来源：Recombinant expression of a laccase from Coriolopsis gallica in Pichia pastoris using a modified α-factor preproleader（Protein Expression and Purification）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
漆酶是一类具有广泛底物谱的多铜氧化酶，在生物修复和制药分子合成中具有重要应用价值。灰盖栓菌（Coriolopsis gallica）漆酶因其高效降解工业染料等污染物的能力而备受关注。本研究利用改造的酿酒酵母α-因子前导肽，在毕赤酵母中实现了该漆酶的功能性分泌表达。通过优化甲醇浓度、铜盐浓度和温度等培养条件，在Fernbach摇瓶中获得了250 U/L的酶活。纯化后的重组酶电泳纯度达90%，催化常数与天然酶几乎一致，为漆酶的蛋白质工程改造提供了实用平台。
研究背景
漆酶在生物技术领域应用广泛，从生物修复到药物相关分子合成均有涉及。最高效的漆酶来自真菌，尤其是担子菌门，因其具有高氧化还原电位，能够催化氧化多种有机底物。对漆酶进行蛋白质工程改造，有助于改善其操作稳定性、pH稳定性、溶剂稳定性和热稳定性等特性。
真菌漆酶的异源表达已在多种系统中开展，其中酵母和丝状真菌最为成功。尽管在曲霉和木霉等丝状真菌中漆酶表达量可达800–1000 mg/L，但酵母系统更适合酶的蛋白质工程改造。由于真菌漆酶在酵母中表达水平普遍偏低，通过定向进化优化分泌效率成为一项有效策略。最典型的案例是在酿酒酵母中胞外表达朱红密孔菌漆酶——通过多轮定向进化，在信号肽（α-因子前导肽）和蛋白序列中积累了有益突变，显著提高了上清液中的酶活。
研究方法
2.1 试剂与微生物
培养基试剂购自Difco（酵母提取物、蛋白胨、酵母氮碱、琼脂）和Sigma（生物素、山梨醇）。HPLC级甲醇、甘油、葡萄糖及盐类购自JT Baker。其他试剂如2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）、博来霉素、丁香醛连氮等购自Sigma。毕赤酵母菌株X33野生型（Mut+）购自Invitrogen。大肠杆菌菌株MC1061作为重组质粒生产的宿主，由Leticia Olvera（IBT-UNAM）惠赠。
【数据】菌株：Pichia pastoris X33（Mut+）、E. coli MC1061；试剂来源：Difco、Sigma、JT Baker、Invitrogen
2.2 毕赤酵母培养基
以下培养基被使用。酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD）每升含：10 g酵母提取物、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖。含山梨醇的YPD培养基（YPDS）添加1 M山梨醇。YPD/YPDS斜面添加20 g琼脂。无机盐培养基（MM）每升含：13.4 g硫酸铵酵母氮碱（不含氨基酸）、400 μg生物素、5 mL甲醇、0.2 mM ABTS和0.1 mM CuSO₄。BMGY培养基每升含：10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6）、13.4 g硫酸铵酵母氮碱（不含氨基酸）、400 μg生物素和10 g甘油。BMM培养基每升含：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6）、13.4 g硫酸铵酵母氮碱（不含氨基酸）、400 μg生物素和10 mL甲醇。
【数据】YPD：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；YPDS：YPD+1 M山梨醇；MM：13.4 g/L酵母氮碱、400 μg/L生物素、5 mL/L甲醇、0.2 mM ABTS、0.1 mM CuSO₄；BMGY：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6）、13.4 g/L酵母氮碱、400 μg/L生物素、10 g/L甘油；BMM：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6）、13.4 g/L酵母氮碱、400 μg/L生物素、10 mL/L甲醇
2.3 灰盖栓菌cDNA中漆酶（LcCg）基因测序
灰盖栓菌UAMH8260的漆酶（LcCg）按照Román等方法[15]生产和纯化。通过Edman测序获得氨基末端序列（15个残基）。使用Clustal W程序[16]对多条灰盖栓菌漆酶DNA序列进行比对。登录号DQ431715的氨基末端序列与测序所得氨基末端序列一致，因此基于该序列设计寡核苷酸引物。引物序列如下：正向引物：TCT AGA ATG GCC AGG TTC CAA TCT CT；反向引物：GAA TTC TTA CTG GTC GTC AGG CGA GA，分别含有XbaI和EcoRI位点（加粗标示）用于后续克隆。
RNA纯化时，灰盖栓菌UAMH8260按前述方法[15]在振荡摇瓶中培养，以商业麸皮片作为碳源和能源，pH 6、28 °C、180 rpm振荡。6天后当漆酶表达量达到最大时，通过离心收集菌丝体并冻存于−70 °C。使用Trizol®按制造商说明进行RNA提取。第一链cDNA合成使用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，#Cat. K1631）按制造商说明进行。cDNA扩增的PCR条件为：94 °C 5分钟；随后30个循环的94 °C 30秒、58 °C 1分钟、68 °C 5分钟；最后68 °C延伸5分钟。cDNA克隆至pJet®载体进行Sanger测序。测序在墨西哥国立自治大学生物技术研究所（IBT-UNAM）完成。
【数据】引物Fwd：TCT AGA ATG GCC AGG TTC CAA TCT CT（含XbaI位点）；引物Rev：GAA TTC TTA CTG GTC GTC AGG CGA GA（含EcoRI位点）；培养条件：pH 6、28 °C、180 rpm、6天；PCR条件：94 °C 5′；30×（94 °C 30″；58 °C 1′；68 °C 5′）；68 °C 5′；冻存温度：−70 °C
2.4 表达载体构建及转化毕赤酵母
LcCg基因序列根据毕赤酵母的密码子偏好性进行了优化（补充数据）。优化后的序列由GenScript提供，构建于pPICZB载体中，受AOX1启动子控制。信号肽采用此前报道的酿酒酵母α-因子前导肽的改良版本[2]；根据该报道通过定向进化获得的突变被引入信号肽序列中，以检测活性蛋白的分泌水平。构建体两侧带有EcoRI位点。载体α-fLcCg-pPICZB通过电穿孔法导入毕赤酵母X33菌株。转化前使用SacI限制性内切酶对质粒进行线性化。转化子在YPDS琼脂平板上通过博来霉素抗性筛选，然后转移至添加0.2 mM ABTS和0.1 mM CuSO₄的MM培养基琼脂平板上。产漆酶的菌落周围形成绿色晕圈，被挑选用于后续研究。
【数据】载体：α-fLcCg-pPICZB；启动子：AOX1；线性化酶：SacI；筛选标记：博来霉素抗性；筛选平板：YPDS琼脂+0.2 mM ABTS+0.1 mM CuSO₄
2.5 铜浓度、温度和甲醇添加的影响
培养使用500 mL带挡板摇瓶，装液量50 mL，250 rpm。将单菌落接种于25 mL BMGY培养基中培养至吸光度（600 nm）达到4–6，离心收集菌体并重悬至吸光度约为1。甲醇每24小时添加一次。每天测定漆酶活性和600 nm吸光度。所有测定至少重复三次。
【数据】摇瓶：500 mL带挡板摇瓶；装液量：50 mL；转速：250 rpm；接种OD₆₀₀：4–6；诱导OD₆₀₀：约1；甲醇添加频率：每24 h；测定频率：每天
2.6 重组漆酶生产
将产漆酶菌落从YPD平板转移至300 mL BMGY中，于30 °C、200 rpm培养至吸光度（600 nm）达到8–10。菌体在8000 rpm、4 °C离心15分钟后收集，重悬于500 mL含0.5 mM CuSO₄和0.8%丙氨酸[17]的BMM表达培养基中，最终吸光度为4–5。培养在带挡板Fernbach摇瓶中于28 °C、250 rpm进行。每天测定漆酶活性和600 nm吸光度。所有测定至少重复三次。
【数据】BMGY培养：300 mL、30 °C、200 rpm、OD₆₀₀ 8–10；离心：8000 rpm、4 °C、15 min；BMM表达培养基：500 mL、0.5 mM CuSO₄、0.8%丙氨酸、OD₆₀₀ 4–5；培养条件：Fernbach摇瓶、28 °C、250 rpm
2.7 漆酶活性测定和蛋白浓度测量
酶活测定按照标准方案[18]进行。简要来说，反应在含50 μM丁香醛连氮、10% v/v乙醇和60 mM琥珀酸盐缓冲液（pH 4.5）的混合液中进行，室温操作。反应通过加入酶启动；初始速率根据产物形成引起的530 nm吸光度变化计算（ε = 64,000 M⁻¹cm⁻¹），使用Agilent 8453 UV-可见分光光度计。一个酶活单位定义为每分钟产生1 μM产物所需的酶量。所有测定重复三次。蛋白浓度通过Bradford法测定，使用基于牛血清白蛋白（2–20 μg/mL）的标准曲线。
【数据】底物：50 μM丁香醛连氮；缓冲液：60 mM琥珀酸盐（pH 4.5）；检测波长：530 nm；消光系数：ε = 64,000 M⁻¹cm⁻¹；仪器：Agilent 8453 UV-可见分光光度计；蛋白标准：BSA 2–20 μg/mL
2.8 重组LcCg的纯化
培养液分两步离心：首先在8000 rpm、4 °C离心15分钟，然后无细胞上清液在14,000 rpm、4 °C离心15分钟。离心后上清液通过超滤浓缩（30 kDa截留分子量）。浓缩液上样至DEAE-纤维素阴离子交换柱（150 mL），用10 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）洗脱。收集具有漆酶活性的组分，通过超滤浓缩（10 kDa截留分子量）。样品进一步通过凝胶过滤色谱纯化，使用G75 Sephadex柱（120 mL），以60 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）平衡。收集具有漆酶活性且比活相似的组分，通过超滤浓缩（10 kDa截留分子量）。每个纯化步骤的样品通过SDS-PAGE分析。
【数据】离心1：8000 rpm、4 °C、15 min；离心2：14,000 rpm、4 °C、15 min；超滤截留：30 kDa（第一步）、10 kDa（后续）；阴离子交换柱：DEAE-纤维素、150 mL、10 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）；凝胶过滤柱：G75 Sephadex、120 mL、60 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）
2.9 重组LcCg的去糖基化
重组漆酶用Biolabs的PNGaseF进行N-去糖基化。10 μg蛋白在100 °C变性10分钟。变性后，加入500 U PNGaseF进行去糖基化反应，37 °C孵育1小时。去糖基化通过SDS-PAGE确认。
【数据】PNGaseF：500 U；蛋白量：10 μg；变性：100 °C、10 min；反应：37 °C、1 h
研究结果
LcCg基因序列从产漆酶条件下培养的灰盖栓菌UAMH 8260 cDNA中获得，并已提交至GenBank（登录号KX932046）。数据库中已有灰盖栓菌基因组DNA和mRNA（完整cds）的漆酶序列；据报道大多数灰盖栓菌菌株只产生一种漆酶[5,19]。本工作获得的漆酶序列在核苷酸和氨基酸（翻译后）水平上与其他已报道的灰盖栓菌序列几乎完全一致，符合预期（表1）。该序列与其他担子菌漆酶也表现出显著相似性，如栓菌属、灰盖栓菌近缘种和特洛伊灰盖栓菌。
GenScript提供的载体中，LcCg基因序列前接α-因子前导肽的改良版本，受甲醇诱导的醇氧化酶1（AOX1）启动子控制。根据此前以开发重组漆酶表达工程平台为目标的报道，α-因子前导肽序列中积累的突变可导致朱红密孔菌重组漆酶在酿酒酵母中分泌量提高40倍[2]。该方法已成功应用于真菌漆酶和过氧化物酶的重组表达[2,20,21]，这几十年来一直是蛋白质工程领域的挑战，正是因为缺乏高效的异源表达系统。
本工作使用的灰盖栓菌漆酶与朱红密孔菌和PM1漆酶在氨基酸序列水平上分别有75%和95%的同一性。根据此前在酿酒酵母中异源生产的报道，使用α-因子前导肽时，朱红密孔菌和PM1漆酶的表达水平分别为0.03 U/L[2]和0.035 U/L[22]，在筛选测定中几乎检测不到。因此，灰盖栓菌漆酶在毕赤酵母中的异源表达可能面临类似的分泌问题。鉴于这些真菌漆酶之间的相似性，为克服分泌障碍，我们使用了此前报道的进化型α-因子前导肽，其携带以下突变：A9D、F48S、S58G、G62R和E86G[2]。
该信号肽包含两个区域：前导区（前19个残基）将新生多肽引导至内质网（ER），并被肽酶切除。前导肽区被认为有助于蛋白质从ER向高尔基体的转运，并进一步被Kex2p蛋白酶去除[23]。其中一些突变的有益效应可基于其他报道进行解释。例如，F48S突变在针对提高酿酒酵母中不同蛋白分泌水平的定向进化研究中频繁出现，如单链抗体、完整IgG、辣根过氧化物酶和白介素-2突变体[24]，推测是因为该突变赋予前导肽区更高的极性和柔性[23]。类似地，G62R突变位于疏水性LLFI基序侧翼；在该区域引入极性氨基酸与酿酒酵母中异源蛋白分泌增加相关[24]。A9D突变令人费解，因为该位置的丙氨酸残基预计构成前导肽区α-螺旋中的疏水核心。该疏水核心的破坏可能导致蛋白分泌下降，或者可能仅改变沿内质网的转运动力学，缩短新生多肽停留的时间[25]。
该修饰信号肽使得利用毕赤酵母作为宿主生产胞外功能性真菌漆酶成为可能。将α-fLcCg-pPICZB载体转化毕赤酵母后，检测到多个能够产生蓝色晕圈的菌落，标志着ABTS（一种标准漆酶底物）被氧化（图1）。将不含LcCg基因的pPICZB质粒转化毕赤酵母作为对照；这些菌落均未出现蓝色晕圈。据我们所知，关于灰盖栓菌漆酶异源表达的报道仅有一篇[26]，且是在乳酸克鲁维酵母中表达；但该研究未测定体积酶活，因此无法与本文结果进行比较。
选择一个分泌活性漆酶的菌落用于液体培养中的进一步蛋白生产。为找到有利于漆酶生产的培养条件，我们对温度、铜浓度和甲醇添加量进行了变化，并在摇瓶培养中连续数天监测生长和漆酶活性。根据结果（图2），在不添加铜的情况下，LcCg转化子检测不到漆酶活性；此时，低铜浓度（0.05 mM）足以支持漆酶生产。类似地，毕赤酵母中其他漆酶的异源生产也需要低铜浓度（0.004 mM–0.5 mM）[17,27,28]。在测试的铜浓度下未观察到对酵母生长的抑制作用。对于其他系统如酿酒酵母，最佳酶生产需要约0.1–2 mM的铜浓度[2,29]。总体而言，毕赤酵母中漆酶的异源生产表达水平偏低[30,31]。
作为毕赤酵母的诱导剂和碳源，甲醇浓度是另一个需要优化的重要变量。我们发现对于本工作所描述的表达系统，最佳甲醇浓度为2%，如图3所示。根据文献，摇瓶培养中甲醇浓度可在0.4%至2%之间变化[28,32,33]。
最后，使用0.5 mM Cu²⁺和1%甲醇，我们将培养温度降低至20 °C，因为已有报道称降低温度有利于真菌漆酶在毕赤酵母（2–6倍）[32,34]和酿酒酵母（16倍）[2,35]中的表达。然而，在我们的案例中降低温度产生了负面效应；虽然生长未受影响，但上清液中检测不到活性。异源表达的成功高度依赖于目标蛋白本身，即使是同源蛋白也可能以截然不同的效率被生产[1]。例如，来自毛头鬼伞的两种漆酶在毕赤酵母中表达水平分别为0.6和1.4 U/mL[36]，而变色栓菌的漆酶基因在毕赤酵母中表达水平约为12 U/mL[33]。血红的栓菌漆酶在同一系统中经培养条件优化后达到4.7 U/mL[28]。特洛伊栓菌漆酶在毕赤酵母中使用台式发酵罐表达，水平为2.5 U/mL[37]。另一方面，灵芝漆酶表达仅获得0.6858 U/mL的低体积酶活[34]。还可以纳入其他策略来提高生产水平，如：控制培养基pH、在培养基中添加丙氨酸、改变诱导时的初始生物量等。
在本案例中，尽管体积酶活较低，但已足以尝试酶纯化和进一步表征。重组酵母在Fernbach摇瓶中于0.5 mM铜、1%甲醇、28 °C条件下培养，以获得足够的蛋白用于生化和动力学表征。生长和胞外漆酶活性的典型曲线如图4所示。在该系统中，获得了更高的体积酶活0.25 U/mL，而小摇瓶中为0.1 U/mL。此前的观察表明，当氧向液相传质增强时可以获得更高的蛋白表达[38]，Fernbach系统可能就是这种情况。12天后，通过离心回收上清液，按实验部分所述进行纯化。
讨论与解读
本研究实现了灰盖栓菌UAMH8260真菌漆酶在毕赤酵母中的重组生产和纯化，毕赤酵母是不产生漆酶的异源宿主。为促进胞外分泌，选择了已被报道可在其他酵母系统中增强漆酶分泌的修饰α-因子前导肽。通过优化培养条件（温度、甲醇浓度和铜浓度），获得了250 U/L的体积酶活，相当于粗上清液中约3.75 mg/L的漆酶。该生产水平足以用于蛋白质工程研究中变体的生产、纯化和表征，这正是本研究的主要目标。重组蛋白在功能上与野生型酶相似，催化常数值反映了这一点，表明铜离子配位和蛋白折叠正确。
编译者解读
本研究的技术路线体现了合成生物学中"表达元件工程"的典型思路——通过定向进化改造信号肽来突破异源分泌瓶颈，这一策略对难以在酵母中高效分泌的真菌氧化还原酶具有普适参考价值。值得注意的是，研究者系统考察了铜离子、甲醇和温度三个关键参数，但低温策略在毕赤酵母中未复现酿酒酵母中的促进效果，提示跨宿主移植表达优化策略时需谨慎验证。250 U/L的产量虽不及丝状真菌系统，但足以支撑蛋白质工程筛选，体现了"够用即合理"的工程思维。未来若能将发酵工艺从摇瓶升级至生物反应器并耦合在线监测，产量有望进一步提升。
参考来源
Avelar M. Recombinant expression of a laccase from Coriolopsis gallica in Pichia pastoris using a modified α-factor preproleader. Protein Expression and Purification, 2017.
DOI: 10.1016/j.pep.2017.06.001
DOI: 10.1016/j.pep.2017.06.001