来源：Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of myo-Inositol and D-chiro-Inositol（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-手性肌醇（DCI）是人体糖脂代谢与类固醇合成中的关键信号分子，在改善代谢紊乱方面具有重要价值。本研究以谷氨酸棒杆菌为底盘，通过动态调控糖酵解与磷酸戊糖途径的碳流分配、过表达DCI合成关键酶、强化非PTS葡萄糖转运磷酸化系统、增强NAD(H)辅因子供给及优化发酵培养基等多层次代谢工程策略，最终获得产DCI达3.39 g/L的工程菌株DPaZbNMh-3，为目前报道的微生物从头合成DCI最高水平。
研究背景
肌醇是一类环己六醇化合物，存在九种立体异构体，其中肌醇（MI）、D-手性肌醇（DCI）和鲨肌醇在生物体内最为常见且具有重要生物学意义。MI与DCI可在NAD/NADP依赖性肌醇脱氢酶和肌醇酮差向异构酶催化下相互转化，协同参与多种生理过程的调控。DCI作为人体关键信号分子，在调节胰岛素敏感性、糖脂稳态和类固醇生成中发挥核心作用，不仅能改善多囊卵巢综合征患者的排卵功能和糖代谢异常，还具有抗炎、调节胚胎着床及维持甾体激素平衡等多种生理活性。近期研究还提示DCI及其衍生物可能在神经系统疾病和颗粒细胞瘤的辅助治疗中发挥有益作用。目前DCI的生产主要依赖天然植物提取或化学合成，存在成本高、得率低等问题，开发绿色高效的微生物合成路线具有重要意义。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表1。大肠杆菌JM109作为质粒构建宿主。谷氨酸棒杆菌DCI-1为本实验室前期构建的肌醇分解代谢相关基因敲除菌株，作为代谢工程改造和DCI生产的起始菌株。大肠杆菌在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中37°C培养。谷氨酸棒杆菌在LBB培养基（5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、18.5 g/L脑心浸液）中30°C培养。必要时添加适当抗生素。
【数据】培养基：LB（大肠杆菌）/LBB（谷氨酸棒杆菌）；温度：37°C/30°C；组分：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl（LB）；5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、18.5 g/L脑心浸液（LBB）
2.2 染色体编辑
本研究所构建的菌株和质粒列于表1，质粒构建所用引物见补充表1。为将Esa群体感应（QS）系统的感应元件（esaIR）整合到谷氨酸棒杆菌染色体中，合成了P_tac-esaI-P_esaR-esaR^I70V表达盒并插入质粒pBS-Δddh，得到整合质粒pBS-Δddh::P_tac-esaI-P_esaR-esaR^I70V。该质粒用于谷氨酸棒杆菌DCI-1的基因组编辑。经同源重组、Cre-loxP位点特异性重组及cre基因消除后，构建QS底盘菌株DQ。
为通过QS启动子P_esaS或GRP启动子P_cg1633和P_cg3096动态下调糖酵解和PPP中三个关键基因（pgi、pfkA、zwf），构建了七个启动子替换质粒：pK18-P_pgi::P_esaS、pK18-P_pfkA::P_esaS、pK18-P_pfkA::P_cg1633、pK18-P_pfkA::P_cg3096、pK18-P_zwf::P_esaS、pK18-P_zwf::P_cg1633和pK18-P_zwf::P_cg3096。以pK18-P_pgi::P_esaS为例，从谷氨酸棒杆菌DCI-1基因组扩增P_pgi启动子的上下游同源臂，通过重叠PCR将两个同源臂与合成的P_esaS片段连接，再经一步克隆插入经酶切的pK18mobsacB载体。其余六个质粒按相同方法构建。
随后，利用pCS(1)辅助的pK18mobsacB编辑系统，分别用质粒pK18-P_pgi::P_esaS和pK18-P_pfkA::P_esaS对QS底盘菌株DQ进行基因组编辑。通过单交换、CRISPR-Cpf1质粒pCS(1)辅助的双交换及pCS(1)消除，分别获得菌株DQG和DQP。类似地，用质粒pK18-P_pfkA::P_cg1633和pK18-P_pfkA::P_cg3096分别对菌株DCI-1进行基因组编辑，产生菌株DPa和DPb。接着，用质粒pK18-P_zwf::P_esaS对菌株DQG进行基因组编辑，获得菌株DQGZ。按相同方法，分别用质粒pK18-P_zwf::P_cg1633和pK18-P_zwf::P_cg3096对菌株DQP和DPa进行基因组编辑，获得四个菌株DQPZa、DQPZb、DPaZa和DPaZb。然后构建ndnR基因敲除质粒pK18-ΔndnR，按相同方法电转化进入菌株DPa和DPaZb，分别获得菌株DPaN和DPaZbN。考虑到先前敲除的转录调控因子iolR可能对菌株产生负面影响，将iolR重新敲回DPaZbN染色体。为调控分枝菌硫醇合成途径关键基因mshA的表达，构建了三个启动子替换质粒pK18-P_mshA::P_ilvE、pK18-P_mshA::P_hmp和pK18-P_mshA::P_cg1417，分别用于编辑该菌株，获得三个菌株DPaZbNMi、DPaZbNMh和DPaZbNMc。
【数据】编辑方法：pCS(1)辅助pK18mobsacB系统（单交换+CRISPR-Cpf1辅助双交换）；整合元件：P_tac-esaI-P_esaR-esaR^I70V；启动子：P_esaS、P_cg1633、P_cg3096、P_ilvE、P_hmp、P_cg1417；基因：pgi、pfkA、zwf、ndnR、iolR、mshA
2.3 DCI生物合成及G6P供给相关基因的过表达
为过表达DCI合成途径关键酶，从谷氨酸棒杆菌DCI-1基因组扩增肌醇磷酸合酶基因ino1，通过一步克隆插入经酶切的pJYW-5载体，构建质粒p5-ino1。将该质粒通过电穿孔导入菌株DCI-1及一系列糖酵解和PPP动态下调菌株，分别获得菌株D-1、DQG-1、DQP-1、DPa-1、DPb-1、DQGZ-1、DQPZa-1、DQPZb-1、DPaZa-1和DPaZb-1。以Ji等人构建的质粒p5-iolI₂G为模板，扩增P_tacM-iolI₂-P_tacM-iolG表达盒，通过一步克隆插入经酶切的p5-ino1质粒，构建质粒p5–1IG。将该质粒导入菌株DPa、DPaZb、DPaN、DPaZbN、DPaZbNMi、DPaZbNMh和DPaZbNMc，分别获得菌株DPa-2、DPaZb-2、DPaN-2、DPaZbN-2、DPaZbNMi-2、DPaZbNMh-2和DPaZbNMc-2。
为增强非PTS依赖的葡萄糖摄取-磷酸化效率并增加G6P供给，构建质粒pDTW107-SATK。以谷氨酸棒杆菌DCI-1基因组为模板，扩增肌醇转运蛋白基因iolT₂、多聚磷酸依赖的葡萄糖激酶基因ppgK、多聚磷酸激酶基因pvdS₂和肌醇单磷酸酶基因impA。扩增片段通过重叠PCR连接，随后与经酶切的pDTW107载体连接，生成质粒pDTW107-SATK。将该质粒导入菌株DPa-2、DPaZb-2、DPaN-2、DPaZbN-2、DPaZbNMi-2、DPaZbNMh-2和DPaZbNMc-2，分别获得菌株DPa-3、DPaZb-3、DPaN-3、DPaZbN-3、DPaZbNMi-3、DPaZbNMh-3和DPaZbNMc-3。
【数据】过表达基因：ino1、iolI₂、iolG、iolT₂、ppgK、pvdS₂、impA；载体：pJYW-5、p5-1IG、pDTW107-SATK；导入方法：电穿孔
2.4 发酵条件
肌醇生产实验中，将相应重组谷氨酸棒杆菌菌株涂布于LBB琼脂平板，30°C培养40 h。将生长出的菌落转移至装有50 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，30°C、200 rpm预培养16 h。随后，将预培养物接种至装有50 mL发酵培养基（127 g/L葡萄糖、30 g/L (NH₄)₂SO₄、8–10 g/L玉米浆干粉、1 g/L KH₂PO₄、0.75 g/L MgSO₄、1.5 g/L FeSO₄·7H₂O、20 g/L CaCO₃）的500 mL摇瓶中，初始光密度（OD₅₆₂）为1.8。发酵在30°C、200 rpm条件下进行144 h。必要时向培养基中添加30 mg/L卡那霉素和/或30 mg/L氯霉素。每24 h取2 mL发酵液样品。细胞密度和残糖含量按前述方法测定，MI和DCI含量采用高效液相色谱法测定，通过各自的保留时间（分别约16.4 min和13.8 min）进行鉴定，并使用示差折光检测器定量。氨基酸和有机酸（如乳酸、乙酸）含量按前述方法测定。
【数据】发酵培养基：127 g/L葡萄糖、30 g/L (NH₄)₂SO₄、8–10 g/L玉米浆干粉、1 g/L KH₂PO₄、0.75 g/L MgSO₄、1.5 g/L FeSO₄·7H₂O、20 g/L CaCO₃；接种OD₅₆₂：1.8；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：144 h；取样间隔：24 h；抗生素：30 mg/L卡那霉素和/或30 mg/L氯霉素；HPLC保留时间：MI约16.4 min、DCI约13.8 min
2.5 mshA转录的实时荧光定量PCR分析
使用RNA提取试剂盒从20 h和50 h收获的细胞中提取总RNA，随后进行反转录。以16S rRNA为内参，采用SYBR Green进行实时荧光定量PCR。相对转录水平通过2⁻ΔΔCt方法计算。
【数据】取样时间点：20 h和50 h；内参基因：16S rRNA；定量方法：2⁻ΔΔCt
研究结果
3.1 将G6P碳流导向MI和DCI生物合成途径
在前期研究中，谷氨酸棒杆菌底盘菌株DCI-1中敲除了肌醇分解代谢相关基因iolEDBCJA（图1）。尽管肌醇分解代谢途径被成功阻断，该菌株仍无法积累可检测水平的肌醇。推测其内源肌醇生物合成途径效率较低，导致前体G6P主要流向中心代谢。为增强MI合成，在DCI-1中过表达肌醇磷酸合酶编码基因ino1，获得菌株D-1。发酵结果表明，该菌株可积累MI及其衍生物DCI，但总肌醇滴度仍低于1.0 g/L（图2b）。
为在不损害细胞生长的前提下将更多G6P导向MI生物合成途径，将Esa QS系统的感应元件esaIR导入菌株DCI-1。随后，利用QS启动子P_esaS调控糖酵解中G6P异构酶基因pgi和PPP中G6P脱氢酶基因zwf的表达，获得菌株DQG和DQGZ。P_esaS启动子的转录强度受QS信号3-氧代己酰高丝氨酸内酯（AHL）调控：在低细胞密度下，转录调控因子EsaRI70V结合并激活P_esaS下游转录；而在高细胞密度下，EsaI合成的AHL积累破坏EsaRI70V-DNA相互作用，从而使P_esaS失活并下调靶基因表达（补充图1）。为增强MI合成，将ino1表达质粒导入上述菌株，获得菌株DQG-1和DQGZ-1。然而，与对照菌株D-1相比，这两个工程菌株的总肌醇产量仅略有增加，且细胞生长略有减弱（图2a和b）。
研究表明，pfkA基因编码的磷酸果糖激酶是糖酵解的关键调节酶。因此，采用QS启动子P_esaS和GRP启动子P_cg1633、P_cg3096调控pfkA表达，并导入ino1表达质粒，构建菌株DQP-1、DPa-1和DPb-1。GRP启动子P_cg1633和P_cg3096可在稳定期下调靶基因转录。结果显示，使用这三个启动子动态下调pfkA表达未显著抑制细胞生长，且这三个菌株的总肌醇产量较菌株D-1提高了2倍以上（图2a和b）。其中，菌株DPa-1获得最高滴度3.73 g/L（含2.89 g/L MI和0.83 g/L DCI），其次是菌株DQP-1的2.43 g/L（含1.48 g/L MI和0.95 g/L DCI）（图2b）。
DPa-1优于DQP-1的表现可归因于GRP启动子P_cg1633相对于Esa QS系统的固有优势。Esa QS系统可能给宿主带来额外的代谢负担，因为它需要表达外源esaI和esaR基因并消耗AHL合成的前体；此外，QS切换对EsaI表达水平高度敏感，往往导致过早下调而限制生物量积累。相比之下，GRP启动子利用宿主内源生长相调控网络，能够实现从指数生长期到稳定期的自然渐进过渡，而不引入额外代谢负担。这种与谷氨酸棒杆菌生理特性的内在兼容性使DPa-1能够在指数生长期积累足够的生物量，并在稳定期有效将碳流转向肌醇合成。
为进一步增强G6P进入MI合成途径的碳流，利用P_cg1633和P_cg3096启动子调控DQP和DPa中zwf的表达，并导入ino1表达质粒，获得菌株DQPZa-1、DQPZb-1、DPaZa-1和DPaZb-1。然而，用P_cg1633和P_cg3096启动子驱动zwf表达并未进一步提高肌醇产量，反而导致产物积累下降。在这些菌株中，菌株DPaZb-1的滴度与DPa-1相近，略有下降至3.52 g/L（含2.77 g/L MI和0.75 g/L DCI）（图2d）。从生长曲线（图2c）可以看出，细胞生长与产物合成之间并非简单的此消彼长关系，其背后的代谢调控机制有待深入分析。
为增强MI向其衍生物DCI的转化效率，选取前期报道的肌醇酮异构酶基因iolI₂和肌醇脱氢酶基因iolG，与ino1共表达构建质粒p5–1IG，从而协同强化从G6P到DCI的整个生物合成途径。将该质粒导入上述高产MI菌株DPa和DPaZb，分别获得菌株DPa-2和DPaZb-2。发酵结果表明，两个工程菌株的DCI产量均提高2倍以上：DPa-2产生1.61 g/L MI和1.88 g/L DCI，而DPaZb-2产生1.99 g/L MI和1.75 g/L DCI（图3b）。然而，两个菌株均表现出生物量和葡萄糖消耗速率下降。值得注意的是，发酵结束时DPaZb-2中的葡萄糖未被完全消耗（图3a），表明葡萄糖利用效率受损。
【数据】菌株D-1总肌醇滴度：<1.0 g/L；菌株DPa-1：3.73 g/L总肌醇（2.89 g/L MI + 0.83 g/L DCI）；菌株DQP-1：2.43 g/L（1.48 g/L MI + 0.95 g/L DCI）；菌株DPaZb-1：3.52 g/L（2.77 g/L MI + 0.75 g/L DCI）；菌株DPa-2：1.61 g/L MI + 1.88 g/L DCI；菌株DPaZb-2：1.99 g/L MI + 1.75 g/L DCI；提高倍数：>2倍
3.2 增强葡萄糖摄取效率
为改善MI合成前体G6P的供给，研究聚焦于增强葡萄糖摄取效率。通过过表达肌醇转运蛋白基因iolT₂和多聚磷酸依赖的葡萄糖激酶基因ppgK，强化了非PTS依赖的葡萄糖转运-磷酸化途径活性。为进一步促进G6P向MI的转化并循环利用释放的无机磷酸盐，同时共表达了肌醇单磷酸酶基因impA和多聚磷酸激酶基因pvdS₂（图1）。具体而言，ImpA催化肌醇-1-磷酸（MI-1-P）去磷酸化生成MI，而PvdS2循环利用ImpA释放的无机磷酸盐合成多聚磷酸，从而为PpgK提供必需的磷酸基供体。这四个基因组装到表达质粒pDTW107-SATK中，随后导入上述高产DCI菌株DPa-2和DPaZb-2，获得菌株DPa-3和DPaZb-3。
发酵结果表明，两个工程菌株的总肌醇产量进一步提高：DPa-3达到4.54 g/L（2.46 g/L MI和2.09 g/L DCI），而DPaZb-3达到4.61 g/L（2.50 g/L MI和2.11 g/L DCI）（图4b）。表型上，增强的非PTS途径加速了指数生长期的葡萄糖消耗，伴随生物量略有增加。然而在稳定期，葡萄糖消耗速率下降，菌株DPaZb-3中仍观察到残留葡萄糖（图4a）。推测虽然葡萄糖摄取和第一步代谢得到增强，但G6P向MI和DCI的转化可能仍然不足。生长后期G6P的积累可能抑制了进一步的葡萄糖摄取和磷酸化，从而阻止碳流完全导向MI合成。该具体机制有待进一步研究验证。
【数据】菌株DPa-3：4.54 g/L总肌醇（2.46 g/L MI + 2.09 g/L DCI）；菌株DPaZb-3：4.61 g/L（2.50 g/L MI + 2.11 g/L DCI）
3.3 辅因子NAD(H)供给增强
DCI生物合成途径中的两个关键酶——Ino1和IolG——均依赖辅因子NAD(H)催化各自反应。Ino1催化的反应涉及G6P氧化、环化和NAD⁺还原：氢负离子首先从G6P转移至NAD⁺，生成酮基-葡萄糖-6-磷酸中间体和NADH；该中间体随后环化并最终由NADH还原生成MI-1-P。IolG则催化MI氧化为肌醇酮，同时将NAD⁺还原为NADH。因此，胞内NAD(H)的可利用性直接影响DCI合成通量。ndnR编码的转录调控因子NdnR是NAD合成途径的抑制因子，敲除ndnR可解除对NAD从头合成基因的转录抑制，从而提高胞内NAD(H)水平。为增强辅因子供给，构建ndnR敲除质粒pK18-ΔndnR并导入菌株DPa和DPaZb，获得菌株DPaN和DPaZbN。随后导入p5–1IG质粒，获得菌株DPaN-2和DPaZbN-2。发酵结果表明，ndnR敲除显著提高了DCI产量：DPaN-2产生1.32 g/L MI和2.27 g/L DCI，DPaZbN-2产生1.87 g/L MI和2.46 g/L DCI。进一步导入pDTW107-SATK质粒后，菌株DPaN-3和DPaZbN-3的总肌醇产量分别达到4.82 g/L（2.41 g/L MI和2.41 g/L DCI）和5.75 g/L（2.93 g/L MI和2.82 g/L DCI）（图4d）。
【数据】菌株DPaN-2：1.32 g/L MI + 2.27 g/L DCI；菌株DPaZbN-2：1.87 g/L MI + 2.46 g/L DCI；菌株DPaN-3：4.82 g/L（2.41 g/L MI + 2.41 g/L DCI）；菌株DPaZbN-3：5.75 g/L（2.93 g/L MI + 2.82 g/L DCI）
3.4 发酵培养基优化及分枝菌硫醇合成途径调控
在菌株DPaZbN-3的基础上，对发酵培养基中玉米浆干粉（CSL）浓度进行了优化。分别测试了6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L四种CSL浓度。结果表明，当CSL浓度为10 g/L时，菌株DPaZbN-3的DCI和MI产量达到最高，分别为2.82 g/L和2.93 g/L（图5a和b）。CSL浓度过低（6 g/L）导致生物量不足，产物积累下降；而CSL浓度过高（12 g/L）则可能因有机氮源过剩导致代谢流向细胞生长和副产物合成偏移，同样不利于肌醇积累。
考虑到分枝菌硫醇合成途径会竞争消耗G6P的代谢中间体，研究进一步对分枝菌硫醇合成途径的关键基因mshA进行表达调控。利用三个不同强度的启动子P_ilvE、P_hmp和P_cg1417替换mshA的天然启动子，构建菌株DPaZbNMi-3、DPaZbNMh-3和DPaZbNMc-3。发酵结果显示，三个菌株的肌醇产量均较对照菌株DPaZbN-3有所提高。其中，菌株DPaZbNMh-3表现最佳，总肌醇产量达到7.51 g/L（含4.12 g/L MI和3.39 g/L DCI）（图6b），较对照菌株DPaZbN-3的5.75 g/L提高了30.6%。实时荧光定量PCR分析表明，P_hmp启动子驱动的mshA转录水平在20 h和50 h均低于天然启动子（图6c），说明适度下调mshA表达可减少碳流分流，从而增加肌醇积累。有机酸和氨基酸分析显示，工程菌株的副产物浓度维持在较低水平（图6d），表明碳流被有效导向目标产物。
【数据】CSL最佳浓度：10 g/L；菌株DPaZbN-3：2.82 g/L DCI + 2.93 g/L MI；菌株DPaZbNMh-3：7.51 g/L总肌醇（4.12 g/L MI + 3.39 g/L DCI）；提高幅度：30.6%；mshA转录水平：20 h和50 h均低于天然启动子
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略在谷氨酸棒杆菌中构建了高效的DCI从头合成细胞工厂。首先利用动态调控策略改造中心碳代谢，增强DCI前体MI的合成；随后通过过表达DCI合成途径关键酶和非PTS依赖的葡萄糖转运-磷酸化系统提高MI转化效率；最后通过辅因子工程、发酵培养基优化及减少分枝菌硫醇合成竞争途径的碳流分流，最大限度地将碳流导向MI和DCI积累。最终工程菌株DPaZbNMh-3实现了从葡萄糖高效生产DCI，滴度达3.39 g/L，为目前报道的微生物从头合成DCI最高水平。
编译者解读
该研究展示了典型的"动态调控+多层叠加"代谢工程策略在工业微生物底盘中的成功应用。亮点在于巧妙利用GRP启动子实现碳流的时间维度重分配，避免了传统组成型敲除对细胞生长的损害；同时通过辅因子工程和竞争途径弱化的多管齐下，将产物滴度推至新高度。值得注意的是，研究中多次出现"调控策略未达预期"的现象（如zwf动态下调未增效），反映出代谢网络调控的复杂性。从合成生物学应用角度看，3.39 g/L的DCI产量虽创纪录，但与工业化生产仍有距离，后续可探索发酵条件放大与过程控制优化，以释放该菌株的更大潜力。
参考来源
Liu X. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of myo-Inositol and D-chiro-Inositol. Enzyme and Microbial Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110890
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110890