 2005; Zehner et al., 2005）（图3）。
由于据报道，在本氏烟草细胞质中表达色氨酸卤化酶而不搭配黄素还原酶时，往往只能形成痕量水平的卤代色氨酸（Fräbel et al., 2016），因此研究人员共表达了细菌黄素还原酶以确保辅因子供应。
通过共表达Bx基因组合（ZmBx2、ZmBx3、ZmBx4、CoBx4、WrBx4、ZmBx5、LgBx5、ZmBx8和LgBx8）与氯代吲哚生物合成模块，研究者在植物中实现了氯代HBOA-Glc和DIBOA-Glc的从头生产（图4）。该策略在植物体内成功生产了大量氯代BXD。
此外，氯代BXD可进一步转化为氯代苯并噁唑啉酮类似物——这类化合物具有药物相关性。研究还比较了从头生物合成与前体介导生物合成两种策略生产卤代DIBOA-Glc的效率（图5）。
【数据】卤化酶来源：PyrH（S. rugosporus C5）、ThdH（S. albogriseolus C6）、RebH（L. aerocolonigenes C7）；共表达模块：细菌色氨酸卤化酶+细菌FAD还原酶+细菌色氨酸酶
讨论与解读
本研究采用前体定向和从头组合生物合成两种策略，在植物底盘本氏烟草中生产卤代BXD。不同植物来源的BX酶对卤代BXD前体表现出不同的底物混杂性，使得多种氯代和氟代BXD的生物合成成为可能。通过选择高底物混杂性的BX酶并供给卤代吲哚类似物，成功合成了氯代和氟代的DIMBOA-Glc。在从头合成方面，将Bx基因与氯代吲哚类似物生物合成模块共表达，该模块包含三种细菌色氨酸卤化酶、一种细菌FAD还原酶和一种细菌色氨酸酶，实现了氯代吲哚中间体的植物体内生产及其向Cl-BXD的后续转化。然而，尽管前体定向生物合成中氟代吲哚的掺入效率通常高于氯代吲哚，氟代BXD的从头生产目前仍受限于缺乏能够卤代吲哚骨架的已鉴定氟化酶（图5）。由于色氨酸合成发生在叶绿体中，其向细胞质的输出（目前尚未鉴定到高效转运蛋白）可能构成瓶颈。
编译者解读：该研究展示了植物底盘在复杂卤代天然产物合成中的独特价值——利用植物内源酶系的底物混杂性，以"模块化共表达"策略绕过了化学卤代的选择性难题。将细菌卤化酶引入植物细胞并成功驱动氯代吲哚的体内供应，是合成生物学跨物种通路组装的一次漂亮示范。值得注意的是，氟代BXD的从头合成仍受限于氟化酶的缺乏，这提示卤代天然产物的生物合成版图尚待更多酶学工具的补充。定量中因缺乏卤代标准品而依赖非卤代类似物校准的做法，也提醒我们在解读绝对产量时需留有余地。总体而言，该平台为其他高价值卤代天然产物的绿色制造提供了可借鉴的技术路径。
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.04.007