来源：Multiple strategies for high-efficiency expression of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris and production of biodiesel in solvent-free system（Fuel）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物柴油的酶法生产受制于脂肪酶的高成本。本研究通过信号肽筛选、启动子优化、基因拷贝数调整及共表达透明颤菌血红蛋白等多重策略，构建了高效表达 Thermomyces lanuginosus 脂肪酶（TLL）的重组毕赤酵母菌株。进一步构建双启动子表达系统，采用生物柴油作为诱导剂实现一步法诱导，TLL 活性最高达 8700 U/mL，较原始菌株提高 29 倍。发酵上清液在无溶剂体系中催化麻风树油生产生物柴油，产率最高达 96%。
研究背景
化石燃料的枯竭与环境污染使生物柴油作为清洁可再生燃料备受关注。相较于化学法，脂肪酶催化的酶法生物柴油生产条件温和、生物催化剂无毒、产物易分离，更具可持续性。Thermomyces lanuginosus 脂肪酶（TLL）是工业领域广泛应用的多功能生物催化剂，既能催化甘油三酯转酯化，也能催化游离脂肪酸酯化生成脂肪酸甲酯（FAME）。然而，脂肪酶的高成本是制约生物柴油工业化生产的主要障碍。脂肪酶成本取决于催化活性、表达水平和制备方法，因此实现 TLL 的高效表达、降低生产成本，将有力推动酶法路线的应用。毕赤酵母因具备真核翻译后修饰能力、内毒素和噬菌体污染少、易实现高密度培养及目标蛋白纯化方便等优势，是异源蛋白生产中最常用的表达系统。
研究方法
2.1 材料
限制性内切酶购自 New England Biolabs 有限公司（中国北京）。脂肪酸甲酯标准品和正己烷购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。麻风树油（游离脂肪酸含量 7.2%，酸值 13.9 mg KOH/g，皂化值 226.9 mg KOH/g，密度 0.91 g/cm³，水含量 0.3%（w/w））由本实验室自制。粗甘油是废油脂生产生物柴油的副产物，由南京林业大学化工研究所惠赠。粗甘油纯度为 96.7%，含水 1.5%，含 0.8% 钾盐及 0.5% 其他有机物。Lipolase 100L（蛋白含量 6%（w/w），脂肪酶活性 1102 PLU/mL，基于诺维信"丙基月桂酸酯合成（PLU）"方法测定）购自诺维信（丹麦Bagsvaerd）。甲醇及其他试剂均为分析纯。
【数据】麻风树油：FFA 7.2%、酸值 13.9 mg KOH/g、皂化值 226.9 mg KOH/g、密度 0.91 g/cm³、水含量 0.3%（w/w）；粗甘油：纯度 96.7%、水 1.5%、钾盐 0.8%、其他有机物 0.5%；Lipolase 100L：蛋白含量 6%（w/w）、活性 1102 PLU/mL
2.2 菌株、质粒与培养基
Escherichia coli Top10F' 用于质粒构建。P. pastoris KM71H 及载体 pPICZαA 和 pGAPZA（Invitrogen，美国加利福尼亚州）用于异源表达。本研究所用 YPDS、BMGY 和 BMMY 培养基均按照 EasySelect™ Pichia Expression Kit（Invitrogen）手册配制。tll 基因（GenBank 登录号 AF054513.1）为 D27R 突变体，携带其原始前肽 SPIRR。TLL、VHb（GenBank 登录号 AY278220）及信号肽的密码子优化核苷酸序列由上海生工生物技术有限公司合成。信号肽和启动子的来源见表 S1（补充材料）。为构建携带不同信号肽的重组质粒，通过 BstBI/EcoRI 双酶切将 pPICZαA/tll 质粒中的初始 α-因子信号肽（α-MF）替换为其他信号肽片段。不同启动子片段经 BglII/BstBI 双酶切获得，并替换 pPICZMFΔA/tll 质粒中的 PAOX1。载体 pGAPKA-vgb 基于 pGAPZA 构建，将 Sh ble 开放阅读框替换为卡那霉素抗性开放阅读框，并在 EcoRI/XhoI 位点间插入 vgb 基因。所有菌株和载体列于表 S2（补充材料）。
【数据】酶切位点：BstBI/EcoRI、BglII/BstBI、EcoRI/XhoI；tll 基因：GenBank AF054513.1（D27R 突变）；vgb 基因：GenBank AY278220
2.3 TLL 在毕赤酵母中的异源表达
携带 PAOX1 或 PFLD1 启动子的重组质粒用 SacI 线性化，其余质粒用 BsiWI 线性化。线性化质粒通过电穿孔法转化至 P. pastoris KM71H 感受态细胞。转化子在含 100 μg/mL 博来霉素的 YPDS 平板上筛选。随后通过三丁酸甘油酯平板筛选阳性转化子。挑取产生大而清晰透明圈的转化子，按 Yan [6] 所述方法在 BMGY/BMMY 培养基中摇瓶培养。此过程中，每 24 小时添加终浓度为 0.5%（v/v）的纯甲醇。采用甲酯诱导策略时，BMMY 培养基中的甲醇替换为 0.5–8.6%（v/v）的油酸甲酯或生物柴油。生物柴油由本实验室保存的麻风树油制备，其组成为：11.5%（w/w）棕榈酸甲酯、0.6%（w/w）棕榈油酸甲酯、6.1%（w/w）硬脂酸甲酯、37.4%（w/w）油酸甲酯、44.1%（w/w）亚油酸甲酯、0.2%（w/w）亚麻酸甲酯。
【数据】筛选抗生素：100 μg/mL 博来霉素；甲醇诱导浓度：0.5%（v/v），每 24 h 添加；甲酯诱导浓度：0.5–8.6%（v/v）；生物柴油组成：棕榈酸甲酯 11.5%、棕榈油酸甲酯 0.6%、硬脂酸甲酯 6.1%、油酸甲酯 37.4%、亚油酸甲酯 44.1%、亚麻酸甲酯 0.2%
2.4 脂肪酶活性与蛋白浓度测定
TLL 活性采用改良碱滴定法测定，参照 Fang [12] 先前描述的方法，反应温度和时间分别设为 40°C 和 15 分钟。PBS 缓冲液（50 mM）的 pH 为 7.5。通过用 50 mM NaOH 滴定释放的脂肪酸来测定活性。一个脂肪酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟水解橄榄油释放 1 μmol 脂肪酸所需的酶量。总蛋白浓度采用 Bradford 法测定，以 BSA 为标准 [14]。
【数据】反应温度：40°C；反应时间：15 min；PBS 缓冲液：50 mM，pH 7.5；滴定液：50 mM NaOH；酶活单位定义：1 U = 每分钟释放 1 μmol 脂肪酸
2.5 通过定量 PCR 测定基因拷贝数
目标基因拷贝数在 Applied Biosystems® Step One Plus 快速实时 PCR 仪（Applied Biosystems Inc.，美国加利福尼亚州）上通过定量 PCR（qPCR）测定。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）作为参考序列。标准质粒 pMD19-GAPDH 和 pMD19-tll 分别用于生成 GAPDH 基因和 tll 基因的双标准曲线。ProT-F/ProT-R 和 GAPDH-F/GAPDH-R 用作引物（补充材料，表 S2）。根据 2 × T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）（擎科，中国北京）说明书，qPCR 在 20 μL 反应体系中进行。根据双标准曲线计算每个转化子中的 tll 基因拷贝数。
【数据】qPCR 体系：20 μL；参考基因：GAPDH；标准质粒：pMD19-GAPDH、pMD19-tll
2.6 生物柴油生产与分析
转酯化反应在带塞的 25 mL 圆底烧瓶中进行，置于摇床培养箱（180 rpm）中，温度 30–45°C。反应混合物组成如下：麻风树油（5.0 g）、甲醇（3:1–6:1，mol/mol，油）、适当稀释的发酵上清液（10–50 U/g 油）、水含量（10–80%，w/w，油）。甲醇采用连续多步程序添加（补充材料）。各成分的用量在具体实验中有所变化。在特定时间点，从反应混合物中取出 100 μL 样品作为 GC 分析的测试样品。如图 S1 所示，以十七烷酸甲酯作为内标。简言之，将 1 μL 样品注入配备火焰离子化检测器和 DB-WAX 毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的 Agilent 7890A GC 系统进行 FAME 分析，参照 Tian 的方法 [4]。用正己烷配制的梯度浓度脂肪酸甲酯标准品制作标准曲线。根据标准曲线对 FAME 进行定量分析。生物柴油产率定义为 FAME 与油的质量比，按式（1）计算：生物柴油产率（%）= ∑mFAMEs / moil × 100%，其中 ∑mFAMEs 为根据标准曲线计算的总 FAME 质量（mg），moil 为油的质量（mg）。
【数据】反应容器：25 mL 圆底烧瓶；转速：180 rpm；温度：30–45°C；油量：5.0 g；甲醇与油摩尔比：3:1–6:1；酶用量：10–50 U/g 油；水含量：10–80%（w/w，油）；取样量：100 μL；进样量：1 μL；色谱柱：DB-WAX（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）
2.7 统计分析
所有试验和样品均进行三次重复。统计分析采用 IBM SPSS 20.0 软件。均值间显著性差异（P < 0.05）采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和 Duncan 多重比较检验。数据由 Microsoft Excel 2010 和 MicroCal Origin 8.5 软件处理，以均值（n = 3）± 标准差表示。
【数据】重复次数：3；显著性水平：P < 0.05；统计方法：One-way ANOVA + Duncan 多重比较
研究结果
3.1 重组菌株中 TLL 的表达
为选择合适的表达元件，比较了不同启动子和信号肽。同时考察了目标基因拷贝数和与 VHb 共表达对 TLL 表达的影响。除用于研究基因剂量效应的重组菌株外，本研究选用的所有菌株均含有经 qPCR 确定的单拷贝 tll 基因。首先，选取 7 种不同信号肽比较其对 TLL 表达的影响。携带含 α-MF 的 pPICZαA/tll 的重组菌株 KT 作为对照。如图 1a 所示，仅菌株 KT/MFH 的产量下降了 8%。与 KT 相比，KT/Mα、KT/SP23、KT/MF4I、KT/Ost1 的相对 TLL 活性分别为 347%、464%、204%、400%。菌株 KT/MFΔ 的 TLL 活性比 KT 高 3.86 倍。先前研究中也有类似结果，采用 MFΔ 时辣根过氧化物酶和 Candida antarctica 脂肪酶 B 的产量至少提高 50% [15]。这被认为是因为去除了前肽的整个第二 α 螺旋 [16]，从而增加了相互作用环的灵活性。因此，后续所有实验均选用 MFΔ。
启动子影响毕赤酵母中异源蛋白的转录效率和表达。选用甲醇诱导型启动子 PAOX1 和 PFLD1，以及 5 个组成型启动子 PGAP、PPDC、PPYK、PG1 和 PP9。以在 PAOX1 控制下表达 TLL 的菌株 KT/MFΔ 作为对照。不同启动子表达的 TLL 相对活性分布为 KT/MFΔ 的 7% 至 103%（图 1b）。菌株 KT/MFΔ 和 KT/FLD1 的脂肪酶活性远高于携带组成型启动子的菌株。以 TLL 活性表示，PFLD1 的强度与 PAOX1 几乎相同。PAOX1 启动子是最强且调控最严格的启动子之一 [17]，因此 PAOX1 调控系统最为常用。故后续实验选用 PAOX1。此外，目标基因拷贝数可显著影响异源蛋白的表达，多拷贝策略已被证明有效 [18]。菌株 2c、3c、4c、5c 分别携带 2、3、4、5 个 tll 基因拷贝。携带单拷贝 tll 基因的菌株 KT/MFΔ 作为对照。如图 1c 所示，随着 tll 基因拷贝数从 1 增加到 4，TLL 活性提高了 91%，从 594 U/mL 增至 1135 U/mL。然而，菌株 5c 的 TLL 活性未进一步增加，甚至低于 2c。在其他蛋白案例中也观察到类似结果。在产生地衣芽孢杆菌几丁质酶 A 时，含 4 拷贝 ChiA 的重组毕赤酵母比其他菌株表现出更高的表达量 [19]。可能的原因是高基因拷贝数会加剧细胞应激并减少蛋白胞外分泌，因此基因剂量与目标蛋白表达之间不存在正相关 [18]。
在发酵过程中，共表达 VHb 是缓解氧限制、提高目标蛋白产量的有效途径。构建菌株 4c/v 以探索 VHb 胞内共表达对 TLL 表达的影响。菌株 4c 作为对照。如图 1d 所示，4c/v 的 TLL 活性达到 1507 U/mL（诱导 96 小时），比 4c 高 33%。先前研究也有类似报道。例如，共表达 VHb 的重组菌株在 50% 高溶解氧水平下 YLLip 2 产量提高了 21% [20]。简言之，我们构建了含 4 拷贝 tll 基因的重组菌株 4c/v。在 4c/v 中，TLL 在 AOX1 启动子和 MFΔ 信号肽的控制下表达，并与 VHb 共表达。为降低生产成本并符合环保的绿色化学实践，期望使用粗甘油（生物柴油工业的副产物）替代 BMGY 中的精制甘油。如图 2a 所示，在含精制甘油或粗甘油的 BMGY 培养基中，4c/v 的 OD600 和 TLL 活性几乎相等。最佳培养条件为：初始 pH 6.0、OD600 3.0、25°C、每 24 小时添加 1%（v/v）甲醇（补充材料，图 S2）。菌株 4c/v 的 TLL 活性在 96 小时后达到 2450 U/mL，较原始发酵条件提高 60%，并在 192 小时后达到峰值 7770 U/mL（图 2b）。本研究中 TLL 活性比先前研究 [12] 的 6600 U/mL 高 17%。
【数据】KT/MFH 产量下降 8%；KT/Mα、KT/SP23、KT/MF4I、KT/Ost1 相对活性分别为 347%、464%、204%、400%；KT/MFΔ 比 KT 高 3.86 倍；不同启动子相对活性为对照的 7%–103%；拷贝数 1→4：TLL 活性从 594 U/mL 增至 1135 U/mL（提高 91%）；4c/v 活性 1507 U/mL（96 h），比 4c 高 33%；最佳条件：pH 6.0、OD600 3.0、25°C、1%（v/v）甲醇/24 h；96 h 活性 2450 U/mL（提高 60%）；192 h 峰值 7770 U/mL；比文献 6600 U/mL 高 17%
3.2 毕赤酵母双启动子表达系统的构建
在先前研究中，Kumari 等 [13] 报道了一种两步诱导策略，重组毕赤酵母依次用甲醇和油酸甲酯诱导。虽然脂肪酶活性提高了 20–40%，但仍需少量甲醇来激活 PAOX1 启动子以分泌脂肪酶水解油酸甲酯。为简化两步诱导法，本研究提出了一步甲酯诱导策略。为实现此目标，构建了在 PAOX1 和 PGCW14 双启动子控制下的重组菌株 4c + g/v。菌株 4c + g/v 在非诱导阶段通过组成型启动子 PGCW14 表达一定量的 TLL。随后，分泌的 TLL 将甲酯水解为甲醇，甲醇再诱导 PAOX1 进一步增强 TLL 的产生。一步诱导策略允许甲醇缓慢持续释放，无需额外添加甲醇即可稳定生产 TLL。另一水解产物——脂肪酸被用作碳源，这解释了 4c/v 的 OD600 增加。如前所述，最佳 tll 基因剂量为 4，而当 tll 拷贝数增至 5 时脂肪酶活性显著下降。经 qPCR 验证，菌株 4c+g/v 携带 5 拷贝 tll。因此，考察了拷贝数增加对 TLL 表达的影响。在最佳培养条件下用甲醇诱导 96 小时后，4c+g/v 的 TLL 活性比 4c/v 提高 20%（图 3），这与先前研究一致 [21,22]。此外，携带含 GCW14 启动子表达盒的菌株命名为 g/v。4c+g/v 的 TLL 活性比 g/v 高 2.2 倍。与这两种菌株相比，4c+g/v 中更高的 TLL 活性可能受益于组合启动子的协同效应。我们推测，由于两个功能性启动子的存在，结构中 RNA 聚合酶结合位点数量增加——两个启动子位于同一转录单元上游，可被两种不同的 RNA 聚合酶识别 [23]，从而产生更高的表达强度。
【数据】4c+g/v 携带 5 拷贝 tll；甲醇诱导 96 h 后 4c+g/v 比 4c/v 高 20%；4c+g/v 比 g/v 高 2.2 倍
3.3 甲酯诱导 TLL 的分泌表达
以浓度范围为 0.5% 至 8.6%（v/v）的油酸甲酯作为诱导剂。在 BMMY 中每 24 小时添加 1%（v/v）甲醇培养的菌株 4c+g/v 作为对照。如图 4a 所示，当添加 0.5%（v/v）油酸甲酯时，TLL 活性较甲醇补料培养下降 20%，表明 0.5%（v/v）油酸甲酯不足以供 4c+g/v 利用。随着油酸甲酯浓度从 1% 增至 8.3%（v/v），TLL 活性略有下降。添加 1%（v/v）油酸甲酯时获得最高脂肪酶活性，较对照提高 9%。有趣的是，添加 1%（v/v）生物柴油比添加等量油酸甲酯获得高 28% 的脂肪酶活性（图 4b）。用 1%（v/v）生物柴油诱导 192 小时后，获得最高脂肪酶活性 8700 U/mL，总蛋白浓度达 1.4 g/L。
【数据】0.5% 油酸甲酯：活性较对照下降 20%；1%–8.3% 油酸甲酯：活性略有下降；1% 油酸甲酯：较对照提高 9%；1% 生物柴油：比等量油酸甲酯高 28%；192 h 最高活性：8700 U/mL；总蛋白浓度：1.4 g/L
3.4 无溶剂体系中 TLL 催化麻风树油生产生物柴油
（注：此节标题及内容在原文节选中未完整呈现，但根据图 5 图注及摘要信息，该部分涉及酶用量优化及最优条件下 TLL 与 Lipolase 100L 的对比。原文节选在此处中断。）
讨论与解读
4 结论
为降低 TLL 的制备成本，通过多重策略构建了具有强大表达能力的重组毕赤酵母。此外，基于双启动子表达系统，提出了一种以油酸甲酯或生物柴油为诱导剂的新型一步诱导策略。首先优化了信号肽、启动子和基因剂量，随后将 VHb 与 TLL 共表达以促进氧气传递。重组菌株 4c/v 的 TLL 产量较原始菌株提高了 11 倍。使用生物柴油生产中的粗甘油作为碳源进一步降低了发酵成本。此外，用 1%（v/v）生物柴油诱导 192 小时后 TLL 产量达到峰值 8700 U/mL，较原始菌株提高 29 倍。一步诱导策略操作简便，对重组毕赤酵母的生长阻碍很小，且表达水平更高。发酵上清液（游离 TLL）被用于无溶剂体系中麻风树油的生物柴油生产，在最优条件下 60 小时获得最高 96% 的生物柴油产率。该生物柴油生产工艺便捷、成本低，得益于相对较低的酶载量、直接使用发酵上清液以及无溶剂体系中产物易分离。本研究实现了 TLL 的高效表达和低制备成本，对可持续且经济的酶法生物柴油生产具有重要意义。
编译者解读
本研究展示了典型的合成生物学"多策略叠加"思维——从信号肽、启动子、基因剂量到辅助蛋白共表达，逐层优化最终实现 TLL 表达量 29 倍的提升。双启动子一步诱导策略尤为巧妙，利用组成型启动子预先分泌的脂肪酶水解甲酯释放甲醇，实现"自我诱导"，既规避了甲醇对细胞生长的抑制，又省去了两步法的繁琐操作。值得关注的是，直接使用粗甘油和生物柴油工业副产物作为原料，体现了绿色制造理念。然而，摇瓶水平的高表达与工业发酵罐放大之间仍有距离，且 96% 的转化率在规模化生产中能否维持尚需验证。未来若能将此表达系统与连续化生物柴油生产工艺结合，有望进一步推动酶法路线的产业化进程。
参考来源
Xu R. Multiple strategies for high-efficiency expression of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris and production of biodiesel in solvent-free system. Fuel, 2023. DOI: 10.1016/j.fuel.2022.126246
DOI: 10.1016/j.fuel.2022.126246