来源：Production of L-lactic acid from methanol by engineered yeast Pichia pastoris（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乳酸是合成可生物降解聚乳酸的核心平台化合物，但传统微生物发酵路线成本高企，削弱了其市场竞争力。本研究在毕赤酵母中建立了以甲醇为唯一碳源的L-乳酸合成新路线——通过筛选乳酸脱氢酶、改造辅因子偏好、阻断乳酸消耗途径以及线粒体区室化合成等多维策略，最终在补料分批发酵中实现4.2 g/L L-乳酸产量。这项工作展示了甲醇生物转化作为低碳循环经济模式的显著潜力。
研究背景
乳酸（2-羟基丙酸）是一种基础性平台化合物，可转化为丙烯酸、丙二醇等多种功能化学品。更重要的是，乳酸可聚合成聚乳酸（PLA），后者凭借可生物降解性、生物相容性和柔韧性，被视为石油基塑料的理想替代品。PLA市场快速增长，大幅拉动了乳酸需求。乳酸存在L型和D型两种立体异构体，其中L-乳酸因与人体代谢兼容而在食品和医药领域应用更广。
化学合成乳酸通常得到外消旋混合物，而微生物发酵目前占据市场供应90%以上份额，且可通过基因工程精准生产特定立体异构体。自然界中，乳酸菌是天然具备乳酸合成能力的微生物类群，其乳酸脱氢酶（Ldh）活性高，是工业乳酸生产最常用的菌株。近年来，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母等模式微生物中已实现乳酸过量生产。然而，以甲醇等一碳底物驱动乳酸合成的研究仍处于起步阶段，甲醇生物转化作为一种新兴的低碳循环经济模式，亟需开发高效细胞工厂。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用工程酵母菌株均源自HIS4营养缺陷型菌株PC111，并采用CRISPR-Cas9系统进行构建。引导RNA通过Chopchop（https://chopchop.cbu.uib.no/）设计。基因编辑供体通过重叠延伸PCR构建，在靶位点两侧带有1 kb同源臂。酵母转化及验证方法参照前期研究（Cai等，2021）。定制DNA寡核苷酸引物由上海生工生物工程有限公司合成。来自乳酸片球菌的PaLDH（GeneBank: AB776697.1）、德氏乳杆菌的LdLDH（GeneBank: GQ150560.1）、瑞士乳杆菌的LhLDH（GenBank: DQ826139.1）、乳酸乳球菌的LlLDH（GeneBank: M88490.1）以及植物乳杆菌的LpLDH（GeneBank: D90340.1）基因均经密码子优化后由上海生工生物工程有限公司合成。
【数据】菌株：PC111（HIS4营养缺陷型）；同源臂：1 kb；基因来源：5种乳酸菌LDH基因；合成机构：Sangon Biotech（上海）
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌DH5α用于质粒构建，在LB培养基（5.0 g/L酵母提取物、10.0 g/L胰蛋白胨、10.0 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm条件下培养。YPD培养基（20.0 g/L蛋白胨、10.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L葡萄糖）添加相应抗生素用于筛选正确酵母转化子。所有用于发酵的毕赤酵母菌株首先在5 mL最小培养基（2.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、10.0 g/L葡萄糖、痕量金属和维生素溶液，如需则补充40.0 mg/L组氨酸）中于试管内30°C、220 rpm过夜预培养。随后酵母细胞经800 g离心5 min去除上清，重悬于新鲜最小培养基中，以20.0 g/L葡萄糖或10.0 g/L甲醇为碳源，初始OD600为0.1或0.2。
【数据】LB培养基：5.0 g/L酵母提取物、10.0 g/L胰蛋白胨、10.0 g/L NaCl；温度：37°C；转速：220 rpm；YPD培养基：20.0 g/L蛋白胨、10.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L葡萄糖；最小培养基：2.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、10.0 g/L葡萄糖；预培养：30°C、220 rpm、过夜；离心：800 g、5 min；碳源：20.0 g/L葡萄糖或10.0 g/L甲醇；初始OD600：0.1或0.2
2.3 分子建模
序列比对使用Molecular Operating Environment中的工具完成。LlLdh蛋白ID为KHE77636.1。蛋白结构采用swiss-model同源建模，建模模板为2zqy。
【数据】建模模板：2zqy；蛋白ID：KHE77636.1
2.4 荧光显微镜分析
为确认线粒体靶向，将带有线粒体信号肽（MSP）的LlLdhL39R与增强绿色荧光蛋白（eGfp）通过柔性接头GGGS在N端融合，然后将该表达盒转化至酵母菌株PC111。细胞在含10.0 g/L甲醇的最小培养基中于30°C、220 rpm培养24 h。取1 mL菌液，1000 g离心5 min，弃上清，用预热至37°C的Mito Tracker Red CMXRos工作液（Mito Tracker Red CMXRos:PBS = 1:1000）轻轻悬浮细胞，37°C孵育30 min。孵育后，细胞1000 g离心5 min，弃上清，加入预热至37°C的PBS缓冲液重悬细胞。取5 μL细胞悬液滴加至载玻片，使用EVOS M5000显微镜（ThermoFisher Scientific）在绿色荧光和红色荧光模式下观察。
【数据】甲醇浓度：10.0 g/L；培养：30°C、220 rpm、24 h；离心：1000 g、5 min；CMXRos工作液比例：1:1000；孵育：37°C、30 min；观察体积：5 μL
2.5 细胞内NAD(H)和NADP(H)定量
发酵24 h后收集细胞进行辅因子测定。定量方法参照前期研究修改（Vemuri等，2007）。每个样品收集约4 × 10^8个细胞，用冷PBS洗涤两次。细胞经离心（4°C、4000 g、5 min）后立即重悬于0.3 mL 0.2 M HCl（用于NAD+和NADP+）或0.2 M NaOH（用于NADH和NADPH）中。加入适量玻璃珠在低温下剧烈震荡破碎细胞，随后60°C孵育30 min。接着加入0.3 mL 0.2 M NaOH（用于NAD+和NADP+）或0.2 M HCl（用于NADH和NADPH）进行中和反应。样品12000 g离心5 min。NAD+/NADH循环测定采用等体积的1.0 M bicine缓冲液（pH 8.0）、乙醇、40.0 mM乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）、4.2 mM 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT）、2倍体积的16.6 mM吩嗪乙基硫酸盐和3倍体积的水组成的试剂混合物（预先25°C孵育）。向96孔板中加入：10 μL中和提取物、180 μL试剂混合物。最后加入10 μL酵母乙醇脱氢酶（500 U/mL，A3263-7.5KU，Sigma）启动反应。使用酶标仪（Tecan Spark 3）在25°C下记录570 nm吸光度2 min。所有荧光测量值均归一化至蛋白浓度，蛋白浓度通过微量分光光度计在280 nm（1 ABS = 1 mg/mL）及340 nm校正模式下测定。NADP+/NADPH循环测定采用等体积的1.0 M bicine缓冲液（pH 8.0）、30.0 mM葡萄糖-6-磷酸、40.0 mM EDTA（pH 8.0）、4.2 mM MTT、2倍体积的16.6 mM吩嗪乙基硫酸盐和3倍体积的水组成的试剂混合物（预先25°C孵育）。向96孔板中加入：10 μL中和提取物、180 μL试剂混合物。最后加入10 μL酵母葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（200 U/mL，A003981，上海生工）启动反应。使用酶标仪（Tecan Spark 3）在25°C下记录570 nm吸光度2 min。所有荧光测量值均归一化至蛋白浓度。
【数据】细胞数量：4 × 10^8；HCl/NaOH浓度：0.2 M；破碎后孵育：60°C、30 min；离心：12000 g、5 min；bicine缓冲液：1.0 M（pH 8.0）；EDTA：40.0 mM（pH 8.0）；MTT：4.2 mM；吩嗪乙基硫酸盐：16.6 mM；乙醇脱氢酶：500 U/mL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶：200 U/mL；检测波长：570 nm；检测时间：2 min；温度：25°C
2.6 生物反应器补料分批发酵
生物反应器补料分批发酵在T&J-Minibox6 1.5 L（Dibier）中进行，初始工作体积500 mL。初始批式阶段以初始接种OD600为1.0，在含10.0 g/L甲醇作为碳源的最小培养基中进行。温度、搅拌、通气和pH通过D2MS系统监测控制。温度维持在30°C，搅拌维持在400 rpm，通气设置为1 vvm。溶解氧维持在低水平（5%以上），pH通过自动添加6.0 M KOH维持在pH 6.5。补料分批培养期间，细胞补加甲醇和10×补充组分（25.0 g/L (NH4)2SO4、72.0 g/L KH2PO4、5.0 g/L MgSO4·7H2O、10×痕量金属和10×维生素溶液）。甲醇溶液补加速率为0.3–0.9 mL/h，保持甲醇浓度低于20.0 g/L。补充组分溶液补加速率为0.1–0.3 mL/h。
【数据】反应器：T&J-Minibox6 1.5 L；初始工作体积：500 mL；初始OD600：1.0；甲醇：10.0 g/L；温度：30°C；搅拌：400 rpm；通气：1 vvm；溶解氧：>5%；pH：6.5（6.0 M KOH自动调节）；甲醇补加速率：0.3–0.9 mL/h；甲醇浓度上限：20.0 g/L；补充组分补加速率：0.1–0.3 mL/h；补充组分：25.0 g/L (NH4)2SO4、72.0 g/L KH2PO4、5.0 g/L MgSO4·7H2O、10×痕量金属、10×维生素
2.7 分析方法
OD600使用分光光度计测量。L-LA购自上海生工。L-LA和甲醇浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定。1 mL发酵液样品13000 g离心10 min，上清过滤用于测定胞外L-LA，沉淀细胞用于测定胞内L-LA。向沉淀细胞中加入0.3 mL水和适量玻璃珠，1500 rpm震荡30 min破碎细胞。然后补加0.7 mL水，13000 g离心10 min。所有样品经0.2 μm针头过滤器过滤，使用Aminex HPX-87G色谱柱（Bio-Rad）在配备RID检测器的1260 infinity II HPLC（Agilent，美国）上分析。色谱柱以5.0 mM H2SO4为流动相，流速0.5 mL/min，50°C运行30 min。乳酸的异构体（D/L）通过HPLC测定。1 mL发酵液样品13000 g离心10 min……
【数据】离心：13000 g、10 min；细胞破碎：1500 rpm、30 min；滤膜：0.2 μm；色谱柱：Aminex HPX-87G；流动相：5.0 mM H2SO4；流速：0.5 mL/min；柱温：50°C；运行时间：30 min
研究结果
3.1 乳酸脱氢酶的筛选
Ldh在乳酸生物合成中发挥关键作用，催化丙酮酸以NAD(P)H为辅因子还原为乳酸。天然产乳酸菌株中，Ldh通常表现出高催化活性。然而异源表达后，Ldh活性因宿主不同而有显著差异，从而影响工程菌株的乳酸产量。为构建高效产乳酸菌株，筛选合适的LDH基因至关重要，尤其是能够良好适应甲醇代谢的基因。
本研究评估了来自不同天然产乳酸菌株的五个L-LDH基因，包括来自乳酸片球菌的PaLDH、德氏乳杆菌的LdLDH、瑞士乳杆菌的LhLDH、乳酸乳球菌的LlLDH和植物乳杆菌的LpLDH。这些L-LDH基因来源于高乳酸产量的天然菌株，在异源细胞工厂中表现良好，乳酸滴度超过100.0 g/L。所有L-LDH基因均针对毕赤酵母进行了密码子优化。为全面评估各种L-Ldh从甲醇生产L-乳酸的能力，分别使用强甲醇诱导型启动子P AOX1和组成型启动子P TEF1驱动L-LDH基因表达，构建了重组菌株。所有菌株均在10.0 g/L甲醇培养基中培养。
如图1A所示，甲醇发酵期间L-乳酸产量范围为100.0 mg/L至200.0 mg/L，其中PaLdh在48 h时达到最高L-乳酸滴度193.0 mg/L。另一个值得注意的观察结果是，所有由组成型启动子P TEF1驱动的菌株在24 h内达到L-乳酸产量峰值，随后滴度逐渐下降。相比之下，由P AOX1启动子驱动的菌株需要额外24 h才能达到产量峰值。这一延迟可归因于P AOX1严格的甲醇诱导特性——该启动子受葡萄糖强烈抑制，从而延迟了L-乳酸合成的启动。
有趣的是，所有表达L-LDH的菌株在甲醇耗尽时均表现出显著的L-乳酸再消耗现象（图1B），到72 h时L-乳酸被完全消耗。这一现象提示两种可能的假设：其一，毕赤酵母可能具有内源性的L-乳酸利用途径，在碳限制条件下支持生物量积累；其二，Ldh在特定条件下表现出强大的催化可逆性，促进L-乳酸转化回丙酮酸。值得注意的是，LdLdh在甲醇发酵期间几乎没有L-乳酸积累，可能归因于密码子优化不理想或其他因素。发酵后期观察到的L-乳酸再消耗现象对大规模L-乳酸生产工艺构成挑战。
同时进行了20.0 g/L葡萄糖的摇瓶发酵以评估Ldh的能力。结果表明，除LdLdh外，所有Ldh均能使毕赤酵母产生L-乳酸。具体而言，LlLdh的异源表达使毕赤酵母在24 h内从葡萄糖快速积累3.1 g/L L-乳酸，略优于其他Ldh（图1C）。发酵结束时，培养基中仍有约7.0 g/L葡萄糖未被利用（图1D），这可能是由于L-乳酸积累引起的pH波动，在缺乏pH控制的摇瓶条件下损害了细胞活力。此外，产L-乳酸菌株的生物量较对照组降低，凸显了L-乳酸积累对细胞生长的负面影响。另外，葡萄糖发酵中L-乳酸的再利用问题不如甲醇发酵中严重。
【数据】L-乳酸产量范围：100.0–200.0 mg/L；PaLdh最高滴度：193.0 mg/L（48 h）；L-LA完全消耗时间：72 h；LlLdh葡萄糖发酵产量：3.1 g/L（24 h）；残余葡萄糖：约7.0 g/L；对照Ldh产量参考：>100.0 g/L（异源细胞工厂）
3.2 乳酸脱氢酶辅因子偏好改造
所有已报道Ldh的一个共同特征是严格依赖NADH作为辅因子。乳酸的合成大量消耗NADH，可能导致细胞氧化还原失衡，并增加甲醇向分解代谢途径的分流，造成碳损失。前期研究表明，毕赤酵母在甲醇代谢期间表现出强大的磷酸戊糖途径，为甲醛同化提供充足的Xu5P供应，并产生足够的NADPH供化学合成使用。本研究通过改造Ldh辅因子特异性来增强L-乳酸合成。
前期研究强调，来自枯草芽孢杆菌的BsLdhV39R突变体对NADP(H)的依赖性显著增加。由于Ldh家族内部结构高度相似，序列比对显示所选Ldhs在第39位附近存在保守氨基酸序列。通过定点突变，将第39位附近的缬氨酸（V）、异亮氨酸（I）和亮氨酸（L）替换为精氨酸（R）（图2A）。
在甲醇发酵期间，所有工程化Ldh变体均表现出显著改善的L-乳酸产量。具体而言，LlLdh工程菌株LXY18中的L39R突变在48 h时达到334.4 mg/L的L-乳酸滴度，是辅因子特异性未改变对照菌株的2.3倍（图2B）。Asp38可能负责对NAD(H)的偏好，因为它能与辅因子的核糖2′-和3′-羟基形成氢键。通常，带负电的Asp38排斥辅因子NADP+的磷酸基团。当中性氨基酸Leu39突变为带正电的Arg39时，稳定了Arg39与NADP+带负电磷酸基团之间的相互作用，显著克服了电荷排斥（图2C）。这增强了LlLdh接受辅因子NADP+的能力，从而提高乳酸产量。此外，在NADP(H)额外磷酸基团位点引入更大的氨基酸（Arg）并未影响辅因子结合，表明空间因素对辅因子结合并非关键。
同时测定了含或不含LlLdh突变的工程菌株的胞内辅因子水平。图2D显示，将Leu39突变为Arg39并未显著改变胞内NADH水平，但增加了NADPH的消耗。这一结果表明Leu39突变不影响LlLdh与NAD(H)的结合，增强的L-乳酸产量可能归因于NADPH作为辅因子的参与。尽管L-乳酸产量显著增加，但甲醇耗尽时L-乳酸的快速利用并未减少。这些结果强烈提示毕赤酵母中存在L-乳酸消耗途径。因此，识别并抑制该途径对于有效积累L-乳酸至关重要。
【数据】LlLdh L39R突变株LXY18产量：334.4 mg/L（48 h）；提升倍数：2.3倍；突变位点：第39位（V/I/L→R）；NADH水平：无显著变化；NADPH消耗：增加
3.3 阻断细胞内乳酸消耗途径
毕赤酵母基因组测序鉴定出两个内源LDH基因，命名为DLD1和DLD2（图3A）。尽管野生型菌株无论使用何种碳源都无法有效积累L-乳酸，但推测DLD1和DLD2对L-乳酸具有较高亲和力，可能催化其转化为丙酮酸。因此，在工程菌株LXY18中首先删除了这两个基因的完整编码序列。然而，这些内源LDH基因的敲除并未显著增加L-乳酸的最大积累量（图3B）。
L-乳酸合成细胞工厂表现出强烈的L-乳酸再利用现象，降低了产物合成效率。L-乳酸与丙酮酸之间的相互转化涉及电子转移氧化还原反应，需要氧化还原伴侣的参与。NAD+是L-乳酸典型的氧化还原伴侣，但电子亲和力相对较低。此外，细胞色素c也可作为L-乳酸转化为丙酮酸过程中的氧化还原伴侣，其电子亲和力强于NAD+。前期……
【数据】内源LDH基因：DLD1、DLD2；敲除策略：完整编码序列删除；L-LA最大积累量：无显著增加
3.4 线粒体区室化合成与双通路细胞工厂
图4展示了胞内双通路增强L-乳酸生产的策略。通过将LlLdhL39R与线粒体信号肽融合，实现了L-乳酸合成途径的线粒体定位。荧光显微镜分析确认了LlLdhL39R-eGfp融合蛋白的线粒体靶向——CMXRos红色荧光与eGfp绿色荧光的共定位清晰可见（图4B）。双通路细胞工厂中，L-乳酸在胞质和线粒体两个区室中同时合成（图4C），进一步提升了L-乳酸的产量。
【数据】线粒体定位：LlLdhL39R-MSP-eGfp融合蛋白；验证方法：CMXRos共定位
3.5 HIS4原位回收与菌株优化
图5显示了菌株LXY27在10.0 g/L甲醇培养基中HIS4原位回收前后的L-乳酸产量（A）、生长和甲醇消耗（B）情况。HIS4原位回收后，菌株在10.0 g/L + 10.0 g/L（48 h补加）甲醇培养基中的L-乳酸产量（C）、生长和甲醇消耗（D）进一步改善。
【数据】甲醇浓度：10.0 g/L；补加策略：48 h补加10.0 g/L
3.6 生物反应器补料分批发酵
图6A显示了最终工程菌株LXY27H在1.5 L生物反应器中以甲醇为碳源进行补料分批发酵生产L-乳酸的时间进程。L-乳酸滴度（红色圆圈）、生长曲线（绿色方块）和甲醇消耗（蓝色三角）均被记录。最终L-乳酸产量达到4.2 g/L。图6B展示了手性分离柱对乳酸异构体的分离结果，确认了产物为L-乳酸。
【数据】反应器体积：1.5 L；最终L-LA产量：4.2 g/L；产物构型：L-乳酸
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略在毕赤酵母中成功建立了甲醇基L-乳酸合成路线。从天然产乳酸菌株中筛选出适配甲醇代谢的乳酸脱氢酶是关键起点——PaLdh在甲醇发酵中表现最佳，而LlLdh在葡萄糖发酵中产量最高。辅因子偏好改造是另一核心突破：通过单氨基酸突变（L39R）将LlLdh的辅因子偏好从NADH拓展至NADPH，使L-乳酸产量提升2.3倍，同时不影响与NAD(H)的结合。内源乳酸消耗途径的鉴定与阻断尝试虽未显著提高最大积累量，但揭示了毕赤酵母中复杂的乳酸代谢网络。最终通过线粒体区室化合成与双通路策略，结合补料分批发酵优化，实现了4.2 g/L L-乳酸的产量。
作者指出，未来仍需在细胞絮凝、铁代谢、甲醇代谢及发酵工艺优化等方面开展广泛的代谢工程研究，以进一步提升甲醇基乳酸合成细胞工厂的效率。这些进展对于建立甲醇生物转化的标准化工业流程至关重要。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究最值得借鉴之处在于"酶-途径-细胞"三层递进式工程策略：先筛选适配宿主的酶元件，再通过辅因子工程优化酶催化效率，最后借助区室化工程突破代谢瓶颈。以甲醇为碳源生产乳酸契合低碳制造趋势，但4.2 g/L的产量与葡萄糖路线（通常可达100 g/L以上）仍有数量级差距。甲醇代谢通量分配、乳酸转运与耐受性等问题尚未根本解决。未来若能将甲醇同化效率与产物外排协同优化，这条路线有望成为真正的工业替代方案。
参考来源
Wu, X. (2025). Production of L-lactic acid from methanol by engineered yeast Pichia pastoris. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131730
DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131730