来源：Enhanced production of human interferon α2b in glycoengineered Pichia pastoris by robust control of methanol feeding and implications of various control strategies（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人干扰素α2b（huIFNα2b）是兼具免疫调节、抗增殖和抗病毒活性的重要细胞因子，其工业生产长期受制于甲醇诱导阶段底物浓度波动带来的产量不稳定问题。本研究在5 L发酵量热仪中系统考察了不同残留甲醇浓度对产物得率的影响，并对比了三种控制策略（开关控制、比例积分控制、基于模型的自适应PI控制）在维持最优甲醇浓度方面的表现。结果显示，基于模型的自适应PI控制策略将huIFNα2b产量推至244.34 mg/L，比活性产率达0.31 mg/g·h，显著优于传统开关控制。该控制框架为毕赤酵母外源蛋白生产提供了一种可迁移的通用方案。
研究背景
毕赤酵母表达系统在过去三十年间被证明是生产重组蛋白、治疗分子和高附加值化学品的得力工具。其优势包括遗传操作简便、DNA转化效率高、可通过功能互补进行克隆、能分泌大量胞内和胞外蛋白，并具备翻译后修饰能力（糖基化、二硫键形成和蛋白水解加工）。干扰素α2b由165个氨基酸残基组成，分子量19 kDa，与IFN α/β受体特异性结合后启动JAK-STAT信号通路，从而诱导免疫调节、抗增殖和抗病毒活性。该分子以Intron®A为商品名获FDA批准上市。与其他在甲基营养型酵母中生产的重组蛋白一样，huIFNα2b在毕赤酵母中的产量高度依赖诱导阶段的甲醇利用效率。甲醇浓度过低则诱导不足，过高则产生甲醛和过氧化氢等毒性代谢物，抑制细胞生长和目标蛋白合成。因此，如何在诱导期精确维持最优残留甲醇浓度，是提升产物得率的核心工程问题。
研究方法
2.1 菌株与培养基
用于表达huIFNα2b的菌株为糖工程改造的毕赤酵母，具有Mut+表型，携带SuperMan5 pep4∆ prb1∆质粒，购自美国Biogrammatics Inc.公司。甘油菌种保存于含20% v/v甘油的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中，置于−80°C冰箱。培养该糖工程毕赤酵母所用的各种培养基组成如下：种子培养基（YPD，g/L）：酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20。预培养培养基（YPG，g/L）：酵母提取物10、蛋白胨20、甘油20。优化发酵培养基（基础盐培养基，BSM）：甘油48.84 g/L、K₂SO₄ 18.2 g/L、MgSO₄ 7.28 g/L、KOH 4.13 g/L、CaSO₄·2H₂O 0.93 g/L、(NH₄)₂SO₄ 8.42 g/L、85% H₃PO₄ 26.7 mL/L、PTM4盐溶液4.4 mL/L。
【数据】菌株：糖工程毕赤酵母Mut+（SuperMan5 pep4∆ prb1∆）；保存温度：−80°C；YPD培养基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L；YPG培养基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、甘油20 g/L；BSM培养基：甘油48.84 g/L、K₂SO₄ 18.2 g/L、MgSO₄ 7.28 g/L、KOH 4.13 g/L、CaSO₄·2H₂O 0.93 g/L、(NH₄)₂SO₄ 8.42 g/L、85% H₃PO₄ 26.7 mL/L、PTM4盐4.4 mL/L
2.2 接种物制备
将保存于−80°C的菌种甘油管划线接种至YPD平板以启动菌落生长。从YPD平板上挑取单菌落，接种至含5 mL YPD培养基的试管中建立种子培养。随后将种子培养液接种至含300 mL YPG培养基的挡板摇瓶中制备预培养物。预培养物在30°C、220 RPM条件下培养24小时，最终达到600 nm光密度（OD600）为4吸光度单位。
【数据】培养温度：30°C；转速：220 RPM；时间：24h；OD600：4
2.3 发酵量热仪原理与操作
补料分批发酵在5 L发酵量热仪中进行。该设备为自主设计的专用发酵罐，用于追踪微生物培养过程中散发的代谢热速率。其运行原理基于热补偿量热法——补偿加热器的功率随微生物培养过程中产生的代谢热量按比例动态调节。该专用生物反应器配备双层夹套和四支高灵敏度温度探头（Isothermal Technology Ltd, Merseyside, England）。其中两支高灵敏度温度探头置于发酵量热仪内部，其余两支分别位于夹套入口和出口。内层夹套用于循环硅油，以维持发酵量热仪内的等温条件；外层夹套以真空密封，以抵消向周围环境的热散失。总体温度控制由两个比例积分微分（PID）控制器调节，维持发酵量热仪的等温状态。第一个PID控制器根据微生物产热量按比例微调补偿加热器的功率输出；同时，第二个PID控制器响应夹套入口温度变化来调节低温恒温器（Julabo GmbH, Seelbach, Germany）。通过将总热速率分解为非生物热速率和生物热速率，可解析发酵量热仪测得的代谢热速率。各种机械操作对非生物热速率有贡献，各操作参数下的非生物热速率按前述文献方法估算。对发酵量热仪施加动态能量平衡以计算生物热速率。式(1)描述了由不同操作参数贡献的非稳态热速率平衡：
q_C − q_J − q_E + q_ST − q_A + q_B = m_w C_P (dT_r/dt)
其中q_B为生物热速率（W/L），q_baseline为基线热速率（W/L），q_C为补偿加热器产生的功率（W/L），T_r为反应器温度（°C），m_w为水的质量（kg）。由非生物活动产生的热速率贡献包括环境热损失（q_E，W/L）、反应液至夹套的热流（q_J，W/L）、搅拌热速率（q_S，W/L）和通气热损失（q_A，W/L），这些合并为基线热速率。最终，生物热速率由补偿加热器输出和基线热速率按式(2)计算：
q_B = q_baseline − q_C
【数据】发酵罐体积：5L；温度探头：4支；PID控制器：2个；硅油循环：内层夹套；真空密封：外层夹套
2.4 监控与数据采集系统（SCADA）
采用数据采集（DAQ）硬件cRIO 9075（National Instruments, Austin, Texas, USA）无缝集成所有过程输入和输出。DAQ配备专用插槽，容纳模拟I/O和数字I/O。使用LabVIEW（LabVIEW 13.0, National Instruments, Austin, Texas, USA）开发的SCADA系统采集所有信号。从实时信号获取的数据经LabVIEW编程进行数据预处理。原始数据通过移动简单平均滤波器（窗口大小100个数据点）进行平滑处理，以最大限度减少输入信号中的噪声。此外，对所有采集的模拟输入/输出信号（温度、pH、DO、尾气分析仪、代谢热速率），在认为必要处选择性地应用缩放因子，使采集数据与校准值对齐。预处理后的实时信号以图形曲线形式可视化，并用于控制策略。
【数据】DAQ：cRIO 9075；软件：LabVIEW 13.0；滤波窗口：100个数据点
2.5 二氧化碳释放速率（CER）测量
通过实时测量毕赤酵母培养过程中CO₂的浓度来追踪尾气活动。尾气分析仪（Siemens AG, Ultramat 23, Berlin, Germany）采用红外（IR）吸收法检测CO₂，并以摩尔分数（y_CO₂,out）形式传输信号。CER值由测得的摩尔分数数据按式(3)计算：
CER (m.mol/L·h) = (ṁ_g / V_R) × (y_CO₂,out × y_inert,in / y_inert,out − y_CO₂,in)
其中ṁ_g为气体的质量流量（L/h），V_R为反应液体积（L），y_CO₂,in为空气入口流中CO₂的摩尔分数，y_CO₂,out为空气出口流中CO₂的摩尔分数，y_inert,in为空气入口流中N₂的摩尔分数，y_inert,out为空气出口流中N₂的摩尔分数。
【数据】CO₂检测方法：红外吸收；分析仪型号：Siemens Ultramat 23
2.6 甲醇浓度实时监测
甲醇浓度通过浸入培养液中的在线传感器（Raven Biotech, Vancouver, BC, Canada）进行实时连续监测。溶解于培养基中的甲醇穿过探头上的膜进行扩散，随后由空气流携带至检测元件。传感器输出与培养基中甲醇浓度密切相关。建立了检测器电压与甲醇浓度之间的校准曲线（1 V = 0.643 × S_M），以推断传感器数据，数据通过SCADA连续采集。
【数据】传感器：Raven Biotech在线甲醇传感器；校准关系：1 V = 0.643 × S_M
2.7 huIFNα2b生产
糖工程毕赤酵母的huIFNα2b生产培养在5 L发酵量热仪中进行。使用预填充蒸馏水在121°C、1 bar压力下原位灭菌15分钟。灭菌后的BSM无菌转移至量热仪中。随后，以10% v/v的比例无菌转移预培养接种物，最终工作体积为2.5 L。高细胞密度培养在反应温度30°C下进行，pH通过按需小心添加25% v/v氨水和85% v/v正磷酸维持在5.4。通过以1 vvm供应空气并将搅拌速率调节在400–800 rpm之间，使溶解氧（DO）维持在10%以上。手动补加10% v/v消泡剂溶液（硅油）以抑制过度起泡。毕赤酵母的高细胞密度培养经历了……
【数据】发酵体积：2.5L；灭菌条件：121°C、1 bar、15min；培养温度：30°C；pH：5.4（25%氨水/85%磷酸调节）；DO：>10%；通气量：1 vvm；搅拌：400–800 rpm；消泡剂：10% v/v硅油
研究结果
3.1 糖工程毕赤酵母高细胞密度培养的实时监测
实时过程分析仪（包括发酵量热仪、CO₂气体分析仪和甲醇传感器）的部署展示了毕赤酵母生长过程中生物量增加、CER和甲醇利用的提升。热速率和CO₂信号之间观察到的连贯进展——以持续升高为特征——可归因于毕赤酵母高细胞密度培养过程中生物量浓度的相应体积增加。随着培养经历不同阶段，过程分析仪信号在热谱图和呼吸谱图中呈现明显差异（图2）。具体而言，在甘油批式阶段结束（22–24小时）时，实时信号出现显著下降。随后，对甲醇利用的逐步适应表现为这些信号的较慢增长，之后充分展示了诱导阶段的动态变化。
S_m表示自甲醇适应阶段开始以来由甲醇传感器测得的实时甲醇浓度。在最优残留甲醇浓度筛选实验中，浓度在1.5、3、5和7 g/L范围内变化。最优浓度确定为3 g/L，所有三种不同过程控制策略均在3 g/L的最优浓度下运行。测得的S_m值最高可达8 g/L，最低为1.5 g/L。由于吉布斯自由能的耗散是所有生命系统固有的特性，与不同代谢过程相关的焓变可通过发酵量热仪有效揭示。本研究所用定制发酵量热仪的灵敏度为6.73 mW/L。毕赤酵母培养生产huIFNα2b过程中产生的微生物热速率范围为38至50 W/L，与先前文献报道一致。将量热仪信号与CO₂信号结合，可解释生物过程中热通量与代谢通量相应变化之间的相互关系。在毕赤酵母培养中，同时监测量热谱图和呼吸计量谱图可深入了解能量代谢动态。诱导阶段消耗的甲醇在过氧化物酶体内氧化，产生甲醛，甲醛进一步氧化生成细胞功能所必需的能量中间体。该氧化过程伴随CO₂气体的释放。诱导阶段的CER值（80–170 m.mol/L·h）高于甘油批式阶段（最大CER为50–80 m.mol/L·h）。诱导阶段累积CER产量的增加表明AOX表达活性持续进行。诱导阶段CER产量较高，表明同化的甲醇中相当大比例主要导向能量代谢而非生物量合成（与甘油批式阶段相比）。然而，CER产量的过度或突然增加是CO₂大量氧化的指示，导致甲醛在培养液中积累，进而产生细胞毒性条件。
过程分析仪与离线测量相结合，可计算热化学能量产率。生物量生成的热产率系数（Y_Q/X）和甲醇利用的热产率系数（Y_Q/S）分别由累积热量（Q）与生物量生成量、甲醇消耗量之间曲线的斜率获得。在平衡生长条件下，Y_Q/X值高度一致，且取决于所进行的代谢类型。所有实验批次的诱导阶段Y_Q/X值范围为18.56至19.72 kJ/g，与文献报道一致。类似地，Y_Q/S值范围为662–702 kJ/C.mol，与甲醇的燃烧焓（727 kJ/C.mol）吻合良好。因此，来自过程分析仪的实时测量成功捕捉了CER产量、甲醇摄取和能量代谢之间的相互作用，从而能够系统调节甲醇流加以实现huIFNα2b的强化生产。
【数据】甘油批式结束时间：22–24h；甲醇浓度筛选范围：1.5、3、5、7 g/L；最优浓度：3 g/L；S_m范围：1.5–8 g/L；量热仪灵敏度：6.73 mW/L；热速率范围：38–50 W/L；诱导期CER：80–170 m.mol/L·h；甘油期CER：50–80 m.mol/L·h；Y_Q/X：18.56–19.72 kJ/g；Y_Q/S：662–702 kJ/C.mol；甲醇燃烧焓：727 kJ/C.mol
3.2 筛选最优甲醇浓度以提高huIFNα2b生产率
鉴于毕赤酵母对甲醇浓度的高度敏感性，由AOX1启动子调控的重组蛋白生产需要实施各种补料分批策略来控制甲醇浓度水平。已有研究表明，启发式甲醇控制策略会导致甲醇浓度在设定值附近大幅波动。这些波动对重组蛋白表达水平及比生产速率产生显著影响。为评估甲醇浓度对生物量生长和huIFNα2b生产及其比速率的影响，采用单因素轮换（OFAT）方法，仅改变甲醇浓度而保持其他相关因素恒定，在1.5、3、5和7 g/L甲醇浓度下进行了甲醇非限制补料分批发酵。所有设定点的甲醇浓度均通过简单的开关控制维持。比速率和比生产率的汇总见表1。
当培养液中甲醇浓度从1.5 g/L逐步提升至7 g/L时，μ_off出现下降（表1）。此外，甲醇摄取速率q_s也呈现类似趋势。具体而言，当残留甲醇浓度为3 g/L时，q_s约为0.056 g/g·h；而当残留甲醇浓度维持在7 g/L时，q_s降至0.032 g/g·h（表1）。μ_off和q_s的降低可能归因于重组蛋白的分泌对毕赤酵母造成代谢负担，从而对细胞生长和底物摄取能力产生不利影响。当甲醇浓度>3 g/L时，生物量生长和huIFNα2b生产率显著降低（表1）。在较高甲醇浓度下，甲醛和过氧化氢在细胞内的积累是Mut+毕赤酵母菌株中常见的现象。为最大程度减少毒性效应，细胞可能经历生理状态变化以适应较高浓度，从而补偿重组蛋白的生产。在残留甲醇浓度为3 g/L时获得最高的huIFNα2b产量和比生产率。较低的甲醇浓度（<3 g/L）导致产物积累较少，而较高的甲醇浓度（>5 g/L）则导致生长抑制。为提高huIFNα2b滴度，在糖工程毕赤酵母培养过程中采用了不同的控制策略来维持最优甲醇浓度（3 g/L），以实现huIFNα2b生产率的提升。
【数据】q_s（3 g/L甲醇）：0.056 g/g·h；q_s（7 g/L甲醇）：0.032 g/g·h；最优甲醇浓度：3 g/L；抑制浓度：>5 g/L
3.3 不同控制策略对huIFNα2b生产的影响
培养介质中残留甲醇浓度的监测和调控至关重要，因为它对细胞生长和外源蛋白表达具有双重影响。为此，必须实施合适的甲醇传感器和控制算法来调节甲醇流加速率。本研究实施了三种不同的控制策略。第一种控制策略为简单的开关控制，根据设定值与实测值之间的误差值来调节甲醇流加……
【数据】控制策略：开关控制、比例积分（PI）控制、基于模型的自适应PI控制；甲醇设定点：3 g/L
讨论与解读
本研究系统考察了糖工程毕赤酵母生产huIFNα2b过程中最优残留甲醇浓度的筛选与控制策略的优化。实验表明，3 g/L的残留甲醇浓度是实现最高产物生产率的临界点——低于此值产物积累不足，高于此值则因甲醛和过氧化氢的积累导致生长抑制。在三种控制策略的对比中，基于模型的自适应PI控制表现最佳，实现huIFNα2b产量244.34 mg/L、比生产率0.31 mg/g·h，显著超越开关控制（188.7 mg/L、0.16 mg/g·h）和PI控制（202.3 mg/L、0.28 mg/g·h）。该研究首次在毕赤酵母甲醇限制补料分批发酵中展示了基于模型的底物浓度自适应控制。过程控制方法为细胞代谢的复杂非线性特征提供了深入见解，而实时监测与控制的组合策略可加速过程性能评估，有助于产品质量提升和商业化推进。该模型自适应控制框架可推广至毕赤酵母表达的其他重组蛋白的生产过程。
编译者解读：该研究的核心价值在于将过程控制工程思维引入合成生物学发酵放大环节——甲醇浓度波动长期是毕赤酵母AOX1启动子系统产量不稳定的"隐形杀手"，传统开关控制的滞后性导致底物浓度在设定点附近持续振荡。基于模型的自适应PI控制本质上是对细胞代谢非线性动态的主动补偿，其产量提升（较开关控制+29.5%）并非来自菌株改造，而是来自过程控制精度的提升。这一思路对工业放大尤其重要：在不改变底盘细胞的前提下，仅通过控制算法优化即可获得显著增产，意味着已有生产设施可通过软件升级而非硬件改造实现产能提升。局限在于，该控制框架的迁移需要针对不同重组蛋白重新校准模型参数，且对在线传感器的可靠性依赖较高。
参考来源
Allampalli, S. S. P. (2024). Enhanced production of human interferon α2b in glycoengineered Pichia pastoris by robust control of methanol feeding and implications of various control strategies. Biochemical Engineering Journal, 2024. DOI: 10.1016/j.bej.2023.109152
DOI: 10.1016/j.bej.2023.109152