来源：Accelerating the conversion of black chokeberry anthocyanins toward vinylphenolic pyranoanthocyanins by displaying phenolic acid decarboxylase from Lactiplantibacillus plantarum on the surface of Pichia pastoris（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑果腺肋花楸花青素（ACNs）虽具有优良生物活性，但其固有不稳定性严重制约了在食品工业中的应用。本研究将植物乳杆菌来源的酚酸脱羧酶（LPPAD）展示于毕赤酵母GS115细胞表面，构建全细胞催化剂（WCB），在酸性条件下高效催化花青素转化为稳定性显著提升的吡喃花青素（PACNs）。该策略规避了游离酶酸稳定性差、分泌量低的瓶颈，省去了酶蛋白纯化步骤，为浆果发酵产品中花青素稳定性改良提供了经济可行的生物催化方案。
研究背景
黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）属蔷薇科腺肋花楸属，果实富含多酚、有机酸、蛋白质等生物活性成分，其中花青素（ACNs）为主要多酚类物质。ACNs主要以糖苷形式存在，通过糖苷键稳定本身不稳定的花青素母核。ACNs具有抗炎、抗氧化、清除自由基、改善视力及预防心血管疾病等多种生物活性。然而，ACNs固有稳定性差，在加工和储存过程中易降解——活性氧或多酚氧化酶可引发氧化反应生成不稳定的邻醌；pH依赖性结构转变导致不同结构互变异构，中性条件下形成粉紫色不稳定的醌型碱，碱性条件下开环形成查尔酮衍生物造成不可逆褪色；酶或化学作用还可能导致脱糖基化形成不稳定花青素元。在发酵黑果产品中，羟基肉桂酸可被酚酸脱羧酶（PAD）酶促转化为4-乙烯基衍生物，进而与ACNs反应形成稳定性更强且具优良生物活性的吡喃花青素（PACNs）。然而，发酵过程通常呈酸性，微生物分泌的PAD水平有限且PAD酸稳定性差，导致PACN产量低下。本研究通过将植物乳杆菌来源的PAD展示在毕赤酵母GS115表面，构建全细胞催化剂，以期解决上述瓶颈。
研究方法
2.1 黑果腺肋花楸粉末、菌株、质粒与培养基
黑果腺肋花楸粉末由黑果腺肋花楸（中国辽宁）经制浆、酶解、离心、浓缩、灭菌和干燥获得。来自植物乳杆菌的PAD（LPPAD，GenBank登录号WP_054396867.1）经密码子优化后合成，用于在大肠杆菌BL21(DE3)（Invitrogen，美国加利福尼亚）中异源表达，并展示于毕赤酵母GS115表面。毕赤酵母GS115由暨南大学姚冬生教授惠赠。植物乳杆菌购自广东益可维生物技术有限公司（中国广州），副干酪乳杆菌购自荷兰皇家帝斯曼（荷兰希伦）。原核表达载体pET28a(+)-LPPAD（补充图1A）及酵母表面展示载体pPIC9k-LPPAD-flag-GCW61（GCW61基因NCBI登录号：XM_002494287）（补充图1B）由上海捷瑞生物工程有限公司（中国上海）以优化密码子合成。缓冲甘油复合物（BMGY）和缓冲甲醇复合物（BMMY）培养基（pH 6.0）含有1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%酵母氮碱、1%甘油（BMGY）或1%甲醇（BMMY）、0.4 mg/L生物素和50 mM磷酸钾缓冲液。BMGY和BMMY培养基分别用于细胞生长和蛋白诱导。
【数据】菌株：大肠杆菌BL21(DE3)、毕赤酵母GS115、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌；培养基：BMGY/BMMY（pH 6.0）；组分：1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%酵母氮碱、1%甘油或1%甲醇、0.4 mg/L生物素、50 mM磷酸钾缓冲液
2.2 重组LPPAD在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化
将携带LPPAD基因的pET28a(+)载体转化至BL21(DE3)感受态大肠杆菌细胞，在含卡那霉素（50 μg/mL）的Luria-Bertani（LB）培养基平板上于37°C培养12–16小时直至出现单菌落。挑取单菌落接种LB培养基，37°C过夜培养。随后将细胞培养物以1:100稀释接种于50 mL LB培养基中，培养至OD600达0.6–0.8，然后用1.0 mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）（生工，中国上海）于16°C、180 rpm诱导16小时。通过高速冷冻离心（10,000 g，5 min，4°C）收集细胞，重悬于缓冲液A（20 mM PBS、500 mM NaCl、3 mM咪唑，pH 7.0）。细胞悬液经超声破碎后，高速冷冻离心（10,000 g，5 min，4°C）获得细胞裂解上清液。将上清液上样至用缓冲液A平衡的Ni²⁺-NTA琼脂糖亲和层析柱（通用电气公司，美国）。目标蛋白与柱上Ni²⁺结合，杂质用缓冲液A洗去。目标蛋白用缓冲液B（20 mM PBS、500 mM NaCl、240 mM咪唑，pH 7.0）洗脱。所得洗脱液即为重组LPPAD（reLPPAD）。reLPPAD用超滤离心管（Millipore，美国）于4°C、4000 ×g、20 min条件下浓缩并换液（100 mM柠檬酸与足量200 mM磷酸氢二钠缓冲液）。reLPPAD经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。SDS-PAGE使用12%（w/v）聚丙烯酰胺凝胶。蛋白样品与上样缓冲液混合，100°C煮沸5 min后进行SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝快速染色液（碧云天，中国）染色，纯水脱色3–5 h。蛋白浓度通过BCA法（Applygen，中国北京）测定。
【数据】抗生素：卡那霉素50 μg/mL；诱导剂：IPTG 1.0 mM；诱导条件：16°C、180 rpm、16 h；离心：10,000 g、5 min、4°C；纯化：Ni²⁺-NTA亲和层析；洗脱缓冲液：20 mM PBS、500 mM NaCl、240 mM咪唑、pH 7.0；浓缩换液：4°C、4000 ×g、20 min；SDS-PAGE：12%凝胶、100°C煮沸5 min；脱色：3–5 h
2.3 展示型LPPAD（dLPPAD）的构建与表达
pPIC9k-LPPAD-flag-GCW61质粒含有AOX1启动子、α-因子信号肽、FLAG标签、LPPAD cDNA，以及EcoRI、MluI和NotI限制性酶切位点。质粒经线性化后整合至毕赤酵母GS115基因组。转化细胞在MD琼脂平板上于30°C筛选培养2–3天，通过菌落PCR确认转化（Ejike, Chan, Lim, & Lim, 2021）。菌落PCR筛选使用LPPAD-F（5’-GAATTCACCAAGACTTTCAAG-3′）和LPPAD-R引物（5’-CGCTTAAATCAACAAAGCAA-3′）寻找含pPIC9k-LPPAD-flag-GCW61质粒的阳性克隆。cDNA在25 μL PCR反应体系中扩增，含0.5 μL LPPAD-F（0.2 μM）和LPPAD-R（0.2 μM）、2 μL基因组、12.5 μL 2 × Rapid Taq Master Mix（Vazyme，中国）。PCR在Mastercycler®热循环仪（Eppendorf，德国）上进行：初始变性95°C 5 min；34个循环的变性95°C 30 s、退火51°C 30 s、延伸72°C 1 min；最终延伸72°C 5 min。转化子在BMGY培养基中于30°C预培养至OD600（Biochrom，英国）为2–6。随后将细胞转移至含1% v/v甲醇的BMMY培养基中。每24小时补加新鲜甲醇至终浓度1% v/v。
【数据】筛选：MD琼脂平板、30°C、2–3天；PCR条件：95°C 5 min初始变性；34个循环（95°C 30 s、51°C 30 s、72°C 1 min）；72°C 5 min终延伸；预培养：BMGY、30°C、OD600 2–6；诱导：BMMY、1% v/v甲醇、每24 h补加
2.4 流式细胞术分析
流式细胞术分析参照Kobori等方法（Kobori, Sato, & Osumi, 1992）。诱导酵母细胞用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤三次，重悬于含1%牛血清白蛋白的PBS中（4°C），稀释至约OD600为5.0。随后，细胞悬液与Anti-flag DYKDDDDK标签多克隆抗体（Proteintech，中国武汉）以1:2000稀释度在200 μL总体积中室温旋转孵育2 h。然后细胞用PBS洗涤，与CoraLite488标记的山羊抗兔IgG（H+L）（Proteintech，中国武汉）以1:2000稀释度在200 μL总体积中室温孵育1 h。洗涤三次后，使用流式细胞仪（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州富勒顿）检测细胞。GS115/pPIC9K以相同程序处理作为阴性对照。
【数据】抗体稀释度：一抗1:2000、二抗1:2000；孵育：室温2 h（一抗）、室温1 h（二抗）；细胞密度：OD600约5.0；洗涤：PBS（pH 7.4）三次
2.5 全细胞催化剂的制备
诱导酵母细胞（dLPPAD）用0.04 M pH 6.0 Britton-Robinson（B-R）缓冲液洗涤三次，再用0.2 M海藻糖溶液（作为冻干保护剂）洗涤，6000 rpm离心5 min（4°C），弃去上清液。细胞置于−80°C冷冻30 min，然后冻干20 h。冻干粉末即为WCB，用于后续活性测试实验。
【数据】洗涤缓冲液：0.04 M pH 6.0 B-R缓冲液；保护剂：0.2 M海藻糖；离心：6000 rpm、5 min、4°C；冷冻：−80°C、30 min；冻干：20 h
2.6 利用酸碱指示剂监测PAD活性
将reLPPAD、dLPPAD、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和GS115分别加入含6.09 mM pCA的0.1%（w/v）溴甲酚紫水溶液（麦克林，中国）中。反应在1.5 mL离心管中进行，37°C孵育。pCA溶液在反应前经涡旋、超声处理（100 W，10 s）和加热（65°C，10 min）以助溶。反应过程中于0、5、10、20和40 min用移液器取0.2 mL样品，脱羧活性可通过pH变化引起的颜色从黄色（pH 5.2）变为紫色（pH 6.8）来检测。
【数据】底物：pCA 6.09 mM；指示剂：0.1%（w/v）溴甲酚紫；温度：37°C；超声：100 W、10 s；加热：65°C、10 min；取样时间：0、5、10、20、40 min；颜色变化：黄（pH 5.2）→紫（pH 6.8）
2.7 脱羧活性测定与酶动力学分析
羟基肉桂酸脱羧活性测定：将reLPPAD或dLPPAD加入0.2 mL缓冲液C（0.1 M柠檬酸与足量0.2 M磷酸氢钠缓冲液，pH 5.0）中，缓冲液含四种羟基肉桂酸（pCA：6.09 mM，CA：5.55 mM，FA：5.14 mM，SA：4.46 mM）。反应在1.5 mL离心管中进行，37°C孵育。羟基肉桂酸溶液在反应前经涡旋、超声处理（100 W，20 s）和加热（65°C，10 min）以助溶。灭活酶溶液作为对照。每组重复三次。反应时间为1–30 min（取决于羟基肉桂酸类型），加入50 μL纯甲醇终止反应。随后测定反应结束时羟基肉桂酸的产率。一个酶活力单位定义为在测定条件下每分钟脱羧1.0 μM羟基肉桂酸所需的酶量。动力学分析如下：
【数据】缓冲液：0.1 M柠檬酸+0.2 M磷酸氢钠（pH 5.0）；底物浓度：pCA 6.09 mM、CA 5.55 mM、FA 5.14 mM、SA 4.46 mM；温度：37°C；超声：100 W、20 s；加热：65°C、10 min；反应时间：1–30 min；终止：50 μL纯甲醇；重复：3次
2.8 花青素转化与全细胞催化
（本节原文未在节选中完整呈现，原文未详述具体操作参数。）
【数据】原文未详述
2.9 全细胞催化体系
（本节原文未在节选中完整呈现，原文未详述具体操作参数。）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 reLPPAD的表达与纯化
reLPPAD在胞外表达并显示可检测的酶活性。reLPPAD带His标签，经Ni²⁺-NTA亲和层析纯化。SDS-PAGE显示纯化条带约为20 kDa（图1A）。浓缩后reLPPAD的浓度为6.10 mg/mL。
图1 | reLPPAD和dLPPAD的表达鉴定。reLPPAD的SDS-PAGE分析（A）。阴性对照GS115/pPIC9K（B）和毕赤酵母GS115/pPIC9K-LPPAD-flag-GCW61（C）的流式细胞术分析。GS115与dLPPAD之间CoraLite488平均计数的流式细胞术比较（D）。
【数据】蛋白纯度：SDS-PAGE约20 kDa条带；蛋白浓度：6.10 mg/mL
3.2 LPPAD在毕赤酵母GS115表面的展示
为检验GPI锚定蛋白是否能将LPPAD直接整合至细胞壁，使用flag标签作为LPPAD的报告基因。流式细胞术用于分析融合蛋白在酵母细胞表面的定位。dLPPAD转化子在BMMY培养基中诱导120 h。收集诱导细胞，以抗FLAG抗体为一抗、CoraLite488山羊抗兔IgG（H+L）为二抗标记，定量分析目标蛋白LPPAD-flag的表达。流式细胞术分析显示，dLPPAD（图1B）细胞表面的荧光强度较阴性对照菌株GS115/pPIC9K（图1C）增加。这表明GCW61锚定蛋白能有效引导LPPAD定位至毕赤酵母GS115细胞表面。从50 mL培养基中可获得约2克WCB冻干粉末。
【数据】诱导时间：120 h；产量：50 mL培养基→约2 g WCB冻干粉
3.3 reLPPAD与dLPPAD的特性表征
将dLPPAD、reLPPAD、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和GS115细胞分别加入含pCA的0.1%（w/v）溴甲酚紫水溶液中（图2A）。仅dLPPAD和reLPPAD在40 min内变为紫色。这些结果表明reLPPAD成功表达并纯化，LPPAD成功展示在毕赤酵母GS115细胞表面。dLPPAD和reLPPAD的最适pH和温度分别测定为6.0–7.0和45°C（图2B、C）。在4–35°C预孵育60 min后，dLPPAD和reLPPAD均保留超过95%的酶活性。然而，当预孵育温度超过45°C时，酶活性急剧下降。值得注意的是，在这些高温条件下，dLPPAD表现出比reLPPAD更高的残余活性（图2D）。dLPPAD和reLPPAD在pH 6.0–8.0范围内均表现出相对稳定性，但在pH 3.0–5.0时，reLPPAD的活性急剧下降，仅保留约30%的初始活性，而dLPPAD在相同条件下维持70–80%的活性（图2C）。类似地，在pH 3.0–5.0孵育60 min后，dLPPAD保留超过70%的酶活性，而reLPPAD则迅速丧失催化活性（图2E）。这些结果表明，表面展示的应用显著增强了reLPPAD的酸稳定性和热稳定性。固定化酶因其增强的稳定性和改善的功能特性而在工业应用中被广泛青睐。dLPPAD的最适温度和pH与reLPPAD相似。dLPPAD热稳定性的提高可能归因于酶与壳聚糖之间形成的共价键，该共价键增强了酶的构象刚性，增加了热变性所需的活化能（Li, Teng, et al., 2022）。
图2 | reLPPAD与dLPPAD的不同特性表征。含溴甲酚紫的pCA溶液与reLPPAD及不同细胞显色反应（A），最适温度（B），最适pH（C），热稳定性（D），pH稳定性（E），可重复使用性（F）。
【数据】最适pH：6.0–7.0；最适温度：45°C；热稳定性：4–35°C孵育60 min保留>95%活性，>45°C急剧下降；pH 3.0–5.0：reLPPAD保留约30%活性，dLPPAD保留70–80%；pH 3.0–5.0孵育60 min：dLPPAD保留>70%活性
3.4 脱羧活性与酶动力学分析
以pCA、FA、CA和SA为底物系统拟合了reLPPAD的Michaelis-Menten曲线（补充图2），并测定了reLPPAD和dLPPAD对四种羟基肉桂酸的脱羧活性（补充表1）。两种LPPAD变体的脱羧活性按以下降序排列：pCA ≈ CA > > FA > SA。值得注意的是，reLPPAD对pCA和CA表现出极高的脱羧活性，显著超过其对FA和SA的活性。使用3.0 μg reLPPAD，0.2 mg pCA和CA可在60–80 s内完全脱羧。dLPPAD表现出与reLPPAD相似的底物特异性。然而，reLPPAD相对于dLPPAD的相对酶活性约为1:100,000，表明100 mg WCB约相当于1 μg纯化酶蛋白。
【数据】底物特异性：pCA ≈ CA > > FA > SA；催化效率：3.0 μg reLPPAD在60–80 s内完全脱羧0.2 mg pCA和CA；相对活性比：reLPPAD:dLPPAD ≈ 1:100,000；换算关系：100 mg WCB ≈ 1 μg纯化酶
3.5 催化前后AMAs的组成变化
为比较reLPPAD和dLPPAD的催化能力并阐明催化前后组成和颜色的变化，采用第2.9节所述的全细胞催化体系。分别施加终浓度0.01 μg/mL的reLPPAD和1.0 mg/mL的dLPPAD。采用HPLC监测各组分的变化（图3A）。催化前检测到四种AMAs（图3A，峰1至4）。随后，加入pCA并与生物催化剂孵育48 h后，出现四种新组分（图3A，峰5至8）。为鉴定新组分，对峰1至8进行HPLC-MS分析（图3B，补充图3和4）。峰1至8对应未知化合物的分子离子和苷元离子m/z比分别相差162和132（表1）。这些质量差异与ACNs和PACNs的糖苷片段在离子阱（MS/MS）分析中易进一步断裂的特征一致。具体而言，162和132的质量差异分别对应葡萄糖苷或半乳糖苷以及阿拉伯糖苷或木糖苷的丢失。基于相关研究（Bai et al., 2014; Wen et al., 2020），推测峰1至4代表ACNs，峰5至8对应PACNs。峰1至4被鉴定为ACNs：花青素-3-O-半乳糖苷（Cy-3-gala）、花青素-3-O-葡萄糖苷（Cy-3-gluc）、花青素-3-O-阿拉伯糖苷（Cy-3-arab）和花青素-3-O-木糖苷（Cy-3-xylo）（Wen et al., 2020）。峰5至8被初步归属为相应的PACNs：花青素-3-O-半乳糖苷-4-乙烯基苯酚（Cy-3-gala-4-vinylphenol）、花青素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚（Cy-3-gluc-4-vinylphenol）、花青素-3-O-阿拉伯糖苷-4-乙烯基苯酚（Cy-3-arab-4-vinylphenol）和花青素-3-O-木糖苷-4-乙烯基苯酚（Cy-3-xylo-4-vinylphenol）。结构转化得到确认，四种乙烯基苯酚-PACNs的最终结构被提出（图3B）。在pH 3.0孵育96 h后，reLPPAD、dLPPAD和对照组之间的残余4-VP水平未观察到显著差异（图3C，Con）。这一结果可归因于投入的dLPPAD酶活性不足以完全脱羧所有pCA，且与reLPPAD相比，dLPPAD产生的更多4-VP被用于合成更多PACN（图3D、E；峰5和7因丰度较高被用作比较点），这解释了过度合成的4-VP（图3C）未被反映的原因。这些发现进一步证实，在pH 3.0条件下，dLPPAD比reLPPAD表现出更高的可利用性。
图3 | AMAs和PACNs的结构表征。AMAs + pCA + reLPPAD中520 nm色谱图AMAs（峰1至4）和PACNs产物（峰5至8）（A）。AMAs和PACNs产物的结构表征（B）。4-VP变化分析（C），峰5（D），峰7（E），Con：AMAs + pCA；reLPPAD：AMAs + pCA + reLPPAD。
【数据】酶用量：reLPPAD 0.01 μg/mL、dLPPAD 1.0 mg/mL；反应时间：48 h（HPLC检测）、96 h（4-VP分析）；pH 3.0；质量差：162（葡萄糖苷/半乳糖苷丢失）、132（阿拉伯糖苷/木糖苷丢失）；鉴定结果：4种ACNs（Cy-3-gala、Cy-3-gluc、Cy-3-arab、Cy-3-xylo）和4种对应PACNs
3.6 dLPPAD转化花青素
为进一步验证dLPPAD作为WCB将AMAs转化为PACNs的可行性，基于第3.5节将dLPPAD浓度提高至100 mg/mL。同时考察了植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对AMAs的发酵效果，在不同时间点监测ACNs和PACNs的峰面积。引入微生物细胞后的前12 h内观察到总ACN含量显著下降（图4A、B：c、d、e和f）。值得注意的是，pH显著影响ACN水平和外观颜色：在弱酸性条件下（pH 6.0，图4B中b和d），ACN降解比强酸性条件（pH 3.0，图4B中a和c）加速，导致更深的紫色（图4A：b和d）。ACN具有不同的化学形式，取决于溶液pH：黄烊盐阳离子（红色）、无水醌型碱（紫色）、甲醇假碱（无色）、查尔酮（淡黄色）和离子化醌型碱（蓝色）。ACN在pH 3.0时通过辅色作用或自缔合显示红色。
图4 | 催化过程和发酵的表征。颜色变化（A），ACNs变化分析（B），4-VP（C），PACNs（D）。a和b：AMAs + pCA；c和d：AMAs + pCA + dLPPAD；e：AMAs + pCA + 副干酪乳杆菌；f：AMAs + pCA + 植物乳杆菌。不同条件下0 h和96 h的520 nm色谱图。
【数据】dLPPAD浓度：100 mg/mL；ACN下降时间：前12 h；pH影响：pH 6.0加速ACN降解（较pH 3.0）、颜色更深紫色
讨论与解读
稳定的PACNs是ACNs有前景的衍生物，通过ACNs与4-乙烯基衍生物自发反应形成。PADs在提高4-乙烯基衍生物的形成速率和产率方面发挥关键作用。本研究成功表达并纯化了来自植物乳杆菌的PAD，系统表征了reLPPAD对多种羟基肉桂酸的催化效率和米氏常数（Km）。为拓展PAD的应用潜力，采用高密度生长酵母——毕赤酵母作为表面展示宿主，将LPPAD锚定于其细胞壁。这一策略促进了稳健且多功能生物催化剂的发展。结果表明，reLPPAD能高效脱羧四种羟基肉桂酸，而dLPPAD表现出增强的酸性耐受性，在pH 3.0时保留85%活性。dLPPAD还显著加速AMAs向四种不同PACNs的转化。LPPAD分泌水平低和酸不稳定性天然制约了其应用。dLPPAD可提高LPPAD的酸稳定性并提供获取LPPAD的稳定方法。此外，与reLPPAD相比，dLPPAD可避免昂贵的酶蛋白纯化和浓缩步骤，降低后续使用门槛，并避免引入大肠杆菌的风险。dLPPAD的可重复使用性（图2F）以及WCB更便于储存和运输，可进一步降低成本。
编译者解读
本研究巧妙利用酵母表面展示技术，将酸稳定性差的游离酶转化为耐受pH 3.0的全细胞催化剂，直接回应了浆果发酵体系的真实需求。方法学上的一大亮点是WCB冻干粉形式——100 mg WCB约相当于1 μg纯化酶，虽然比活性看似悬殊，但免纯化、可重复使用和便于储运的综合优势使其在工业化场景中更具现实可行性。从合成生物学角度看，该策略代表了"酶固定化"的一种生物路线：以细胞壁锚定替代化学交联，既增强了酶构象刚性，又避免了载体毒性问题。局限在于展示效率仍有限——高浓度dLPPAD（100 mg/mL）才能驱动高效转化，未来若能优化锚定蛋白或采用多拷贝整合，有望进一步提升单位细胞催化负荷。
参考来源
Zhou W. Accelerating the conversion of black chokeberry anthocyanins toward vinylphenolic pyranoanthocyanins by displaying phenolic acid decarboxylase from Lactiplantibacillus plantarum on the surface of Pichia pastoris. Food Chemistry, 2025. DOI: 10.1016/j.foodchem.2025.143408
DOI: 10.1016/j.foodchem.2025.143408