来源：Metabolic engineering of Pichia pastoris as an industrial chassis enables biosynthesis of dopamine from methanol（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲醇作为可再生、碳中性的C1原料，正在成为绿色生物制造的新兴碳源。本研究以工业底盘菌株毕赤酵母（Pichia pastoris）为宿主，通过系统代谢工程策略——包括强化莽草酸途径、解除反馈抑制、阻断多巴胺降解、增强NADH再生及加速甲醇同化——首次实现了以甲醇为唯一碳源的高效多巴胺生物合成。摇瓶水平产量达1533 mg/L，15 L发酵罐中通过pH优化将多巴胺自氧化降至最低，最终产量达到12.2 g/L，为迄今报道的以甲醇为唯一碳源的多巴胺最高产量。
研究背景
全球能源需求的快速增长加剧了环境与气候挑战，也推动了对可持续原料的迫切需求。甲醇作为一种有机单碳（C1）化合物，凭借其来源丰富、可通过CO₂与氢的电催化过程实现碳中和生产、不与粮食安全竞争等优势，已成为微生物发酵的理想替代碳源。此外，甲醇易于储存和运输，还原度高的特性也有利于获得更高的产品得率。
毕赤酵母（Komagataella phaffii）是一种甲基营养型酵母，已获得美国FDA的GRAS（Generally Recognized as Safe）认证。其Crabtree阴性表型使其能够在无机盐培养基中进行高密度发酵。甲醇诱导型启动子（如pAOX1）可在甘油流加阶段严格抑制异源基因表达，通过精细控制甘油和甲醇的补料，实现生物量积累与产物合成在时间上的分离。这些特性使毕赤酵母成为以甲醇为底物合成精细化学品的理想底盘细胞。然而，此前尚无研究报道以甲醇为唯一碳源高效合成多巴胺的成功案例。
研究方法
2.1 质粒、菌株与基因
本研究所用全部质粒和菌株列于补充材料。酪氨酸羟化酶（CYP76AD1和CYP76AD5）来源于甜菜（Beta vulgaris）。多巴脱羧酶（DODC）来源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。所有基因均由北京擎科公司针对毕赤酵母进行密码子优化（见补充材料）。基因DAS2（PAS_chr3_0834）从毕赤酵母X33的cDNA中扩增获得。毕赤酵母X33（HIS4⁺, Mut⁺）作为所有遗传操作的背景菌株。
【数据】菌株：毕赤酵母X33（HIS4⁺, Mut⁺）；基因来源：CYP76AD1/5来自甜菜，DODC来自恶臭假单胞菌；密码子优化：擎科公司（北京）
2.2 遗传操作
基因删除和表达盒整合（见补充材料）采用CRISPR-Cas9系统完成。质粒构建和片段整合使用高保真DNA聚合酶（TOYOBO，日本）进行常规体外DNA片段扩增。Taq聚合酶（ZOMANBIO，中国）用于菌落聚合酶链式反应（PCR）筛选阳性克隆。基因删除时，使用CRISPR direct工具（https://crispr.dbcls.jp/）选择20 bp gRNA靶向序列。gRNA质粒采用体外Gibson组装法构建，将含有gRNA序列的DNA片段与载体骨架重组。供体DNA片段通过重叠延伸PCR将靶基因的上游和下游同源臂（各800 bp长度）融合构建。转化菌落在含250 mg/L G418（Macklin，中国）的YPD琼脂平板上培养3天进行分离。随后在YPD培养基中过夜培养。所有gRNA序列列于补充材料。
【数据】gRNA长度：20 bp；同源臂长度：800 bp；筛选抗生素：G418 250 mg/L；筛选时间：3天
2.3 培养基与生长条件
预培养时，三个重复的工程菌株独立预接种于YPD（20 g/L胰蛋白胨（OXOID，中国）、10 g/L酵母提取物（OXOID，中国）、20 g/L D-葡萄糖）或YPG（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L甘油）培养基中培养24 h，并用0.1 M PBS（pH = 6.0）洗涤两次。多巴胺生产的摇瓶培养在250 mL摇瓶中进行，工作体积为25 mL YNB培养基，含有10 g/L (NH₄)₂SO₄、13.4 g/L YNB（Biotopped，中国）、0.1 mol/L PBS（pH = 6.0）。毕赤酵母细胞在30°C、250 rpm的摇床（ZQZY-BF8E，中国）中培养5天，初始OD₆₀₀为1.0。发酵过程中，每24小时补加1%（v/v）甲醇。
【数据】预培养时间：24h；YNB培养基：(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，YNB 13.4 g/L，PBS 0.1 mol/L（pH=6.0）；培养条件：30°C、250 rpm、5天；初始OD₆₀₀：1.0；甲醇补加：1%（v/v）/24h
2.4 补料分批发酵
多巴胺生产的补料分批发酵在15 L发酵罐（HM23044，BLT，广州，中国）中进行。首先用YPD培养基制备毕赤酵母种子液，然后以4%（v/v）的接种量将种子液接种到发酵罐中进行高密度发酵。整个发酵过程分为三个阶段。
阶段Ⅰ（甘油批次阶段）：细胞在BSM培养基中培养以积累初始生物量，持续约16–18 h。当溶解氧（DO）水平回升至80%以上时，进入阶段Ⅱ（甘油补料阶段）以进一步增加生物量。含1.2%（v/v）PTM1的50%（w/v）甘油溶液以12–16 g/L/h的速率补加。当OD₆₀₀达到300–350时，停止甘油补料，毕赤酵母细胞饥饿0.5–1 h后进入阶段Ⅲ（甲醇诱导阶段）。
阶段Ⅲ中，含1.2%（v/v）PTM1的100%甲醇以0.5–6 g/L/h的递增速率补加。甘油生长阶段，通过添加氨水维持pH为5.5，温度保持在30°C，通过调节转速、通气速率和罐压维持DO在30%以上。甲醇诱导阶段，用氨水将pH控制在6、4.5或3，温度保持在25°C，DO维持在20%以上。
整个发酵过程持续约156 h。用于高密度发酵的BSM培养基含有4%甘油、0.093% CaSO₄·2H₂O、1.147% MgSO₄·7H₂O、1.82% K₂SO₄、0.413% KOH、2.67% H₃PO₄和0.435% PTM1。PTM1含有0.05% CoCl₂·6H₂O、0.6% CuSO₄·5H₂O、6.5% FeSO₄·7H₂O、0.002% H₃BO₃、0.008% NaI、0.5% H₂SO₄、0.02% Na₂MoO₄·2H₂O、2% ZnCl₂、0.3% MnSO₄·H₂O和0.02%生物素。初始培养体积为5 L。
【数据】接种量：4%（v/v）；阶段Ⅰ：BSM培养基，16–18h；阶段Ⅱ：50%甘油+1.2% PTM1，12–16 g/L/h；阶段Ⅲ：100%甲醇+1.2% PTM1，0.5–6 g/L/h递增；甘油阶段：pH 5.5、30°C、DO>30%；甲醇阶段：pH 6/4.5/3、25°C、DO>20%；总时长：约156h；初始体积：5L
2.5 细胞NAD(H)定量
NADH/NAD⁺比率的检测按照我们先前描述的方法进行。具体而言，使用碧云天NAD⁺/NADH检测试剂盒（WST-8法，南通，中国）测定胞内NADH/NAD⁺比率。简要步骤如下：离心去除培养基后，加入1 mL预冷裂解液并用玻璃珠涡旋裂解细胞。裂解液在4°C下以12,000 rpm离心10 min。所得上清液分为两份100 µL等分试样：一份用于NADH测定，一份用于胞内NAD_total测定，均按照制造商方案进行。NAD⁺水平通过从NAD_total中减去NADH计算获得。上清液中的蛋白质浓度使用Bradford法进行定量，所有测得的荧光强度均归一化至蛋白质浓度。
【数据】离心条件：12,000 rpm、4°C、10min；裂解液体积：1mL；样品分装：100 µL×2；蛋白定量：Bradford法
2.6 甲醇定量
发酵液上清中的甲醇通过HPLC进行定量。具体方法为：在指定时间点收集1 mL细胞培养液，上清液以10,000 rpm离心5 min，然后用孔径为0.22 μm的尼龙针头过滤器过滤。取5 μL过滤后的上清液使用HPLC（SHIMADZU，日本）分析。色谱柱为Carbomix H-NP10:8%。流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.7 mL/min（等度洗脱）。甲醇使用示差折光检测器（RID-20A）检测。
【数据】样品量：1mL；离心：10,000 rpm、5min；进样量：5 μL；色谱柱：Carbomix H-NP10:8%；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.7 mL/min；检测器：RID-20A
2.7 产物及代谢物提取与定量
摇瓶中的多巴胺使用HPLC-UV分析和定量。分析标准品均购自Macklin。样品以10,000 rpm离心5 min，过滤（0.22 μm），必要时进行额外稀释。取5 μL上清液在配备Phenomenex Synergi Hydro RP色谱柱（4 µm，250 mm长，4.6 mm内径）的Agilent 1220 HPLC系统上分离。代谢物分离流速为1 mL/min，梯度如下：0–10 min从5% B到20% B，10–15 min从20% B到50% B，15–15.1 min从50% B到95% B，15.1–25 min保持95% B，25–25.1 min从95% B到5% B，25.1–35 min保持5% B。溶剂A为含0.1% TFA的水，溶剂B为含0.1% TFA的甲醇。多巴胺和l-DOPA在280 nm波长下通过吸光度检测。
【数据】离心：10,000 rpm、5min；进样量：5 μL；流速：1 mL/min；检测波长：280nm；流动相A：0.1% TFA/水；流动相B：0.1% TFA/甲醇
研究结果
3.1 毕赤酵母中多巴胺的从头生物合成
多巴胺的生物合成始于酪氨酸的羟基化及随后的l-DOPA脱羧，分别由酪氨酸羟化酶和l-DOPA脱羧酶催化（图2A）。酪氨酸的羟基化是多巴胺生物合成中的关键限速步骤。有三种潜在酶可催化酪氨酸羟基化：（1）TyrH（哺乳动物来源的酪氨酸羟化酶），依赖氧和四氢生物蝶呤（BH4）作为辅因子；（2）HpaBC，微生物来源的双组分黄素依赖性单加氧酶，天然催化4-羟苯基乙酸（4-HPA）降解途径的第一步生成3,4-二羟苯基乙酸（HPC）；（3）CYP76AD1/5/6，来源于甜菜的NADPH依赖性P450单加氧酶，具有高底物特异性。
本研究选择过表达甜菜来源的CYP76AD1/5来完成酪氨酸羟基化，基于两点考虑：（1）高底物特异性——P450酶具有优异的底物特异性，可有效减少副产物形成；（2）增强辅因子供应——与酿酒酵母相比，甲醇培养的毕赤酵母表现出显著升高的NADPH/NADP⁺比率，为NADPH依赖的CYP76AD1/5/6催化酪氨酸转化为l-DOPA提供了充足的辅因子供应。
通过在X33菌株的PNSI-2位点整合由AOX1启动子和AOX1终止子控制的CYP76AD1 W13L/F309L和DODC基因，构建了多巴胺生物合成途径，获得菌株DA01（图2A）。DA01菌株培养上清的HPLC分析显示，在7.2 min和8.5 min处出现两个峰，分别对应多巴胺和l-DOPA的标准品（图2C）。此外，LC-MS分析进一步确认纯化后的多巴胺质谱数据与多巴胺标准品一致（见补充材料）。发酵120 h后，DA01菌株产生18 mg/L多巴胺，未检测到l-DOPA积累（图2B-C）。
据报道，ARO3、ARO4和ARO7是莽草酸途径通量的关键调控因子。因此，本研究过表达这些内源酶编码基因以增强多巴胺产量。过表达PpARO4、PpARO3和PpARO7分别将多巴胺产量提高至38 mg/L、47 mg/L和30 mg/L（图2B）。菌株X33、DA01和DA03的生物量无显著差异，表明较低水平的多巴胺对毕赤酵母未产生明显毒性（图2D）。同时，DA03的甲醇消耗保持不变（图2E），表明毕赤酵母在维持多巴胺生物合成的同时能够自我调节其整体甲醇代谢网络。
【数据】DA01产量：18 mg/L多巴胺（120h）；PpARO4过表达：38 mg/L；PpARO3过表达：47 mg/L；PpARO7过表达：30 mg/L；HPLC出峰时间：7.2 min（多巴胺）、8.5 min（l-DOPA）
3.2 解除毕赤酵母中的反馈抑制
在莽草酸途径中，第一个反应是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的醛醇缩合，由3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（DAHPS）催化。DAHPS的酶活性直接决定莽草酸途径的代谢通量。在酿酒酵母等模式生物中，DAHPS受下游芳香族化合物的别构调节和反馈抑制（图3A）。酿酒酵母中另一个关键步骤是由分支酸变位酶ARO7（CM）催化的分支酸转化为预苯酸，该酶同样受到酪氨酸介导的反馈调节抑制（图3A）。
在毕赤酵母中，芳香族化合物的反馈抑制同样限制了莽草酸途径通量。与酿酒酵母同源物的序列比对揭示了保守的调控残基（ScARO3 D154N、ScARO4 K229L和ScARO7 G141S）（图3B-C）。本研究在毕赤酵母DAHPS（PpARO4 D151N、PpARO3 D154N、PpARO4 K219L和PpARO3 K222L）和CM（PpARO7 G139S）中引入了类似突变。在DA01菌株中过表达单突变体显著提高了多巴胺产量。内源毕赤酵母DAHPS突变体的表现与其酿酒酵母对应物相当。在内源突变体中，PpARO4 K219L的过表达获得了比PpARO4 D151N更高的产量（73.4 mg/L），而PpARO3 D154N优于PpARO3 K222L（65.6 mg/L）（图3D）。
进一步将各单突变组合构建了双突变体PpARO4 D151N/K219L和PpARO3 D154N/K222L。然而，与单突变体相比，双突变体的过表达并未进一步提高多巴胺产量（图3E）。将ScARO7 G141S和PpARO7 G139S整合到DA01菌株的PNSI-8位点后，菌株DA12（表达PpARO7 G139S）的多巴胺产量达到118 mg/L，比菌株DA07（ScARO7 G141S）提高49%，比亲本菌株DA01提高5.56倍（图3D）。这表明内源毕赤酵母ARO7突变体相比酿酒酵母来源的突变体表现出显著更高的催化活性。
综上，本研究鉴定了毕赤酵母来源的DAHPS和CM突变体，最终选择了三个对反馈抑制不敏感的变体：PpARO4 K219L、PpARO3 D154N和PpARO7 G139S。为最大化莽草酸途径通量，将选定的突变基因进行组合过表达。将PpARO4 K219L引入DA12菌株获得DA15，多巴胺产量达到201 mg/L，比DA12提高70%（图3F）。进一步将PpARO3 D154N整合到DA15中获得DA16菌株，但意外地表现出多巴胺产量的急剧下降（120 h发酵后仅80 mg/L，图3F）。
值得注意的是，DA12、DA15和DA16菌株的生物量逐渐降低（图3G），这可能归因于甲醇培养的毕赤酵母固有的较低糖酵解通量。莽草酸途径与TCA循环之间对磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的竞争可能导致细胞能量不足，从而损害生长。这一现象与先前的报道一致。这种代谢限制可能解释了为什么ARO3和ARO4突变体的同时过表达在酿酒酵母中成功，但在适应甲醇的毕赤酵母中失败。
【数据】PpARO4 K219L：73.4 mg/L；PpARO3 D154N：65.6 mg/L；DA12（PpARO7 G139S）：118 mg/L，比DA07高49%，比DA01高5.56倍；DA15：201 mg/L，比DA12高70%；DA16：80 mg/L（120h）
3.3 多方面协同工程增强莽草酸途径通量
为将碳通量导向多巴胺生物合成，本研究在DA15菌株中系统优化了上游和下游代谢途径（图4A）。酪氨酸羟基化仍然是多巴胺合成的限速步骤。为提高催化效率，将DA15中的CYP76AD1 W13L/F309L替换为CYP76AD5，此前研究表明其具有更优的酪氨酸羟化酶活性。过表达CYP76AD5的DA17菌株从甲醇合成了298 mg/L多巴胺，比DA15提高48%（图4B）。
五功能芳香蛋白ARO1催化分支酸合成中的第4–6步。受Liu等人通过解脂耶氏酵母ARO1过表达使白藜芦醇产量提高1.4倍的启发，本研究在PNSI-10位点过表达了酿酒酵母来源的ScARO1。这一干预使多巴胺产量提高了21%，达到362 mg/L（图4B）。然而，单独过表达ScARO2与DA17相比产量略有下降，而ScARO1/ScARO2的组合过表达进一步降低了产量。
ARO10是Ehrlich途径中的α-酮酸脱羧酶，将芳香族和支链α-酮酸（如苯丙酮酸）转化为相应的醛。X33菌株含有两个推定的α-酮酸脱羧酶基因（PAS_chr3_0095、PAS_chr4_0314）。在DA18菌株中依次敲除这些基因获得DA21，多巴胺产量提高了39%（120 h时为503 mg/L；图4B）。随后过表达酿酒酵母预苯酸脱氢酶ScTYR1未能进一步提高产量。
【数据】DA17（CYP76AD5）：298 mg/L，比DA15提高48%；DA18+ScARO1：362 mg/L，提高21%；DA21（敲除两个α-酮酸脱羧酶基因）：503 mg/L（120h），提高39%
3.4 阻断多巴胺降解
多巴胺是一种高还原性儿茶酚胺类物质，容易被微生物代谢或非酶促氧化。在毕赤酵母中，含铜胺氧化酶（CuAOs）可能参与多巴胺的降解。通过序列比对和功能预测，本研究鉴定了一个推定的CuAO编码基因PAS_chr1-4_0441。在DA21菌株中敲除该基因获得DA22，多巴胺产量提高至579 mg/L，比DA21提高15%。这表明阻断多巴胺降解是提高产量的有效策略。
【数据】DA22（敲除PAS_chr1-4_0441）：579 mg/L，比DA21提高15%
3.5 增强辅因子再生和甲醇同化以提高多巴胺合成
多巴胺合成途径中，酪氨酸羟化酶CYP76AD5需要NADPH作为辅因子。甲醇代谢途径中，甲醇氧化为甲醛由醇氧化酶AOX催化，产生过氧化氢；甲醛氧化为甲酸由甲醛脱氢酶FLD催化，产生NADH。在甲醇培养条件下，胞内NADH供应充足，但NADPH的再生可能成为限制因素。
为增强NADH再生，本研究引入了大肠杆菌来源的酪氨酸羟化酶TyrA（图5A）。TyrA是一种NADH依赖的预苯酸脱氢酶，催化预苯酸转化为4-羟苯基丙酮酸（4-HPP），同时将NADH氧化为NAD⁺。在DA22菌株中过表达EcTyrA*获得DA25，多巴胺产量提高至853 mg/L（图5B）。
为进一步增强甲醇同化途径，本研究过表达了来自毕赤酵母自身的二羟丙酮合酶DAS2（PAS_chr3_0834）。DAS2是木酮糖单磷酸（XuMP）循环中的关键酶，催化甲醛与木酮糖-5-磷酸缩合生成二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸。在DA25菌株中过表达DAS2获得DA31，多巴胺产量进一步提高至1533 mg/L（图5B），比第一代菌株DA01提高了84.2倍。
【数据】DA25（EcTyrA）：853 mg/L；DA31（EcTyrA+DAS2）：1533 mg/L，比DA01提高84.2倍
3.6 15 L发酵罐中工程菌株DA31的多巴胺生产
多巴胺极易发生自氧化，尤其是在中性pH条件下。为最大限度地减少多巴胺在发酵过程中的自氧化损失，本研究在15 L发酵罐中考察了不同甲醇诱导pH条件（6.0、4.5和3.0）对DA31菌株多巴胺生产的影响（图6）。
在pH 6.0条件下（图6A），多巴胺产量在156 h时达到最高值，但发酵液颜色明显变深，表明多巴胺发生了显著的自氧化。在pH 4.5条件下（图6B），多巴胺的自氧化得到一定程度的抑制，产量进一步提高。在pH 3.0条件下（图6C），多巴胺自氧化被有效抑制，最终产量达到12.2 g/L，这是迄今报道的以甲醇为唯一碳源的多巴胺最高产量。
【数据】15 L发酵罐：pH 6.0/4.5/3.0三种条件；最高产量：12.2 g/L（pH 3.0）；发酵时间：约156h
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略，成功建立了以甲醇为唯一碳源的毕赤酵母多巴胺细胞工厂。通过强化莽草酸途径、解除反馈抑制、阻断多巴胺降解、增强NADH再生和优化甲醇同化等多方面协同策略，摇瓶水平多巴胺产量达到1553 mg/L，15 L发酵罐中通过pH优化将多巴胺自氧化降至最低，产量达到12.2 g/L。这是迄今报道的以甲醇为唯一碳源的多巴胺最高产量，并有望通过进一步优化超越基于葡萄糖的最高产量（22.58 g/L）。该工作不仅验证了甲醇作为工业微生物学高效底物的可行性，也为基于C1原料的生物制造提供了可扩展的代谢工程范式。
编译者解读：该研究的关键创新在于将甲醇——这一还原度极高的C1底物——与多巴胺合成途径的辅因子需求精准匹配。甲醇代谢天然产生大量NADH和NADPH，恰好满足了P450酶和TyrA*的辅因子需求，这种"底物-途径"的代谢适配性设计值得借鉴。从合成生物学应用角度看，12.2 g/L的产量已具备工业转化潜力，但pH 3.0的发酵条件对设备耐腐蚀性提出了更高要求。此外，DA16菌株中ARO3/ARO4共过表达导致的产量骤降提示，甲醇培养基质下PEP的分配存在特殊瓶颈，这一代谢约束机制值得进一步探究。总体而言，该研究为C1原料合成芳香族化合物提供了一个高水平的工程范例。
参考来源
Fan D. Metabolic engineering of Pichia pastoris as an industrial chassis enables biosynthesis of dopamine from methanol. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132915
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132915