来源：Engineering and optimization of phosphate-responsive phytase expression in Pichia pastoris yeast for phytate hydrolysis（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
植酸是植物中磷的主要储存形式，广泛存在于谷类及植物源饲料原料中，但单胃动物因缺乏植酸酶而无法消化利用，导致植酸随粪便排放造成磷污染。本研究将两种热稳定性细菌植酸酶（YF与phyA）导入毕赤酵母，置于磷酸盐（Pi）响应型PPHO89启动子控制下实现分泌表达，并通过定向进化获得增强型启动子突变体PPHO89ΔTT。在模拟体外消化模型中，工程酵母释放Pi的效率与商品化植酸酶相当，展示了全细胞生物催化剂在饲料加工与动物废弃物处理中的应用潜力。
研究背景
磷是所有生物体的必需营养素之一，是ATP、核酸、蛋白质和磷脂的关键组成成分，并参与磷酸化、糖酵解等多种代谢活动。植酸（肌醇六磷酸）是植物组织中磷酸盐的主要储存形式，占植物总磷含量的60%以上，在豆类、谷类和油料种子中含量丰富。然而，植酸也被视为一种"抗营养因子"，它能与二价金属离子（如Zn²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺）、蛋白质、碳水化合物和脂质形成稳定的复合物，降低膳食中必需营养素的生物利用度。
反刍动物（如牛、羊）的消化系统具有足够的植酸酶活性来释放Pi供吸收利用，但包括人类、猪和家禽在内的单胃动物无法将植酸作为营养源利用，膳食中的植酸随粪便排出，造成严重的水体富营养化污染。目前增加日粮磷含量的做法是外源添加Pi，成本较高；另一种替代方案是添加植酸酶。植酸酶正受到国际社会的广泛关注，开发可持续的植酸资源环境友好型利用策略迫在眉睫。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
大肠杆菌DH5α用作质粒增殖的宿主菌，常规培养于添加适当抗生素的LB培养基中，37°C摇床培养，转速200 rpm。毕赤酵母GS115用于蛋白表达，常规培养于YPD培养基（1% w/v酵母提取物、2% w/v蛋白胨、2% w/v葡萄糖）中，添加适当抗生素，30°C摇床培养，转速200 rpm。根据需要，培养基中添加zeocin（25 μg/ml或100 μg/ml）或卡那霉素（50 μg/ml）。固体培养基添加2%琼脂。
质粒pPICZαA（Invitrogen）含有PAOX1启动子、α-factor分泌信号肽、c-myc表位、(His)6标签和zeocin抗性基因，用于克隆。含酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）报告基因的质粒pKT127购自Euroscarf。所有限制性内切酶均购自New England Biolabs。
2.2 质粒构建与毕赤酵母转化
研究两种热稳定性细菌植酸酶：弗氏耶尔森菌植酸酶变体Ser51Thr（YF）和黑曲霉肌醇六磷酸磷酸水解酶（phyA）。使用DNA2.0软件，参照二十种天然氨基酸的毕赤酵母偏好密码子对这两种植酸酶基因进行密码子优化（见补充材料）。两个"优化"植酸酶基因通过全基因合成获得，并经自动DNA测序（TechDragon）验证核苷酸序列。
PPHO89启动子序列（Genbank: EU938135）使用基因特异性引物从毕赤酵母基因组DNA中扩增（正向引物：gaAGATCTGGAGCCAGCACAGGAATCG（BglII）；反向引物：cccAAGCTTTGTGAATGATTATAAGATGAGTCATC（HindIII））。确认序列一致性后，将PPHO89启动子序列克隆至pPICZαA质粒中替换原有的PAOX1启动子序列，生成pPICZαA-PPHO89。两个"优化"植酸酶基因分别克隆至pPICZαA-PPHO89中，生成质粒pPICZαA-PPHO89-YF和pPICZαA-PPHO89-phyA（图1）。
毕赤酵母转化采用电穿孔"杂交"方法进行。质粒在PPHO89启动子处线性化，以通过同源重组整合至毕赤酵母基因组。简要步骤如下：收集对数期毕赤酵母GS115，洗涤后重悬于9 ml冰预冷BEDS溶液（10 mM bicine-NaOH、3%（v/v）乙二醇、5%（v/v）二甲基亚砜、1 M山梨醇，pH 8.3）和1 ml 1 M二硫苏糖醇（DTT）中。30°C、100 rpm温和振荡孵育5分钟后，离心收集酵母细胞，重悬于1 ml BEDS溶液。取40 μl电转感受态细胞与线性化转化质粒混合于2-mm电转杯中。该转化混合物冰上孵育2分钟，在电转仪（Gene Pulser® II电转仪）中电击，设置参数为：充电电压1,500 V；电阻200 Ω；电容25 μF。电转后的酵母细胞立即与0.5 ml 1 M山梨醇和0.5 ml YPD混合，30°C、150 rpm振荡孵育2小时，然后涂布于含zeocin（100 μg/ml）的YPD琼脂平板。30°C孵育4天后统计毕赤酵母转化子。
2.3 植酸酶表达与纯化
挑取含植酸酶的毕赤酵母转化子在zeocin YPD琼脂平板上的单菌落，接种至10 ml YPD培养基中。30°C过夜培养后，取400 μl培养物转接至50 ml新鲜YPD培养基中。30°C继续培养24小时后，转移至22°C孵育72小时以允许蛋白表达。YPD培养基原本含有0.11 g/l的NaH₂PO₄•2H₂O。向培养基中额外添加NaH₂PO₄•2H₂O，使浓度达到0.11至1.00 g/l系列梯度，作为唯一Pi源以激活Pi限制型PPHO89启动子。
为研究分泌型植酸酶，将培养液以10,500 g离心2分钟，取上清液用于胞外植酸酶测定。所得细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，体积与原始酵母制备物相同，以便直接比较胞外与胞内植酸酶活性。胞内植酸酶通过玻璃珠法破碎细胞释放。珠/裂解物混合物于4°C、18,000 g离心15分钟。测定上清液活性，反映胞内植酸酶水平。
为纯化分泌型植酸酶，将原始培养液离心所得蛋白用40%硫酸铵沉淀，重悬于0.1 M Tris−HCl缓冲液（pH 7.5）中。透析48小时（更换三次缓冲液）后，使用Qiagen Ni-NTA旋转试剂盒进行植酸酶纯化。His标签植酸酶用250 mM咪唑、0.1 M Tris−HCl缓冲液（pH 8.0）洗脱。植酸酶制剂的纯度通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查。
2.4 植酸酶活性测定
毕赤酵母转化子的植酸酶活性通过测定植酸底物释放的Pi来确定。简要步骤：将培养上清液与5 mM植酸钠（1:9，v/v）在0.1 M甘氨酸−HCl（pH 2.5）中混合，37°C、250 rpm振荡孵育15分钟，此期间反应速率保持初始速率。加入10%三氯乙酸终止反应。释放的Pi量用钼酸铵法测定：与新鲜配制的显色试剂（4体积1.5%钼酸铵溶于5.5% H₂SO₄ + 1体积2.7% FeSO₄）混合后定量。一个单位（U）植酸酶活性定义为每分钟释放1 μmol Pi所需的酶量。
2.5 Pi响应型启动子的定向进化
yEGFP基因通过PCR获得，使用基因特异性引物（正向引物：cgGAATTCA TGTCTAAAGGTGAAG（EcoRI）；反向引物：cgGCGGCCGCTTTGTACAATTCATCC（NotI）），以pKT127质粒为模板。将yEGFP基因序列克隆至pPICZαA-PPHO89中，生成pPICZαA-PPHO89-yEGFP。
采用易错PCR生成启动子文库，使用PPHO89特异性引物和pPICZαA-PPHO89-yEGFP为模板，反应混合物含10 mM Tris−HCl、50 mM KCl、10 mM MgCl₂、0.5 mM MnCl₂、1 mM dCTP、1 mM dTTP、0.2 mM dATP、0.2 mM dGTP、2.5 U Taq DNA聚合酶，反应条件为：94°C 1分钟、54°C 1分钟、72°C 2分钟，共25个循环。PCR混合物克隆至pPICZαA-PPHO89-yEGFP中替换原有的PPHO89。毕赤酵母转化如前所述。绿色荧光以激发波长488 nm和发射波长515 nm检测。
2.6 模拟体外消化模型
体外消化试验模拟单胃动物的消化条件（温度和pH）。酵母菌株在YPD培养基中过夜培养，用蒸馏水洗涤两次，重悬于1.5 ml蒸馏水中，获得初始OD600nm为8的浓缩酵母制剂。10 U商品化植酸酶（SunSon）溶于蒸馏水中作为阳性对照，蒸馏水本身作为阴性对照。将酵母和两种对照（pH 5.8–6.0）分别加入三个10 ml塑料注射器（无鲁尔锁）中，每个注射器含有1.0 g水合小麦基日粮。40°C孵育30分钟后，用HCl将反应混合物酸化至pH 2.7–2.9。加入胃蛋白酶（460 μl，6,000 U/ml，Sigma），40°C孵育45分钟以模拟前胃/肌胃消化。随后进行十二指肠消化：加入NaHCO₃将反应混合物中和至pH 5.9–6.1，然后加入胰酶（500 μl，3.7 mg/ml，Sigma），40°C继续孵育2小时。整个消化过程期间，在指定时间点取样分析。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115；培养基：LB、YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（酵母常规培养）、22°C（蛋白表达）、40°C（体外消化）；转速：200 rpm（常规）、100 rpm（DTT处理）、150 rpm（电转后复苏）、250 rpm（酶活测定）；抗生素：zeocin 25/100 μg/ml、卡那霉素 50 μg/ml；电转参数：1,500 V、200 Ω、25 μF；离心：10,500 g 2 min、18,000 g 4°C 15 min；NaH₂PO₄•2H₂O浓度：0.11–1.00 g/l；硫酸铵沉淀：40%；透析：48 h（换液3次）；洗脱：250 mM咪唑、0.1 M Tris−HCl pH 8.0；酶活测定：5 mM植酸钠、0.1 M甘氨酸−HCl pH 2.5、37°C、250 rpm、15 min、10%三氯乙酸终止；易错PCR：10 mM Tris−HCl、50 mM KCl、10 mM MgCl₂、0.5 mM MnCl₂、1 mM dCTP、1 mM dTTP、0.2 mM dATP、0.2 mM dGTP、2.5 U Taq、94°C 1 min/54°C 1 min/72°C 2 min×25循环；体外消化：胃蛋白酶460 μl（6,000 U/ml）45 min、胰酶500 μl（3.7 mg/ml）2 h、pH 5.8–6.0→2.7–2.9→5.9–6.1
研究结果
3.1 分泌型植酸酶生产毕赤酵母的构建
本研究旨在工程化改造毕赤酵母，使其响应外部Pi浓度产生植酸酶。获得了用于分泌型植酸酶生产的毕赤酵母转化子，命名为GS115-PPHO89-YF和GS115-PPHO89-phyA。在天然PPHO89启动子控制和初始Pi（NaH₂PO₄•2H₂O）浓度为0.11 g/l的条件下，毕赤酵母转化子的胞外植酸酶表达明显：GS115-PPHO89-YF为0.35 U/ml，GS115-PPHO89-phyA为0.34 U/ml（图2A）。
毕赤酵母转化子相当稳定。研究人员使用不同划线代数（在zeocin抗生素压力下相隔十代以上）的酵母进行蛋白表达。所得分泌植酸酶的活性彼此相差在30%以内，表明质粒已成功整合至酵母染色体。另一方面，细胞裂解物中检测到的胞内植酸酶活性非常低（约0.03 U/ml），与野生型GS115（GS115-WT）相似（图2A）。
【数据】胞外植酸酶活性：GS115-PPHO89-YF 0.35 U/ml、GS115-PPHO89-phyA 0.34 U/ml；胞内植酸酶活性：约0.03 U/ml；不同划线代数活性差异：30%以内；初始Pi浓度：0.11 g/l
3.2 纯化植酸酶的动力学特性
分泌型植酸酶使用Ni-NTA金属亲和层析纯化。分离所得植酸酶的纯度通过SDS-PAGE确认（图2B）。两种植酸酶的表观分子量与预测值相近，表明它们未被糖基化，这与在A. niger、S. cerevisiae和K. lactis中产生的phyA形成对比。糖基化可能影响酶的特性。虽然K. lactis中产生的phyA活性保持不变，但S. cerevisiae中产生的phyA在去糖基化后活性损失9%、热稳定性损失40%。
对酶的动力学特性进行了评估。在室温下，YF和phyA均表现出相似的pH-活性曲线，在酸性pH值下具有最佳活性。在pH 7.0时，酶活性下降至几乎检测不到的水平（图3A）。
就温度效应而言，两种植酸酶在45°C时活性最高，与室温相比几乎增加了2至3倍（图3B）。在不同pH和温度下测试了植酸酶的稳定性。在pH 2.5条件下，YF和phyA在2小时孵育后分别保留73%和89%的活性；而在pH 5.5条件下，它们分别保留45%和33%的活性（图3C）。两种植酸酶在高温下均稳定：YF在40°C孵育4小时后保留90%以上的活性；而phyA在相同处理后保留73%的活性（图3D）。这些动力学测量表明，两种植酸酶在酸性pH值下表现出最高催化活性，最适温度为45°C，与先前研究报道相似。植酸酶强大的pH和温度稳定性使其可用于动物消化道中的植酸消化。
【数据】最适温度：45°C（较室温提高2–3倍）；pH 7.0时活性：几乎检测不到；pH 2.5孵育2 h：YF保留73%、phyA保留89%；pH 5.5孵育2 h：YF保留45%、phyA保留33%；40°C孵育4 h：YF保留>90%、phyA保留73%；S. cerevisiae产phyA去糖基化后：活性损失9%、热稳定性损失40%
3.3 外部Pi浓度与植酸酶产量之间的相关性
在PPHO89启动子控制下，两种分泌型植酸酶的表达与外部Pi浓度的增加呈负相关，这已在活性测定（图4A和B）和Western blot分析（图4C和D）中得到证实。
当YPD生长培养基中外部Pi浓度（NaH₂PO₄•2H₂O）从0.11 g/l增加到1.00 g/l时，植酸酶表达降低了4.5至9.5倍。这一结果与先前的报道相似，即CLLip脂肪酶表达与不同Pi浓度下PPHO89启动子的不同活性相关。在毕赤酵母中，PPHO89启动子最初用于调节钠磷酸盐共转运体（PHO89基因）的表达，该转运体控制Pi吸收并允许正常细胞生长。这种Pi稳态对酵母和其他真核生物很重要。然而，用植酸酶基因替换PHO89基因似乎对酵母生长没有显著影响（数据未显示）。这并不完全出乎意料，因为其作用可以被一些功能相似的基因（如PHO5和PHO84）所补偿。在本研究的毕赤酵母PPHO89-植酸酶系统中，有限的Pi或过量的Pi可以"开启"或"关闭"启动子对植酸酶表达的调控。表达的植酸酶可以消化植酸底物并释放Pi，释放的Pi反过来在反馈回路中调节植酸酶的表达水平。
【数据】Pi浓度范围：0.11–1.00 g/l NaH₂PO₄•2H₂O；植酸酶表达降低倍数：4.5–9.5倍
3.4 Pi响应型启动子的定向进化
进行了三轮易错PCR，以生成对外部Pi浓度变化具有增强敏感性的突变PPHO89启动子序列。共筛选了2000多个突变体。通过测量培养上清液中yEGFP的荧光强度，评估了所得突变PPHO89启动子在GS115-PPHO89-yEGFP中的强度。生成了一个PPHO89突变体文库，包括36个突变体，活性范围在原始启动子的6%至170%之间，并进行了研究。
选择几个代表性突变体驱动YF植酸酶表达。其中，发现PPHO89ΔTT在响应外部Pi浓度调控YF植酸酶表达方面表现出增强的敏感性（图5A）。
DNA序列分析显示，在-597和-598位置缺失了两个T核苷酸（图5B）。在-583位置有一个CACGTT基序，非常接近双T核苷酸缺失位点。先前研究报道了一种PHO调控系统，其中Pi信号可通过Pho4p（一种正调控因子）与启动子结合位点（两个结合序列，UASp1：CACGTT（对pho4p低亲和力）和UASp2：CACGTG（对pho4p高亲和力））结合而传递至PHO8基因。PHO89启动子具有相同的共有结合位点，表明毕赤酵母来源的PHO89基因也受PHO调控系统的控制。因此，PPHO89ΔTT启动子可能具有更强的强度和更高的转录效率，因为结合位点UASp1的结构发生了改变。
【数据】三轮易错PCR；筛选突变体：>2000个；文库突变体：36个；活性范围：6%–170%；缺失位点：-597和-598位双T核苷酸；CACGTT基序位置：-583
3.5 模拟体外消化模型
将酵母GS115-PPHO89-YF、GS115-PPHO89-phyA或GS115-PPHO89ΔTT-YF添加到小麦基日粮中，在孵育的第一个小时内Pi产量增加。到整个过程结束时（3.25小时），消化混合物中的Pi浓度约为1.4 g/l，显著高于使用野生型毕赤酵母的对照。事实上，分泌植酸酶的酵母释放的Pi量与10 U商品化植酸酶获得的量相当（图6A）。
在目前使用1 g小麦基日粮的实验设置中，10 U应该大大过量，因为饲料工业中通常使用的植酸酶量仅为1 U/g日粮。当在不同初始Pi浓度下进行消化模拟时，发现从小麦基日粮中释放的Pi（间接反映植酸酶表达）随初始Pi浓度的增加而降低（图6B）。例如，当初始浓度为1.15 g/l时，消化模拟后Pi增加仅为0.18 g/l，与初始Pi浓度为0.31 g/l时的增加量相比约为50%。
总之，较低Pi浓度环境将刺激工程酵母表达和分泌大量植酸酶，从而更有效地消化小麦基日粮，从小麦基日粮的植酸中释放更多Pi。这种Pi对植酸酶表达的负反馈调控在消化模拟模型中的结果与YPD培养基培养条件下获得的结果一致（图4）。在动物饲料工业中，外源植酸酶可以直接添加到日粮中，或通过添加表达植酸酶的酵母以全细胞生物催化剂概念引入。毕赤酵母已被工程化改造用于此目的。
【数据】消化总时间：3.25 h；终Pi浓度：约1.4 g/l；商品化植酸酶用量：10 U（饲料工业常规用量：1 U/g日粮）；初始Pi 1.15 g/l时Pi增加：0.18 g/l（约为初始Pi 0.31 g/l时的50%）；小麦基日粮用量：1.0 g
讨论与解读
本研究成功在毕赤酵母中表达了两种热稳定性植酸酶用于植酸水解。两种分泌型植酸酶均具有良好的pH和温度稳定性。更重要的是，植酸酶表达可响应外部Pi浓度的变化而调控：一种由Pi响应型启动子驱动的"按需定制"状态。研究使用水合小麦基日粮的模拟体外消化模型评估了工程毕赤酵母在饲料工业和动物废弃物处理中的潜在应用。结果强烈表明，工程毕赤酵母释放Pi的效率可与商品化植酸酶相当，验证了使用全细胞生物催化剂进行植酸水解的创新概念。对工程毕赤酵母的进一步可行性研究值得开展，例如将其添加到单胃动物的饲料颗粒中，以追踪植酸的体内消化情况。
编译者解读
本研究将Pi响应型启动子与植酸酶分泌表达耦合，构建了"环境磷浓度感知—植酸酶按需生产—植酸分解释放Pi"的负反馈闭环系统，体现了合成生物学中动态调控的设计理念。定向进化策略（易错PCR+荧光报告基因筛选）有效提升了启动子的响应灵敏度，PPHO89ΔTT突变体的获得表明启动子近端调控元件的微小改变即可显著影响表达输出。从应用角度看，全细胞生物催化剂免去了酶纯化成本，且酵母本身可作为饲料蛋白来源，具有双重价值。但研究仍处于体外模拟阶段，体内消化环境的复杂性（微生物竞争、酶降解、肠道吸收动力学）可能影响实际效果，后续需在动物实验中验证。
参考来源
Xie Z. Engineering and optimization of phosphate-responsive phytase expression in Pichia pastoris yeast for phytate hydrolysis. Enzyme and Microbial Technology, 2020. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109533
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109533