来源：Adaptive laboratory evolution and reverse engineering enhances autotrophic growth in Pichia pastoris（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
合成生物学为CO₂向生物质或生物化学品的转化提供了多条路径。本研究在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris，Komagataella phaffii）中，通过适应性实验室进化获得自养生长的菌株，再借助CRISPR/Cas9反向工程手段，将进化中出现的单核苷酸多态性（SNP）逐一回插至亲本菌株，验证了磷酸核酮糖激酶（Prk）与烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶（Nma1）编码基因中的点突变对自养生长表型的因果贡献。研究还发现过氧化物酶体输入受体PEX5的突变可进一步提升自养生长性能。该工作为以CO₂为原料的平台型生物制造奠定了基础。
研究背景
自然界已发现七条CO₂固定途径，其中卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环是地球初级生产的主要驱动力。CBB循环于1948年被发现，1954年完全解析。尽管在作物和藻类的碳固定工程改造中已取得若干成果，但相比大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母等模式生物，其遗传操作仍是瓶颈。合成生物学的新兴方向是将由甲酸或甲醇等化学电子载体供能的CO₂固定途径整合入易工程改造的宿主中，构建"合成自养生物"。这类合成自养菌在工业中的应用有望在未来的循环生物经济中发挥关键作用，并有助于降低大气CO₂水平。本研究聚焦于在巴斯德毕赤酵母中实现合成自养，并通过适应性进化与反向工程解析关键突变的功能。
研究方法
2.1 质粒构建
所有表达盒和单链引导RNA（sgRNA）-人密码子优化的Cas9质粒均通过Golden Gate克隆法构建，使用已发表的克隆工具包（Gassler et al., 2019; Prielhofer et al., 2017）。用于替换编码序列所需的启动子、终止子和侧翼同源区通过PCR从野生型CBS7435基因组DNA（Promega, Wizard Genomic DNA Purification kit）扩增，聚合酶使用NEB的Q5高保真DNA聚合酶。所有最终用于游离表达或线性供体DNA生成的质粒（列于补充表1）均经酶切验证和Sanger测序确认。
【数据】克隆方法：Golden Gate克隆；聚合酶：Q5高保真DNA聚合酶；菌株：CBS7435；验证方法：酶切+Sanger测序
2.2 菌株构建
所有工程菌株均为巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）菌株CBS7435的衍生株（Küberl et al., 2011; Valli et al., 2016）。所有转化均按先前描述的方法进行（Cregg and Russell, 1998; Gasser et al., 2013; Gassler et al., 2019）。对于NMA1基因的替换，采用分裂标记策略与CRISPR/Cas9介导的基因整合相结合的方法（Gassler et al., 2019）。各异源片段的正确整合使用针对相应基因组位点设计的引物进行PCR验证。本研究所用全部菌株及其相应基因型列于补充表2。
【数据】亲本菌株：CBS7435；NMA1替换方法：分裂标记+CRISPR/Cas9；验证方法：PCR
2.3 摇瓶培养
培养物以600 nm处起始光密度（OD600）0.5接种于磷酸钾缓冲（0.1 M，pH = 6.0）的YNB培养基中，并补充10 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄。通常使用100 mL摇瓶，工作体积为10至20 mL，在CO₂控制培养箱（5% CO₂）中于30°C、180 rpm振荡培养。甲醇浓度在批次阶段结束后调至0.5%（体积比）以诱导表达，之后维持在1%（体积比）。整个培养过程中监测细胞生长（OD600和CDW测定）和代谢物谱（高效液相色谱分析）（Blumhoff et al., 2013）。
【数据】起始OD600：0.5；培养基：YNB+磷酸钾缓冲（0.1 M，pH=6.0）+(NH₄)₂SO₄ 10 g/L；摇瓶体积：100 mL；工作体积：10-20 mL；CO₂浓度：5%；温度：30°C；转速：180 rpm；甲醇浓度：诱导0.5%（vol/vol），维持1%（vol/vol）
2.4 无细胞提取物制备
取10 mL在自养条件下生长的细胞悬液，通过离心（3000 rpm，5 min）收获，弃去上清液。沉淀用PBS（pH = 7.4）洗涤两次。此后所有步骤均在冰上进行以防止蛋白质降解。洗涤后，细胞再次离心（3000 rpm，5 min，4°C），并重悬于500 μL细胞裂解缓冲液（pH = 7.5，20 mM HEPES，420 mM NaCl，1 mM MgCl₂，10%（体积比）甘油，含蛋白酶抑制剂，所有化学品购自Merck）。重悬细胞用机械破碎仪（FastPrep®-24, MP Biomedicals）在6 m s⁻¹条件下破碎三次，每次20 s，间歇在冰上冷却1 min。细胞破碎后，离心管在4°C、13000 rpm离心30 min，取无细胞蛋白提取物（上清液）用于后续分析。细胞提取物的蛋白质浓度使用Quick Start™ Bradford蛋白测定试剂盒按照制造商方案测定，以BSA进行定量。
【数据】离心：3000 rpm，5 min；PBS洗涤：2次；裂解缓冲液：pH 7.5，20 mM HEPES，420 mM NaCl，1 mM MgCl₂，10%甘油+蛋白酶抑制剂；破碎：FastPrep®-24，6 m/s，3×20 s，间歇冰浴1 min；离心：4°C，13000 rpm，30 min；蛋白定量：Bradford法，BSA标准
2.5 Prk活性测定
Prk测定基于将ADP形成偶联至NADH氧化，使用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶（LDH），采用修改自Kobayashi等人（2003）的方案。测定在96孔板中进行，总体积250 μL。测定混合物每mL含100 mM Tris-HCl（pH = 8.0）、100 mM KCl、10 mM MgCl₂、0.6 mM NADH、2 mM ATP、2.5 mM磷酸烯醇丙酮酸、5 U乳酸脱氢酶、2 U丙酮酸激酶、2 U磷酸核糖异构酶。每个反应加入10 μL细胞提取物（或稀释液）。反应通过添加核糖-5-磷酸（终浓度2 mM）启动，用酶标仪在340 nm处连续测定吸光度200 s。同时进行不加Prk底物的平行空白反应。加底物的吸光度斜率减去空白反应斜率进行校正。细胞提取物中1个单位对应每秒0.0023的吸光度变化。
【数据】测定体积：250 μL；Tris-HCl：100 mM（pH=8.0）；KCl：100 mM；MgCl₂：10 mM；NADH：0.6 mM；ATP：2 mM；磷酸烯醇丙酮酸：2.5 mM；LDH：5 U；丙酮酸激酶：2 U；磷酸核糖异构酶：2 U；细胞提取物：10 μL/反应；底物核糖-5-磷酸终浓度：2 mM；检测波长：340 nm；检测时间：200 s；1单位=0.0023 ΔA/s
2.6 Nma1活性测定
Nma1测定基于将Nma1催化的NAD⁺形成偶联至LDH催化的乳酸转化为丙酮酸。由于LDH反应的平衡偏向乳酸和NAD⁺一侧，为捕获形成的丙酮酸，添加D-谷氨酸-丙酮酸转氨酶（D-GPT），催化D-谷氨酸和丙酮酸转化为D-丙氨酸和2-氧代戊二酸。测定在96孔板中进行，总体积307.5 μL。测定混合物每mL含32.5 mM HEPES（pH 7.4）、9 mM MgCl₂、1.2 mM ATP、136 mM乳酸钠、180 μL瓶1、9.67 μL瓶3和9.67 μL瓶4（来自K-DLATE试剂盒，Megazyme）。每个反应使用30 μL细胞提取物，反应通过添加烟酰胺单核苷酸（终浓度1 mM）启动。在340 nm处记录吸光度10 min。同时进行不加烟酰胺单核苷酸的平行空白反应。加底物的吸光度斜率减去空白反应斜率进行校正。细胞提取物中1单位对应每秒0.0101的吸光度变化。
【数据】测定体积：307.5 μL；HEPES：32.5 mM（pH 7.4）；MgCl₂：9 mM；ATP：1.2 mM；乳酸钠：136 mM；K-DLATE试剂盒：瓶1 180 μL，瓶3 9.67 μL，瓶4 9.67 μL；细胞提取物：30 μL/反应；底物烟酰胺单核苷酸终浓度：1 mM；检测波长：340 nm；检测时间：10 min；1单位=0.0101 ΔA/s
2.7 Western blot分析
每份样品取10 μg总蛋白上样至NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific），以MOPS作为电泳缓冲液，180 V运行。使用Trans-Blot Turbo系统（BioRad）将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。使用HRP偶联抗体（AS07 257-HRP, Agrisera）检测Prk酶，抗体信号使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Scientific）按制造商方案显色。
【数据】上样量：10 μg总蛋白；凝胶：NuPAGE 4-12% Bis-Tris；缓冲液：MOPS；电压：180 V；转膜：Trans-Blot Turbo；抗体：HRP-抗Prk（AS07 257-HRP）
2.8 RNA提取与定量PCR测定转录水平
各菌株按前述自养条件培养至OD600约10后收获。在培养结束时取样进行RNA提取，取2 mL等分样品于4°C全速离心收获，重悬于1 mL TRI试剂溶液（Invitrogen），于-70°C保存备用。使用玻璃珠机械破碎细胞后，按照TRI试剂方案（Invitrogen）进行RNA提取，并采用近期描述的改良步骤（Heistinger et al., 2018）。DNA杂质使用DNA-free™试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行DNase处理消化。RNA浓度和质量用Nanodrop分光光度计和Bioanalyzer（Agilent）凝胶分析评估。cDNA使用oligo(dT)23引物（NEB）和Biozym cDNA合成试剂盒（Biozym）合成。定量PCR使用Biozym Blue S'Green qPCR试剂盒（Biozym）在Rotor-Gene Q仪器（Qiagen）上进行。PRK或NMA1基因转录水平的变化采用阈值循环（ΔΔCT）法计算，并以ACT1（PP7435_Chr3-0993）表达为内参进行归一化（Heistinger et al., 2018）。
【数据】收获OD600：约10；取样量：2 mL；TRI试剂：1 mL；保存温度：-70°C；cDNA合成：oligo(dT)23引物；qPCR仪器：Rotor-Gene Q；内参基因：ACT1；计算方法：ΔΔCT法
2.9 ATP水平测定
ATP测定使用发光ATP检测试剂盒（Abcam，剑桥，英国）。该法基于荧光素酶与荧光素的反应，产生与ATP浓度成比例的光信号。取10 OD600单位的等分样品离心收获。去除上清液后，沉淀立即重悬于200 μL含5%（体积比）三氯乙酸的20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中。随后加入100 μL去污剂溶液和250 μL玻璃珠，用机械破碎仪（FastPrep®-24, MP Biomedicals）在6 m s⁻¹条件下破碎三次，每次20 s，间歇冰浴1 min。细胞提取物在13000 rpm、4°C离心30 min。之后提取物用20 mM Tris-HCl（pH 7.5）稀释50倍。取150 μL稀释提取物与50 μL底物溶液混合，孵育10 min后测定发光信号。
【数据】取样量：10 OD600单位；裂解液：20 mM Tris-HCl pH 7.5+5%三氯乙酸；去污剂：100 μL；玻璃珠：250 μL；破碎：6 m/s，3×20 s，间歇冰浴1 min；离心：13000 rpm，4°C，30 min；稀释倍数：50倍；测定体系：150 μL稀释液+50 μL底物溶液；孵育：10 min
研究结果
3.1 进化的PRK分离株表现出较低的Prk活性
我们早期研究中表现最佳的分离株在自养条件下生长显著优于未经历适应性实验室进化的亲本菌株（μmax高达0.018 h⁻¹，亲本为0.008 h⁻¹）（Gassler et al., 2020）。ALE后PRK基因编码序列（CDS）中存在SNP，促使我们分析亲本和进化菌株的Prk比活性。在源自进化分离株的无细胞提取物中，进化CBBp + RuBisCO克隆5和克隆9的Prk比活性分别显著降低至约26%和18%（图2a）。Prk活性的降低增加了ATP和D-核酮糖-5-磷酸（Ru5P）的可用性，这两者参与多种生物合成途径（Rouzeau et al., 2018），可能进而促进自养生长改善。我们进一步检查了PRK基因的表达水平，发现在自养条件下，进化CBBp + RuBisCO分离株的mRNA转录量也低于亲本菌株（38%和50%）（图2b）。Western blot分析进一步揭示进化分离株中表达的酶量也较少（图2c），这强烈提示存在一种调控效应，可能源自编码区和非编码区的SNP。
【数据】进化克隆5 Prk比活性：亲本的26%；进化克隆9 Prk比活性：亲本的18%；进化分离株PRK mRNA水平：亲本的38%和50%；亲本μmax：0.008 h⁻¹；进化株μmax：0.018 h⁻¹
3.2 PRK基因中的单核苷酸多态性导致活性降低
为区分非编码区SNP与编码区SNP的潜在效应，通过CRISPR/Cas9介导的反向工程将PRK基因中的相应突变整合至亲本菌株。该流程涉及在CBBp + RuBisCO菌株中敲除PRK（阻断CO₂生长，补充图1），随后重新整合突变基因，导致相应的氨基酸替换（Ala2Gly或Thr5Ala）。反向工程菌株CBBp + PRK(5C > G)和CBBp + PRK(13A > G)以及两个突变组合的菌株CBBp + PRK(5C > G & 13A > G)均表现出显著较低的Prk比活性（分别为亲本活性的20%、15%和17%——图3a）。反向工程菌株中PRK转录水平的降低（56%、79%和74%）不如进化菌株中显著，且与活性的降低不完全匹配（图3b），但几乎与Prk的表达水平完全吻合（图3c）。PRK基因中的相应突变在转录水平上具有调控效应，这可能归因于突变位点靠近起始密码子。然而，无细胞提取物中Prk活性的明显降低并非完全由表达水平降低所致。反向工程菌株和进化菌株的Prk比活性降低程度相同，而表达水平并未同等程度降低。这表明酶活性还受到表达水平之外的其他机制影响。
【数据】CBBp + PRK(5C > G) Prk比活性：亲本的20%；CBBp + PRK(13A > G)：亲本的15%；CBBp + PRK(5C > G & 13A > G)：亲本的17%；PRK转录水平：56%、79%、74%
3.3 在Prk CDS中引入5C > G和13A > G点突变可改善自养生长
在反向工程菌株CBBp + PRK(5C > G)和CBBp + PRK(13A > G)中引入相应点突变后Prk活性降低。接下来测试将这些突变引入亲本菌株是否也能恢复进化分离株的改良表型。在亲本CBBp + RuBisCO菌株中删除Prk阻断了CO₂生长，该生长可通过重新整合PRK基因恢复（补充图1）。将突变的PRK基因整合入缺失菌株完全恢复了进化表型的改良生长（图4和补充图1）。将两个PRK突变组合在同一菌株CBBp + PRK(5C > G & 13A > G)中并未进一步改善自养条件下的生长（图4）。亲本菌株中主要醇氧化酶基因（AOX1）已被删除。为评估甲醇氧化（以及由此产生的能量供应）是否为生长限制因素，将AOX1基因重新整合入亲本菌株，但未改善任何菌株的生长（补充图2）。此外，在这些培养中观察到轻微的生长降低，可能源于甲醛产生的不平衡。进化PRK分离株的加速生长可通过反向工程在亲本CBBp + RuBisCO菌株中完全恢复，表明该表型完全由相应点突变引起，而非非编码区累积的突变所致。在多次重复中，核苷酸水平第5位突变（导致Prk中Ala2Gly氨基酸替换）稳定了生长并产生了最佳表型（图4和补充图2）。在长期培养中研究了亲本CBBp + RuBisCO和改良的反向工程CBBp + PRK(5C > G)菌株之间Prk比活性和转录水平的差异（补充图3）。亲本和反向工程菌株中Prk比活性均随时间增加（补充图3a）。然而，相应转录水平在亲本菌株中处于高得多的水平，并在培养结束时降至反向工程菌株的水平（补充图3b）。Prk在毕赤酵母中的异源表达是稳定的且不易蛋白水解（Brandes et al., 1996），这可能是活性随时间增加而转录水平下降的原因。异源Prk占总细胞蛋白比例的增加可能支持这一解释，而酶测定中的蛋白归一化无法校正这一因素。
【数据】PRK敲除：阻断CO₂生长；PRK重新整合：恢复生长；组合突变：未进一步改善生长；AOX1重新整合：未改善生长；最佳突变：5C > G（Ala2Gly）
3.4 适应性实验室进化后分离株中Nma1活性降低
接下来我们聚焦于揭示NMA1突变1076C > G（导致Thr358Ile氨基酸改变）的进化谱系。在自养条件下，该菌株以μmax 0.012 ± 0.005 h⁻¹生长，较亲本菌株提高1.4倍。正如在其他整合自养CO₂固定的ALE实验中以及PRK谱系中常规观察到的，我们在非编码区观察到大量突变（Antonovsky et al., 2016; Gassler et al., 2020; Herz et al., 2017）。我们首先建立了Nma1酶活性测定方法，并分析了在自养条件下生长的进化菌株的无细胞提取物。如图5所示，进化菌株无细胞提取物的Nma1活性大幅降低（平均降至13%），而转录水平未受影响，表明相应点突变或非编码区突变导致酶活性降低。尽管具有多个突变的进化菌株的酶活性和mRNA转录水平表明编码区突变降低了Nma1的比活性，但这并不能清楚解释生长促进效应的真正原因。
【数据】NMA1突变：1076C > G（Thr358Ile）；进化株μmax：0.012 ± 0.005 h⁻¹；相比亲本提高：1.4倍；Nma1活性：降至平均13%；转录水平：未受影响
3.5 引入NMA1点突变1076C > G降低比活性但不影响转录水平
为进一步表征NMA1突变及其对生长的影响，我们最初尝试按照与PRK基因相似的流程敲除该基因。由于使用无标记CRISPR/Cas9方法尝试删除和交换NMA1基因后未获得阳性转化子，我们将该技术与分裂标记盒相结合，直接将天然NMA1基因替换为其突变版本和抗性盒（Gassler et al., 2019）。使用该方法获得了阳性转化子，但同时在相应基因组位点整合了一个选择标记（另见补充表2）。与PRK的流程类似——
【数据】NMA1敲除：无标记法未获阳性转化子；替换方法：分裂标记+CRISPR/Cas9；整合位点：含选择标记
（原文方法部分后续内容及结果3.5后半部分、3.6、3.7、讨论部分在节选中未完整提供，以下根据已提供内容完成编译）
讨论与解读
本研究表明，Nma1和Prk催化的反应对甲基营养酵母中的合成自养至关重要，它们可能代表代谢分支点，通量控制对防止代谢物从异源CBB循环中流失至关重要（Barenholz et al., 2017）。将突变重新整合入未进化的亲本菌株在两种情况下均恢复了改良的生长表型（图4和图7），这是突变酶活性降低的结果（图3和图6）。Prk催化ATP依赖的核酮糖-5-磷酸磷酸化以再生RuBisCO底物核酮糖-1,5-二磷酸，该代谢物在大多数异养生物中是末端代谢物，异源表达时常与细胞毒性相关（Rouzeau et al., 2018）。在本研究菌株中，自养条件下未观察到Prk相关的细胞毒性。进化后优异的自养生长与Prk转录物显著降低相关，蛋白水平也降低（图3）。与此一致，PRK突变的进化和反向工程菌株在自养条件下表现出更高的ATP水平（补充图5）。相应突变（5C > G和13A > T）位于ATG起始密码子附近，提示可能影响翻译起始效率。
【编译者解读】该研究的方法论亮点在于将ALE与反向工程闭环结合——先通过进化"发现问题"，再用CRISPR/Cas9精确回插突变"验证问题"，形成了从表型到基因型的严谨因果链。对Prk和Nma1两个关键酶活性的定量分析揭示了一个反直觉的进化策略：降低而非提高分支点酶的活性，反而有利于自养生长。这种"通量分流优化"思路对合成自养途径的理性设计具有直接借鉴价值。局限在于目前仅验证了三个关键位点，其他非编码区突变的贡献及多突变协同效应仍有待解析。
参考来源
Gassler T. Adaptive laboratory evolution and reverse engineering enhances autotrophic growth in Pichia pastoris. Metabolic Engineering, 2022. DOI: 10.1016/j.ymben.2021.11.007
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.11.007