来源：De novo biosynthesis of daptomycin through module construction and assembly in Escherichia coli（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
达托霉素（DAP）是由玫瑰孢链霉菌产生的非核糖体肽抗生素，传统发酵周期长、工艺繁琐。本研究对73.8 kb的dpt生物合成基因簇进行理性设计与重构，将其优化为55.4 kb后拆分为三个模块，分别克隆至pET28a载体，共转化大肠杆菌BL21(DE3)实现异源表达。通过密码子优化、基因拷贝数调整、翻译效率改造及发酵条件优化，最终在5 L生物反应器中获得307.60 μg/L的达托霉素产量，首次实现了模块化肽合成酶在大肠杆菌中的全新异源生物合成。
研究背景
链霉菌是天然产物的丰富来源，其代谢产物已被开发为抗生素、抗真菌药、抗病毒药、免疫抑制剂和抗癌药物等多种药物。非核糖体肽（NRPs）作为链霉菌次级代谢产物的重要类别，具有广泛的药用价值。然而，链霉菌漫长的发酵周期严重制约了天然产物的工业化生物合成，且NRPs的结构复杂性极大限制了其化学全合成。近年来，随着大量NRP生物合成途径被阐明，在工程化微生物底盘中进行异源表达已成为颇具前景的替代策略。
大肠杆菌凭借生长迅速、遗传操作工具丰富、蛋白表达能力强、能够合成代谢前体等优势，被广泛用作多种天然产物的异源表达宿主。本研究针对达托霉素生物合成基因簇进行理性重构与模块化组装，探索在大肠杆菌中实现该复杂非核糖体肽全新生物合成的可行性。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株和质粒分别列于表S1和表S2。大肠杆菌菌株在添加适当抗生素的Luria-Bertani（LB）肉汤或琼脂中培养，温度为37°C或30°C。玫瑰孢链霉菌NRRL 11379在MYG培养基中、30°C条件下培养48小时，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（CWBIO，北京，中国）提取基因组DNA。
【数据】菌株：大肠杆菌、玫瑰孢链霉菌NRRL 11379；培养基：LB、MYG；温度：37°C或30°C；时间：48h
2.2 DAP模块表达质粒的构建
DAP模块表达载体使用ClonExpress II一步克隆试剂盒（Vazyme，南京，中国）构建。本研究所用寡核苷酸均委托擎科生物技术有限公司（成都，中国）合成，列于表S3。将dpt基因簇分为三个模块进行扩增，每个模块进一步分为若干片段，每个片段包含40 bp同源臂，用于ExoCET重组克隆。PCR扩增使用2 × Phanta Flash Master Mix（Vazyme，南京，中国），按照制造商说明书操作。
【数据】同源臂长度：40 bp；PCR聚合酶：2 × Phanta Flash Master Mix
2.3 通过T4 DNA聚合酶体外组装与电穿孔进行dpt簇组装
纯化的DNA片段在体外用T4 DNA聚合酶（M0203S，NEB）进行组装。组装反应在0.2 mL PCR管中进行，每个DNA片段取200 ng，加入1.3 μL T4 DNA聚合酶，然后在热循环仪中执行以下温度程序：25°C孵育1小时，75°C孵育20分钟，最后保持于4°C。反应产物使用MF-Millipore（VSWP02500，Millipore）0.025 μm MCE混合纤维素酯亲水膜在室温下脱盐40分钟，以备后续电穿孔。取20 μL反应产物加入40 μL电感受态细胞中，将混合物转移至1 mm电转杯（1652093，BIO-RAD）。电穿孔条件为1,350 V、10 μF、600 Ω，使用Eppendorf Electroporator 2510电转仪。电穿孔后立即向电转杯中加入1 mL新鲜LB培养基。将混合物转移至1.5 mL离心管中，于37°C孵育1–2小时。9,500 rpm离心1分钟后弃去上清，细胞与100 μL LB培养基混匀后涂布于LB琼脂平板。LB琼脂平板倒置，于37°C过夜培养直至出现单菌落。
【数据】T4 DNA聚合酶用量：1.3 μL；DNA片段量：200 ng/片段；温度程序：25°C 1h→75°C 20min→4°C；脱盐：室温40min；电穿孔条件：1,350 V、10 μF、600 Ω；孵育：37°C 1–2h；离心：9,500 rpm 1min
2.4 重组质粒的验证
挑取单菌落接种于5 mL LB培养基中，37°C过夜培养。使用GoldHi质粒小提试剂盒（CWBIO，北京，中国）从培养物中提取质粒，用适当的限制性内切酶酶切3小时。酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，将所得酶切图谱与SnapGene软件（版本6.2.1）生成的分析结果比对，筛选组装正确的质粒。
【数据】酶切时间：3h；琼脂糖凝胶浓度：0.8%；分析软件：SnapGene 6.2.1
2.5 实时荧光定量PCR与反转录PCR
在发酵过程中分别于3、9和33小时从500 mL摇瓶中收集大肠杆菌。利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定dpt簇成员（包括dptP、dptM、dptN、dptE、dptF、dptA、dptBC、dptD、dptG、dptH、dptI和dptJ）的转录水平。使用Trizol（15596026，Thermo）提取总RNA。DNA去除和反转录使用HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，南京，中国），按制造商说明书操作。实时荧光定量PCR在CFX Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad）上进行，使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Vazyme，南京，中国）。所用寡核苷酸列于表S3。内参基因为编码D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gapA基因。DAP生物合成基因的表达水平以内部对照进行归一化。数据使用Bio-Rad CFX Maestro 3.0（Bio-Rad）进行分析。
【数据】取样时间点：3、9、33h；内参基因：gapA；分析软件：Bio-Rad CFX Maestro 3.0
2.6 模块1和模块3的重构
为提高DAP生物合成酶的翻译效率，对模块1和模块3进行了重构：在每个基因前插入核糖体结合位点（RBS），并优化起始密码子。包括dptM、dptN、dptE、dptF、dptG、dptH、dptI和dptJ在内的基因使用2 × Phanta Flash Master Mix进行扩增。起始密码子ATG和RBS通过引物突变方式引入。随后，两个基因盒（RBS-dptM-RBS-dptN-RBS-dptE-RBS-dptF-RBS和RBS-dptG-RBS-dptH-RBS-dptI-RBS-dptJ）通过ExoCET分别克隆至pET28a-Amp载体和pET28a-Apr载体，生成pDAP-U1a和pDAP-U3a。
【数据】插入元件：RBS + 优化起始密码子；载体：pET28a-Amp、pET28a-Apr；构建产物：pDAP-U1a、pDAP-U3a
2.7 摇瓶中的DAP生物合成
大肠杆菌中DAP的生产在Terrific Broth（TB）培养基中进行，温度37°C，摇床转速220 rpm。将20 mL种子培养物接种至含500 mL TB培养基的2 L摇瓶中，在16°C下以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导DAP生产，诱导时OD600为0.6–0.8，诱导时间48小时。玫瑰孢链霉菌NRRL 11379先在固体MS培养基上、30°C培养5天以获得孢子用于发酵。种子培养：将1 × 10⁷个孢子接种至含50 mL MYG液体培养基的250 mL摇瓶中，30°C、220 rpm振荡培养48小时。随后，以5%（v/v）接种量将种子培养物转移至500 mL发酵培养基中（0.144 g/L KH₂PO₄、9 g/L NaCl、1.06 g/L Na₂HPO₄·12H₂O、40 g/L糊精、8 g/L葡萄糖、10 g/L酪蛋白、2.5 g/L酵母提取物和0.5 g/L MgSO₄·7H₂O）。发酵在30°C、220 rpm搅拌条件下进行7天。发酵48小时后进行补料，每12小时向培养物中添加1 mL癸酸钠（0.1 g/mL）。大肠杆菌和玫瑰孢链霉菌NRRL 11379发酵结束后，离心收集培养基上清，细胞沉淀用50 mL ddH₂O重悬，使用超高压均质机破碎。裂解混合物离心去除细胞碎片。将总计550 mL培养混合物调至pH 5.0，用1/4体积的正丁醇萃取30分钟，重复萃取三次后收集有机相。有机相溶剂在旋转蒸发仪上蒸干，粗提物溶于5.5 mL甲醇中，经0.22 μm滤膜过滤后进行UPLC-MS/MS分析。
【数据】培养温度：37°C（大肠杆菌）；转速：220 rpm；诱导温度：16°C；IPTG浓度：梯度（原文未详述具体数值）；诱导OD600：0.6–0.8；诱导时间：48h；孢子接种量：1×10⁷；种子培养：30°C、220 rpm、48h；接种量：5%（v/v）；发酵培养基组分：0.144 g/L KH₂PO₄、9 g/L NaCl、1.06 g/L Na₂HPO₄·12H₂O、40 g/L糊精、8 g/L葡萄糖、10 g/L酪蛋白、2.5 g/L酵母提取物、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O；发酵时间：7天；补料：每12h添加1 mL癸酸钠（0.1 g/mL）；萃取pH：5.0；萃取剂：1/4体积正丁醇；萃取时间：30min×3次；粗提物溶剂：5.5 mL甲醇；滤膜：0.22 μm
2.8 DAP生产质粒的稳定性验证
发酵结束后，取1 μL菌液涂布于不含抗生素的LB琼脂上，37°C过夜培养。随后将单菌落平行划线于不含抗生素的LB琼脂和含50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL氨苄青霉素和25 μg/mL安普霉素的LB琼脂上。37°C培养16小时后，通过比较实验组和对照组的菌落形成效率来评估质粒稳定性。
【数据】抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素50 μg/mL、安普霉素25 μg/mL；培养时间：16h；温度：37°C
2.9 大肠杆菌总蛋白提取
发酵16小时后收集3 mL菌液，4°C、4,000 ×g离心15分钟，细胞沉淀用1 mL冰预冷裂解缓冲液（20 mM Na₃PO₄、500 mM NaCl、0.5 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐、10%甘油）重悬，并添加1 mM苯甲基磺酰氟。悬液置于冰上，使用探头超声破碎仪进行超声破碎。细胞碎片通过4°C、15,000 ×g高速离心45分钟去除。含蛋白的上清液用无菌移液管吸取，用于后续SDS-PAGE分析。
【数据】菌液量：3 mL；离心：4,000 ×g、4°C、15min；裂解缓冲液：20 mM Na₃PO₄、500 mM NaCl、0.5 mM TCEP、10%甘油；PMSF：1 mM；高速离心：15,000 ×g、4°C、45min
2.10 5 L生物反应器中的DAP生产
挑取单菌落接种至含100 mL LB培养基的500 mL摇瓶中，培养基添加50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL氨苄青霉素、25 μg/mL安普霉素和50 μg/mL氯霉素，37°C培养……
【数据】抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素50 μg/mL、安普霉素25 μg/mL、氯霉素50 μg/mL；培养温度：37°C
2.11 生物信息学分析
（原文此部分内容未在节选范围内完整呈现）
研究结果
3.1 dpt簇的模块设计与模块表达质粒的构建
73.8 kb的dpt簇包含编码DAP的生物合成基因，以及转录因子（TFs）dptR1和dptR2和若干功能未知的基因（图1A）。已知TFs通过结合链霉菌启动子区域来增强或抑制dpt簇的转录，从而调控DAP的生物合成。由于来自玫瑰孢链霉菌的TFs无法识别大肠杆菌生产系统中的T7启动子，因此来自玫瑰孢链霉菌的调控基因对于DAP在大肠杆菌中的异源表达是不必要的。此外，DAP生物合成途径包含10.6 kb功能未知的基因，这些基因不直接参与DAP生物合成，可在生产系统中删除。因此，研究者从原始dpt簇中删除了7.8 kb的TFs（dptR1、dptR2）和其他不必要的10.6 kb序列（图1B），获得缩短的55.4 kb dpt簇，用于转化大肠杆菌生产DAP。
为克服原核表达载体的装载容量限制，实现55.4 kb dpt簇在大肠杆菌中的高效异源重组重构，研究者采用了模块化克隆策略。将基因簇理性划分为三个独立的转录单元：DAP-U1（23.2 kb）、DAP-U2（22.1 kb）和DAP-U3（10.1 kb），分别独立克隆至高拷贝数pET28a表达载体中（图1B）。随后通过ExoCET介导的同源重组在大肠杆菌中组装这些模块，成功重构完整的DAP生物合成途径，实现DAP的全新生物合成。
为克隆三个模块，必须对pET28a载体进行改造，替换其他抗性基因以便于重组菌落的筛选（图1C）。首先构建了两个pET28a衍生载体（pET28a-Amp和pET28a-Apr），将pET28a载体的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素和安普霉素抗性基因。在模块DAP-U1中，由于dptP基因的转录方向与其他基因相反，dptP通过同源重组预先连接到pET28a-Amp上，获得载体pET28a-dptP，确保dptP由T7启动子驱动（图1C）。随后，DAP-U1、DAP-U2和DAP-U3分别克隆至pET28a-dptP、pET28a和pET28a-Amp载体中。每个模块的基因盒由T7启动子、lac操纵基因、RBS和若干DAP生物合成基因组成，形成由T7启动子驱动、受lac操纵基因控制的操纵子。三个基因盒——（T7-RBS-dptP-dptM-dptN-dptE-dptF-dptA、T7-RBS-dptBC和T7-RBS-dptD-dptG-dptH-dptI-dptJ）——共转化大肠杆菌，在后续操作中共表达所有DAP生物合成基因（图1D、F和H）。
表达模块pDAP-U1包含六个基因：dptP、dptM、dptN、dptE、dptF和dptA，负责识别和激活癸酸，以及合成DAP的前五个氨基酸（图S2）。此外，该模块还包含促进DAP从胞内转运至胞外的转运蛋白。为构建pDAP-U1，将模块DAP-U1分为七个片段，通过ExoCET克隆至pET28a-dptP中（图1D）。鉴于ExoCET介导组装过程中连接位点可能发生错误组装，研究者实施了严格的验证策略以确保质粒完整性。为便于高效筛选正确组装的构建体，针对pDAP-U1载体采用了系统化引物设计方法——设计了八对双向引物覆盖关键连接区域，每个扩增子（A1-A8）覆盖组装连接点两侧约500 bp的序列（图1D）。这种全面覆盖能够精确验证所有工程质粒的保真度和序列连续性。对大肠杆菌克隆进行扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，在总共11个泳道中，第4、5、7和8泳道的所有位点均成功扩增，成功率为36.4%。随后的Sanger测序验证确认了这些目标位点的扩增特异性和序列完整性（图S3A）。
表达模块pDAP-U2仅包含dptBC基因，负责合成DAP的第6至第11个氨基酸（图S2）。为克隆pDAP-U2，同样将dptBC分为七个片段，通过ExoCET插入pET28a中（图1F）。同样为pDAP-U2设计了八对引物（B1-B8）以验证连接位点的准确性（图1F）。琼脂糖凝胶电泳分析表明，在十个实验样品中，第1、2和7泳道的所有目标位点均实现完全扩增，总体成功率为30%。Sanger测序验证了这些扩增产物的PCR扩增特异性和目标区域序列完整性（图1G和S3B）。
模块pDAP-U3包含基因dptD、dptG、dptH、dptI和dptJ，负责合成MeGlu和犬尿氨酸（kyn），以及DAP的最后两个氨基酸（图S2）。此外，DAP-U3模块催化苏氨酸和犬尿氨酸缩合形成环肽。需要指出的是，dptG和dptH已被赋予特定的生物合成活性，删除dptG和dptH会显著影响……
【数据】原始dpt簇大小：73.8 kb；删除TFs：7.8 kb（dptR1、dptR2）；删除未知功能序列：10.6 kb；优化后dpt簇：55.4 kb；模块划分：DAP-U1 23.2 kb、DAP-U2 22.1 kb、DAP-U3 10.1 kb；pDAP-U1组装成功率：36.4%（4/11）；pDAP-U2组装成功率：30%（3/10）；扩增子覆盖：连接点两侧约500 bp
3.2 （对应原文3.2节内容，涉及DAP原核生产的定量检测）
【数据】原文未详述
3.3 （对应原文3.3节内容，涉及稳定DAP生产系统的构建）
【数据】原文未详述
3.4 （对应原文3.4节内容，涉及DAP生产系统的优化与产物检测）
【数据】原文未详述
3.5 （对应原文3.5节内容，涉及DAP发酵条件的优化）
【数据】IPTG浓度梯度：20 μM–1000 μM；检测波长：600 nm；培养基：TB
【数据】原文未详述
讨论与解读
野生型生产菌株中次级代谢物的产量普遍较低，主要原因是其生物合成基因簇的转录水平较低。此外，许多天然产物的野生型生产菌难以培养，这阻碍了具有生物活性的天然产物的工业化生产。NRPs是具有显著药物活性的重要天然产物，部分NRPs已在替代宿主中实现异源生产以获得高产量。合成生物学为生物合成基因簇的理性重构提供了工程学原则，可在无调控干扰的条件下优化基因转录。天然产物基因簇的克隆对于异源生物合成至关重要。
本研究采用高保真的ExoCET技术构建了快速高效合成临床重要抗生素DAP的平台。基因簇和操纵子的设计策略与早期将模块化聚酮合酶和非核糖体肽合成酶途径引入异源宿主的方法类似。生物合成基因簇中基因的低转录水平可能是低产量次级代谢物的普遍现象。为提高dpt簇的表达，研究者对其进行了设计和改造，将55.4 kb的dpt簇置于强启动子T7的控制之下……
编译者解读
本研究展示了合成生物学中"设计-构建-测试-学习"循环的典型应用——面对73.8 kb的大型NRPS基因簇，通过理性删减非必需基因、模块化拆分与ExoCET组装，成功突破了原核表达载体的装载限制。尤为值得关注的是对dptBC基因高度重复密码子的优化和拷贝数调整，这体现了合成生物学对基因稳定性与表达水平之间平衡关系的深刻理解。从应用价值看，在大肠杆菌中实现DAP的全新生物合成，为其他结构复杂NRPs的工程化生产提供了可借鉴的技术范式。不过，307.60 μg/L的产量距离工业化仍有较大差距，未来需要结合蛋白质工程、代谢流调控和发酵工程等多层次策略进一步提升。
参考来源
Liu X. De novo biosynthesis of daptomycin through module construction and assembly in Escherichia coli. Chemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.cej.2025.165182
DOI: 10.1016/j.cej.2025.165182