来源：Alter codon bias of the P. pastoris genome to overcome a bottleneck in codon optimization strategy development and improve protein expression（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
密码子偏好性不仅影响翻译效率，还参与调控mRNA水平。传统基于密码子使用频率的优化策略在粗糙脉孢菌中效果显著，但在常用酵母表达宿主毕赤酵母中却收效甚微——原因在于毕赤酵母的偏好密码子富含AU，过度优化反而导致转录提前终止或RNA稳定性下降。本研究通过引入IPTG诱导的稀有tRNA表达系统，重塑毕赤酵母密码子偏好性图谱，使GC倾向性优化的报告基因蛋白产量提升4–5倍，为传统策略下表现不佳的基因提供了替代优化方案。
研究背景
密码子使用偏好性广泛存在于从细菌到真核生物的几乎所有基因组中，同义密码子并非以相同频率被使用（Grantham et al., 1980）。使用频率较高的密码子通常被定义为最优密码子，与更快的翻译速率相关。传统密码子优化策略即用最优密码子替换非最优密码子，以期获得更高的蛋白表达水平。除翻译速率外，密码子偏好性还被报道影响共翻译折叠——在大肠杆菌中，荧光素酶基因的同义密码子替换降低了蛋白可溶性并导致蛋白聚集（Rosano and Ceccarelli, 2009; Siller et al., 2010; Spencer et al., 2012）。这一调控作用在粗糙脉孢菌、蓝藻、果蝇及毕赤酵母等多种真核和原核生物中均得到证实（Fu et al., 2016; Lyu and Liu, 2020; Xu et al., 2013; Xu et al., 2021; Zhou et al., 2013）。近年来，密码子优化在转录层面的作用也引起关注。在粗糙脉孢菌和人类细胞系中，最优密码子富含GC，因此密码子优化会产生GC含量极高的序列，从而可能影响mRNA的稳定性与丰度。毕赤酵母作为异源蛋白表达的重要宿主，其密码子偏好性特征与传统优化策略之间存在固有矛盾，亟需新的解决思路。
研究方法
4.1 菌株与培养条件
大肠杆菌Top10菌株用于质粒构建与扩增，MG1655菌株作为野生型菌株。细胞在LB或LLB培养基中培养（含0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1.0% NaCl，LLB为0.5%），温度37°C。需要时向培养基中添加100 µg/mL氨苄青霉素或博来霉素（zeocin）。毕赤酵母GS115菌株作为野生型及构建转基因菌株的宿主。所有细胞均在220 rpm、30°C条件下振荡培养。种子制备时，将酵母细胞接种于YPD培养基（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）中培养至OD600达到6–8。随后将细胞以初始OD600 0.1重新接种至新鲜YPD培养基中，振荡培养约26小时至稳态。IPTG诱导时，在培养16小时后加入IPTG，继续诱导10小时。
【数据】大肠杆菌培养基：LB/LLB（0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1.0% NaCl，LLB为0.5%）；温度：37°C；抗生素：100 µg/mL氨苄青霉素或博来霉素；毕赤酵母培养基：YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）；转速：220 rpm；温度：30°C；种子OD600：6–8；接种初始OD600：0.1；培养时间：约26h；IPTG诱导：16h后加入，继续诱导10h
4.2 质粒构建与菌株生成
所有tRNA基因序列从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）获取，拷贝数汇总于表S1。设计的tRNA元件由Generay Biotech公司合成。LacI基因序列从大肠杆菌MG1655基因组PCR扩增获得，PAS_chr1–4_0616和PAS_chr4_0788的原始序列从毕赤酵母GS115基因组PCR扩增获得。luc原始序列从NCBI数据库获取并由Generay Biotech合成，所有密码子优化基因序列同样由该公司合成。tRNA及调控基因整合使用pGAPZα载体。两份拷贝的lacO₁O₂-tRNAIle UAU或其他稀有tRNA克隆在复制起点与GAP启动子之间。lacI开放阅读框插入GAP启动子之后，并在LacI的C端添加Myc标签以便后续检测和pull down。报告基因的ORF序列克隆入pPIC 8K载体的表达盒中，保留C端6×His标签。片段连接使用一步连接试剂盒（Vazyme）。每个最终构建体经AvrII（pGAPZα衍生物）或SalI（pPIC 8K衍生物）线性化后电穿孔导入GS115野生型菌株。pGAPZα衍生构建体在含博来霉素的平板上筛选阳性转化子，并通过PCR验证双拷贝转基因菌株；pPIC 8K衍生构建体在组氨酸缺陷平板上筛选阳性转化子，通过PCR验证单拷贝转基因菌株。构建底盘细胞时，采用CRISPR-Cas9方法（Liu et al., 2018）引入额外拷贝的lacI。两个插入位点位于TEF1和AOX1启动子上游100 bp处，lacI在强组成型启动子P0472（Xu et al., 2018）控制下表达。
【数据】载体：pGAPZα（tRNA/调控基因）、pPIC 8K（报告基因）；tRNA拷贝数：2拷贝lacO₁O₂-tRNAIle UAU或其他稀有tRNA；线性化酶：AvrII（pGAPZα衍生物）/SalI（pPIC 8K衍生物）；筛选标记：博来霉素（pGAPZα）/组氨酸缺陷（pPIC 8K）；lacI插入位点：TEF1和AOX1启动子上游100bp；启动子：P0472（强组成型）；标签：Myc（LacI C端）、6×His（报告基因C端）；连接试剂盒：Vazyme一步连接试剂盒
4.3 密码子优化
粗糙脉孢菌、人类和毕赤酵母的密码子使用频率从密码子使用数据库（http://www.kazusa.or.jp/codon/）下载。ω值和CAI值按Sharp和Li（1987）描述的方法计算。基于密码子使用频率的优化：ORF中每个密码子替换为其ω值最高的同义密码子（表S1，红色阴影）。部分GC优化：ORF中每个密码子按以下规则替换——对于具有2个同义密码子的氨基酸，选择富含GC的同义密码子；对于其他氨基酸，选择ω值最高的同义密码子。由于具有2个同义密码子的氨基酸其密码子频率差异通常小于其他氨基酸，部分GC优化旨在调整GC含量而不过度影响密码子翻译速率。GC倾向性优化：ORF中每个密码子替换为其富含GC的同义密码子（Phe-UUC, Leu-CUG, Ile-AUC, Val-GUG, Ser-UCG, Pro-CCG, Thr-ACG, Ala-GCC, Tyr-UAC, His-CAC, Gln-CAG, Asn-AAC, Lys-AAG, Asp-GAC, Gln-GAG, Cys-UGC, Arg-CGG, Gly-GGC）。密码子优化前后的基因序列GC含量经计算后列于表S2。
【数据】优化策略：频率优化（最高ω值替换）、部分GC优化（2同义密码子氨基酸选GC-rich）、GC倾向性优化（全部替换为GC-rich同义密码子）；GC含量变化：频率优化后约35%，GC倾向性优化后>60%（表S2）；ω/CAI计算：Sharp and Li (1987)方法
4.4 RNA半衰期与稳定性
对于酿酒酵母，mRNA半衰期数据来自Presnyak等人已发表的研究（Presnyak et al., 2015）。对于粗糙脉孢菌，thiolutin处理后0、40和120分钟的RNA-seq数据从NCBI数据库下载（Accession: SRX2251406, SRX2251407, SRX2251408）。质量控质后，reads通过Histat2比对到基因组，RNA稳定性以RNA水平变化率（RPKM/min）表示。RNA半衰期和稳定性数据包含在补充材料2中。
【数据】酿酒酵母mRNA半衰期数据来源：Presnyak et al., 2015；粗糙脉孢菌RNA-seq时间点：0、40、120 min；数据库编号：SRX2251406, SRX2251407, SRX2251408；比对工具：Histat2；RNA稳定性指标：RPKM/min
4.5 蛋白提取、SDS-PAGE与Western blot
酵母细胞离心收集，液氮研磨后进一步超声破碎。可溶性蛋白用蛋白提取缓冲液（20 mM磷酸钠、300 mM氯化钠、1 mM PMSF，pH 7.4）提取。蛋白浓度通过Bradford法测定（TIANGEN）。细胞核分离时，将2–3 g细胞粉末悬浮于1 mL缓冲液A（1 M山梨醇、7%聚蔗糖、20%甘油、5 mM醋酸镁、5 mM EGTA、3 mM氯化钙、3 mM DTT、50 mM Tris-HCl pH 7.5，含蛋白酶抑制剂），与2 mL缓冲液B（10%甘油、5 mM醋酸镁、5 mM EGTA、50 mM Tris-HCl pH 7.5，含蛋白酶抑制剂）混合。混合物铺于缓冲液AB混合液（1:1.7）上层，3000 g离心7分钟。上清液再铺于2.5 mL蔗糖密度梯度缓冲液（1 M蔗糖、10%甘油、5 mM醋酸镁、1 mM DTT、25 mM Tris-HCl pH 7.5，含蛋白酶抑制剂）上，15,000 g离心15分钟。上清收集为胞质组分，沉淀重新溶解为核组分。SDS-PAGE和Western blot按Zhou等人（2013）描述的方法进行。每孔上样等量总蛋白（50 µg）。电泳后将蛋白转移至PVDF膜并与抗体杂交。一抗为6×His标签抗体或Myc抗体（Beyotime），二抗为HRP偶联抗体（Beyotime）。目标蛋白条带通过化学发光显色，Image J软件定量强度。
【数据】蛋白提取缓冲液：20 mM磷酸钠、300 mM氯化钠、1 mM PMSF、pH 7.4；蛋白定量：Bradford法（TIANGEN）；核分离缓冲液A：1 M山梨醇、7%聚蔗糖、20%甘油、5 mM醋酸镁、5 mM EGTA、3 mM氯化钙、3 mM DTT、50 mM Tris-HCl pH 7.5；缓冲液B：10%甘油、5 mM醋酸镁、5 mM EGTA、50 mM Tris-HCl pH 7.5；缓冲液AB混合比例：1:1.7；离心1：3000 g、7 min；蔗糖梯度缓冲液：1 M蔗糖、10%甘油、5 mM醋酸镁、1 mM DTT、25 mM Tris-HCl pH 7.5；离心2：15,000 g、15 min；上样量：50 μg总蛋白；一抗：6×His/Myc抗体（Beyotime）；二抗：HRP偶联（Beyotime）
4.6 荧光测定
荧光素酶活性测定：细胞内蛋白按上述方法提取。取500 µg总蛋白，用Bio-Lumi™试剂盒（Beyotime）检测荧光素酶活性，通过Microplate Luminometer（BioTek）测定560 nm处荧光值。
【数据】检测总蛋白量：500 μg；试剂盒：Bio-Lumi™（Beyotime）；检测波长：560 nm；仪器：Microplate Luminometer（BioTek）
4.7 RNA提取、实时PCR与Northern blot
酵母细胞离心收集，液氮研磨。总RNA用TRIzol试剂（Invitrogen）提取，RNA浓度用NanoDrop微量分光光度计测定。实时PCR时，取1 µg总RNA进行cDNA合成（BeyoRT™ III cDNA合成试剂盒含gDNA EZeraser，Beyotime），随后进行定量PCR（SYBR Green，Mei5bio）。实时PCR程序设置如下：步骤1，95°C 5分钟；步骤2，58°C 30秒；步骤3，72°C 30秒，重复步骤1–3共30个循环；步骤4，72°C 2分钟。报告基因以gapdh为内参，tRNA以5S rRNA为内参。Northern blot时，取10 µg总RNA与RNA上样缓冲液混合，95°C煮沸5分钟，立即冰上冷却5分钟。样品上样至含0.5 g/mL尿素的6% PAGE凝胶（Acr:Bis = 19:1，无核酸酶）。检测tRNA水平使用常规凝胶（7.5 × 8.3 × 0.1 cm³）。检测tRNA氨酰化率时使用测序凝胶（58 × 17 × 0.04 cm³）。此外，所有RNA提取和电泳缓冲液均调至酸性pH 5以避免脱氨基。脱氨基对照通过将RNA样品在100 mM Tris-HCl（pH = 9）中孵育30分钟获得。电泳（常规凝胶300 V、0.5小时；测序凝胶500 V、24小时）后，RNA通过半干转移（BioRad）转移至Hybond-N+膜。膜经UV交联后与生物素标记的DNA探针（Generay）杂交。
【数据】cDNA合成用量：1 μg总RNA；PCR程序：95°C 5min→（58°C 30s→72°C 30s）×30循环→72°C 2min；内参基因：gapdh（报告基因）/5S rRNA（tRNA）；Northern blot上样量：10 μg总RNA；凝胶：6% PAGE（Acr:Bis=19:1，含0.5 g/mL尿素）；常规凝胶尺寸：7.5×8.3×0.1 cm³；测序凝胶尺寸：58×17×0.04 cm³；电泳条件：常规300V/0.5h，测序500V/24h；缓冲液pH：5（酸性）；脱氨基对照：100 mM Tris-HCl pH=9孵育30min；探针：生物素标记DNA探针（Generay）
研究结果
2.1 高GC含量支持毕赤酵母mRNA丰度
研究者首先聚焦于具有不同GC密码子偏好性的两种基因组——酿酒酵母和粗糙脉孢菌。基于已发表研究（Presnyak et al., 2015; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）的数据，分析每个基因组中GC含量与RNA周转率之间的相关性。总mRNA根据GC含量分为十组，计算每组的平均半衰期或相对RNA稳定性。有趣的是，在两种基因组中，GC含量较高的基因往往具有更长的半衰期（图1A）或更高的RNA稳定性（图1B）。
随后选择异源基因——萤火虫荧光素酶（luc）作为研究对象，考察毕赤酵母中基于密码子使用频率的优化和GC倾向性优化对mRNA丰度的影响。基于密码子频率优化后GC含量降至约35%，而GC倾向性优化后GC含量升至60%以上（表S2）。荧光素酶活性测定和Western blot显示，基于密码子频率的优化几乎完全消除了荧光素酶的产生（图S1；图1C，上&中）。这与优化后mRNA水平的大幅降低一致（图1C，下），可能由与A/U富集稀有密码子相关的转录提前终止所致。有趣的是，GC倾向性优化能显著提升luc mRNA水平（图1C，下），但仍未能高效产生蛋白——很可能是因为这些GC富集密码子的翻译速率较差。
除luc外，此前对若干内源基因（PAS_FragD_0013、PAS_chr1–1_0135、PAS_chr1–4_0616和PAS_chr4_0788）的研究也显示不理想的结果——基于密码子频率优化后蛋白水平没有显著提升（Liu et al., 2021）。部分候选基因（0616和0135）优化后mRNA水平显著下降，其他基因（0013和0788）的mRNA水平仅略有增加。研究者随后选择0616和0788来研究不同优化方式对mRNA丰度的影响。如图1D&E所示，使用部分次优但富含GC的密码子进行部分GC优化并未显著改变mRNA丰度。GC倾向性优化显著提升了mRNA水平，但最终蛋白产量仍受限于GC富集密码子的低翻译速率。
基于上述结果，GC富集密码子在毕赤酵母中对mRNA丰度具有正向支持作用。若其翻译效率也能同步提升，则有望结合转录与翻译双重优势，超越传统密码子优化策略。提高密码子翻译速率的一个有效途径是增加相应tRNA拷贝数，但这些"额外"tRNA的表达需要受到良好控制，以尽量减少对细胞生长和代谢的影响。
【数据】酿酒酵母/粗糙脉孢菌：高GC含量基因半衰期更长/RNA稳定性更高；luc频率优化后GC含量：约35%；luc GC倾向性优化后GC含量：>60%；luc频率优化：蛋白几乎不表达、mRNA水平大幅降低；luc GC倾向性优化：mRNA水平显著升高但蛋白产量仍低；0616/0135频率优化后mRNA显著下降；0013/0788频率优化后mRNA仅略增；部分GC优化：mRNA丰度变化不大；GC倾向性优化：mRNA显著升高
2.2 IPTG诱导tRNA元件的构建
tRNA基因带有基因内组成型启动子，在不改变tRNA序列的情况下难以调控其表达。为解决此问题，研究者基于大肠杆菌lac操纵子系统设计了IPTG诱导的tRNA元件。如图2A（设计#1）所示，lacO₁序列插入tRNA基因正上游。在LacI共表达时，LacI在lacO₁位点的结合预计会阻断RNA聚合酶III进入。加入IPTG会导致LacI解离并恢复转录。该元件被命名为lacO₁-tRNA，首先尝试了tRNAIle UAU来测试此设计。四拷贝lacO₁-tRNAIle UAU与lacI阻遏蛋白基因一起整合入野生型菌株GS115基因组，构建转基因菌株GSI-lacO₁tRNAIle UAU。SV40 NLS（Harreman et al., 2004）添加在LacI的N端以促进其核定位（图S2A）。
随后进行实时PCR和Northern blot比较有无IPTG诱导时tRNAIle UAU的水平。如图S2B&C所示，即使在无IPTG诱导的情况下，转基因菌株中tRNAIle UAU水平也比野生型高出4倍以上。通过ChIP检测LacI在lacO₁位点的结合（图S2D），显示比gapdh位点对照富集3–4倍。推测lacO₁单独不足以阻断tRNA转录，该设计需要进一步优化。
大肠杆菌lac操纵子共包含三个lacO序列。除常用的lacO₁外，lacO₂和lacO₃也能结合LacI（Fulcrand et al., 2016）。因此，在设计#1的基础上，在tRNA序列下游（poly-T终止子之后）额外插入lacO₂（图2A，设计#2）。在此设计中，LacI蛋白预计同时结合lacO₁和lacO₂，形成DNA环并进一步阻断RNA聚合酶III的进入。携带四拷贝lacO₁O₂-tRNAIle UAU的转基因菌株GSI-lacO₁O₂tRNAIle UAU经实时PCR和Northern blot检测，结果显示无IPTG诱导时tRNAIle UAU水平与野生型相当（图2B&C）。IPTG成功诱导tRNAIle UAU表达，在2 mM浓度时达到最高水平。因此，后续诱导均选用此浓度。ChIP检测显示，无IPTG时LacI在lacO₁和lacO₂位点的结合相当稳健（比gapdh位点对照高8–10倍），但IPTG诱导后结合显著减弱（图2D）。为确保lacO₁O₂插入不影响tRNA上的氨基酸负载，研究者运行测序凝胶检查lacO₁O₂-tRNAIle UAU的氨基酸负载率。结果显示，从lacO₁O₂-tRNAIle UAU表达的tRNA其负载率与内源tRNAIle UAU相当（图2E）。
【数据】设计#1（仅lacO₁）：无IPTG时tRNAIle UAU已比野生型高>4倍；ChIP富集：lacO₁位点比gapdh对照高3–4倍；设计#2（lacO₁O₂）：无IPTG时tRNAIle UAU水平与野生型相当；IPTG最佳诱导浓度：2 mM；IPTG诱导后LacI结合：lacO₁和lacO₂位点比gapdh对照高8–10倍（无IPTG），诱导后显著减弱；tRNA负载率：与内源相当
2.3 密码子偏好性工程化毕赤酵母底盘细胞的构建
IPTG诱导tRNA的设计随后扩展到其他稀有tRNA，以构建对GC富集密码子友好的底盘细胞。对于具有两个同义密码子的氨基酸，GC富集密码子的tRNA拷贝数实际可接受（表S1）。因此，研究者聚焦于其他氨基酸，选择了六种稀有tRNA：tRNAArg CCG、tRNAPro CGG、tRNASer CGA、tRNAThr CGU、tRNAVal CAC、tRNALeu CAG。这些稀有tRNA被构建为IPTG诱导型tRNA元件，以每样四拷贝整合入野生型菌株GS115基因组，同时携带lacI阻遏蛋白基因。以tRNAThr CGU、tRNAVal CAC和tRNAArg CCG为代表，转基因菌株GSI-lacO₁O₂tRNAs中稀有tRNA水平成功提升了4–6倍（图S3A-D）。然而，IPTG调控再次失效——很可能是由于tRNA与lacI比例增加，削弱了LacI在靶位点的结合（图S3E）。
随后通过CRISPR-Cas9方法再次向基因组引入两份额外的lacI基因拷贝（见材料与方法）。结果显示，IPTG对tRNA表达的调控大幅恢复（图3A-D），LacI在lacO₁和lacO₂位点的结合也得到加强（图3E）。转基因菌株GSIII-lacO₁O₂tRNAs随后被命名为密码子偏好性工程化底盘细胞，用于评估若干报告基因的表达谱。
【数据】稀有tRNA种类：tRNAArg CCG、tRNAPro CGG、tRNASer CGA、tRNAThr CGU、tRNAVal CAC、tRNALeu CAG；整合拷贝数：每种4拷贝；GSI-lacO₁O₂tRNAs中稀有tRNA提升倍数：4–6倍；IPTG调控失效原因：tRNA与lacI比例增加；额外lacI拷贝数：2份（CRISPR-Cas9）；调控恢复后菌株名称：GSIII-lacO₁O₂tRNAs
2.4 三种报告基因在底盘细胞中的表达谱
无IPTG时底盘细胞的生长速率与野生型GS115相当，IPTG诱导后略低（图4A）。这可能是过表达稀有tRNA对生长相关蛋白合成造成竞争所致。研究者再次选择一种异源基因（luc）和两种内源基因（PAS_chr1–4_0616和PAS_chr4_0788）作为报告基因来测试底盘细胞的功能。GC倾向性优化的基因序列在底盘细胞中表达，相应的RNA、蛋白活性/水平与野生型中原始序列进行比较。
【数据】底盘细胞生长：无IPTG时与野生型相当，IPTG诱导后略低；报告基因：luc（异源）、PAS_chr1–4_0616和PAS_chr4_0788（内源）；表达方式：GC倾向性优化序列在底盘细胞中表达，与野生型中原始序列比较
2.5 底盘细胞中报告基因的蛋白水平
【数据】luc和0788在底盘细胞中蛋白产量提升4–5倍（原文摘要数据，此处对应结果部分）
讨论与解读
本研究验证了一种在毕赤酵母中协调GC富集密码子转录与翻译优势的策略。通过构建IPTG调控的tRNA元件并人工引入额外tRNA基因拷贝，成功提高了这些密码子的翻译效率。多种报告基因验证表明，底盘细胞中的GC倾向性优化策略相比野生型细胞中的传统密码子频率优化策略，能产生显著更高的荧光或蛋白水平。就提升倍数而言，底盘细胞对luc和0788的效果优于0616——这与GC富集序列带来的mRNA水平提升倍数一致（图1；图5），表明密码子优化带来的RNA水平变化是最终蛋白产量的重要贡献因素，这与多项已发表研究相符（Zhao et al., 2021; Zhou et al., 2016）。就底盘细胞而言，IPTG诱导还可作为开启重组蛋白表达的潜在开关，尽管无IPTG时存在少量泄漏表达。此外，底盘细胞的效率可通过引入更多tRNA基因拷贝进一步提升，但这可能反过来削弱IPTG开关的严密性，需要进一步改进。除IPTG开关外，还可尝试其他化学诱导开关来调控tRNA表达，如fapO/FapR系统。
编译者解读： 本研究巧妙地将"密码子优化"从序列层面的单向操作升级为"宿主-序列"协同工程——通过可诱导的tRNA补充系统主动重塑宿主密码子偏好性，使原本因GC富集而翻译受限的mRNA获得高效翻译支持。这种思路对合成生物学有重要启示：表达系统的优化不应只盯着编码序列，宿主的翻译基础设施同样值得工程化改造。IPTG诱导开关的引入也为工业发酵中"先长菌后产蛋白"的两阶段策略提供了便利。不过，底盘细胞在无诱导剂时仍存在泄漏表达，且额外lacI拷贝和tRNA基因的基因组整合可能带来遗传稳定性问题，这些在实际应用中需进一步权衡。
参考来源
Zhang S. Alter codon bias of the P. pastoris genome to overcome a bottleneck in codon optimization strategy development and improve protein expression. Microbiological Research, 2024. DOI: 10.1016/j.micres.2024.127629
DOI: 10.1016/j.micres.2024.127629