毕赤酵母高产PET水解酶实现聚对苯二甲酸乙二醇酯完全降解

来源：Complete decomposition of poly(ethylene terephthalate) by crude PET hydrolytic enzyme produced in Pichia pastoris（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：论文撰写

导读

塑料污染已成为全球性生态难题，酶法降解PET塑料被视为可持续利用的绿色路径，但缺乏经济高效的生产平台始终是瓶颈。本研究利用工业酵母菌株毕赤酵母（Pichia pastoris）表达强效PET水解酶FAST-PETase，通过分子工程去除两个N-连接糖基化位点提升酶活，结合抗生素筛选与分子伴侣共表达，在30-L发酵罐中实现蛋白产量超过3 g/L。更关键的是，未经纯化的粗发酵上清液可直接用于PET降解，在10-L反应体系中，0.5 mg酶/g PET在24小时内即可降解超过95%的消费后PET——这一结果将酶法PET降解从实验室推向了工业化可行性验证。

研究背景

PET是使用最广泛的塑料之一，大量废弃PET对全球生态系统构成沉重负担。开发环境友好的酶介导PET降解与回收技术，是PET可持续利用的重要策略。尽管PET对自然过程高度抵抗，但其化学结构在理论上可被酯酶水解。经过数十年研究，学界公认角质酶类（cutinases）在实际酶介导PET水解中最具应用潜力。2016年，Yoshida等人从PET降解菌Ideonella sakaiensis中鉴定出角质酶样酶IsPETase，其柔性底物结合口袋可容纳PET。然而，IsPETase在升温和长时间反应条件下稳定性差，限制了其应用。为此，研究者通过结构设计、定向进化、计算策略及机器学习算法等手段提升其热稳定性。其中，基于机器学习算法设计突变获得的FAST-PETase在50°C温和条件下展现出最高的PET解聚速率。但酶的高效生产仍是规模化应用的前提，本研究正是瞄准这一关键瓶颈。

研究方法

2.1 质粒构建与突变

FAST-PETase的编码序列经化学合成后克隆至pET32a载体；针对毕赤酵母表达进行密码子优化的基因克隆至pPICZαA质粒。编码分子伴侣的基因——包括蛋白质二硫键异构酶PDI、硫醇氧化酶Ero1、bZIP转录因子HAC1及前蛋白转化酶Kex2——经化学合成后克隆至pGAPZ A载体。其氨基酸序列列于表S1。本研究所用突变体通过基于聚合酶链式反应的定点突变方法生成，所用寡核苷酸引物列于表S2。所有质粒均经直接DNA测序验证。

【数据】载体：pET32a、pPICZαA、pGAPZ A；分子伴侣：PDI、Ero1、HAC1、Kex2；突变方法：PCR定点突变

2.2 大肠杆菌中的重组蛋白表达与纯化

将pET32a/FAST-PETase转化至E. coli BL21(DE3)，在含100 mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基中、37°C、220 rpm振荡培养。当OD600达到约0.6时，加入0.3 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），于16°C诱导表达16小时。细胞经6,000 × g离心10分钟收集，重悬于裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、20 mM咪唑），使用French press破碎。细胞碎片经27,000 × g离心1小时去除，所得上清液上样至Ni-NTA柱，通过快速蛋白液相色谱系统（AKTA purifier FPLC系统，GE Healthcare）以20–250 mM咪唑梯度进行纯化。收集含目标蛋白的组分，在含25 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl及烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEV protease）的缓冲液中透析过夜以去除His标签。透析后的样品再次经Ni-NTA柱纯化，收集含无标签目标蛋白的流穿液，浓缩后储存于−80°C。

【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)；抗生素：100 mg/L氨苄青霉素；诱导剂：0.3 mM IPTG；温度：37°C（培养）/16°C（诱导）；时间：16h；转速：220 rpm；离心：6,000 × g/10 min、27,000 × g/1h；缓冲液：25 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、20 mM咪唑；纯化：Ni-NTA柱、20–250 mM咪唑梯度

2.3 毕赤酵母中的重组蛋白表达与纯化

重组质粒pPICZαA经限制性内切酶PmeI线性化后，电转化至P. pastoris X33感受态细胞。转化子在含zeocin的YPD平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂）上、30°C筛选3天。初始筛选使用250 μg/mL zeocin，随后逐步提高浓度至1,000 μg/mL以筛选高表达克隆。试管测试中，挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C、230 rpm振荡培养。24小时后，更换为2 mL BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾 [pH 6]、1.34%含铵酵母氮源碱、4 × 10⁻⁵%生物素及0.5%甲醇）诱导蛋白表达。培养上清液中蛋白浓度通过Bradford法和SDS-PAGE分析评估。选取蛋白产量最高的菌落，转化经AvrII线性化的、携带不同分子伴侣的pGAPZ A质粒。同样通过试管测试筛选蛋白表达水平更高的菌落。最终，将蛋白表达水平最高的菌株接种于10 mL YPD培养基，30°C、230 rpm培养24小时。培养物转移至含500 mL BMGY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾 [pH 6.0]、1.34%含铵酵母氮源碱、4 × 10⁻⁵%生物素及1%甘油）的2-L摇瓶中，230 rpm继续培养24小时。随后更换为500 mL BMMY培养基，每24小时补加1%甲醇诱导蛋白表达。无细胞上清液经6,000 × g、4°C离心10分钟收集，于4°C在25 mM Tris缓冲液 [pH 7.5]中透析过夜。去糖基化处理时，上清液与Endo H（自制）于4°C孵育过夜。蛋白纯化使用SP琼脂糖柱（GE Healthcare）配合FPLC系统，以0–1 M NaCl梯度洗脱。收集含目标蛋白的组分，浓缩后储存于−80°C。

【数据】菌株：P. pastoris X33；筛选抗生素：zeocin 250→1,000 μg/mL；培养基：YPD、BMMY、BMGY；甲醇浓度：0.5%（试管）/1%（补加）；温度：30°C；转速：230 rpm；时间：24h；离心：6,000 × g/10 min（4°C）；去糖基化：Endo H、4°C过夜；纯化：SP琼脂糖柱、0–1 M NaCl梯度

2.4 PET水解活性测定

PET水解活性参照先前报道方法并略作修改进行测定。一般操作如下：1 mL反应液含10 μg/mL纯化蛋白或发酵上清液、一片Goodfellow PET膜（GfPET，直径6 mm，约8 mg）及50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液 [pH 9]，在指定温度下、800 rpm振荡孵育6小时。pH依赖性测定中，使用含100 mM柠檬酸钠 [pH 4–5]、100 mM磷酸钾 [pH 6–8]或50 mM甘氨酸-NaOH [pH 9–10]的反应体系。反应通过85°C加热10分钟终止，13,000 × g离心后经0.22 μm滤膜过滤。水解产物在配备C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm）的HPLC系统中分析，流速1 mL/min。流动相A为20 mM磷酸盐缓冲液 [pH 2.5]，流动相B为甲醇，以35%–55% B线性梯度洗脱。水解产物TPA和MHET在240 nm波长下监测，根据已知浓度标准曲线计算含量。所有结果中，酶活性以PET水解产生的TPA与MHET之和表示。

【数据】酶量：10 μg/mL；底物：GfPET膜（直径6 mm，约8 mg）；缓冲液：50 mM甘氨酸-NaOH [pH 9]；温度：指定温度；时间：6h；转速：800 rpm；pH范围：4–10；终止条件：85°C/10 min；离心：13,000 × g；色谱柱：C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；检测波长：240 nm

2.5 结晶与结构解析

结晶筛选参照先前报道方法进行。简要而言，1 μL Endo H处理的Pp-FAST-PETase（10 mg/mL）与1 μL储备液混合，于25°C孵育，在含0.1 M氯化钠、0.1 M甲酸钠、0.1 M Bis-Tris丙烷 [pH 8.5]及25%（v/v）PEG Smear Medium的溶液中获得晶体。X射线衍射数据使用Bruker D8 Venture（配CMOS-PHOTON II检测器）在湖北大学收集，由Proteum 3（Bruker AXS GmbH）处理。结构通过分子置换法解析，以先前报道的FAST-PETase结构为搜索模板（PDB ID：7SH6）。后续模型精修使用Coot和Refmac5进行。结构精修前，随机选取5%的反射用于计算Rfree以监控模型质量。

【数据】蛋白浓度：10 mg/mL；结晶条件：0.1 M NaCl、0.1 M甲酸钠、0.1 M Bis-Tris丙烷 [pH 8.5]、25%（v/v）PEG Smear Medium；温度：25°C；搜索模板：PDB ID 7SH6；Rfree计算：5%随机反射

2.6 补料分批高密度发酵

FAST-PETase-212/277-Ero1-9菌株于5 mL YPD培养基中、200 rpm、30°C培养过夜，然后转移至含500 mL BMGY培养基的2-L摇瓶中再培养24小时，之后接种至含10 L培养基的30-L发酵罐（BXBIO，上海，中国）。发酵期间温度维持在30°C。通过自动添加氢氧化铵维持pH约5.5，通过调节搅拌速度（300–500 rpm范围）保持溶解氧在30%以上。甘油完全消耗后，以约40 mL/h的速度逐步补加葡萄糖。当湿细胞重（WCW）达到约220 g/L时，启动甲醇诱导，补加速度以维持甲醇积累在稳定水平。每12小时监测OD600、WCW和总蛋白产量直至发酵结束。发酵结束时，无细胞发酵上清液经6,000 × g离心20分钟收集。蛋白沉淀采用35%（w/v）硫酸铵加入无细胞上清液，室温下280 rpm搅拌30分钟。沉淀经27,000 × g离心10分钟收集，冻干获得干粉。

【数据】发酵罐：30-L（BXBIO）；初始培养基：10 L；温度：30°C；pH：约5.5；溶解氧：>30%；搅拌速度：300–500 rpm；葡萄糖补加速度：约40 mL/h；诱导时机：WCW约220 g/L；发酵时间：212h；硫酸铵浓度：35%（w/v）；搅拌：280 rpm/30 min（室温）；离心：6,000 × g/20 min、27,000 × g/10 min

2.7 PET膜分解与TPA回收

PET水解混合物经0.45 μm滤膜过滤，水解产物经HPLC分析。若反应溶液中含有MHET，则向溶液中加入适量1 M NaOH，室温下200 rpm温和振荡孵育5小时。

【数据】滤膜：0.45 μm；NaOH浓度：1 M；孵育时间：5h；转速：200 rpm；温度：室温

研究结果

3.1 毕赤酵母表达的FAST-PETase性能

构建了携带FAST-PETase编码基因的毕赤酵母菌株，并纯化了重组蛋白。毕赤酵母表达的FAST-PETase（Pp-FAST-PETase）在40°C和50°C下的PET水解活性与大肠杆菌表达的酶（Ec-FAST-PETase）相当，而在60°C下Pp-FAST-PETase的活性高于Ec-FAST-PETase（图1a）。值得注意的是，Pp-FAST-PETase高度糖基化，通过Endo H处理去除N-连接糖基化可显著提高酶在50°C和60°C下的活性（图1a和b）。SDS-PAGE分析表明，Endo H处理完全消除了Pp-FAST-PETase的弥散条带，说明N-连接糖是Pp-FAST-PETase的主要糖基化形式，不应存在O-连接糖基化。

【数据】温度：40°C、50°C、60°C；比较对象：Ec-FAST-PETase vs Pp-FAST-PETase；Endo H处理：显著提高50°C和60°C活性

3.2 通过修饰N-糖基化提升Pp-FAST-PETase性能

与先前发现一致，通过Endo H处理去除Pp-FAST-PETase的N-糖基化可提升PET水解活性。这促使研究者通过分子工程逐一消除Pp-FAST-PETase的每个N-糖基化位点来研究其影响。使用NetNGly-1.0算法分析FAST-PETase成熟蛋白序列，预测出蛋白中有十个 putative N-糖基化位点（图S1）。将这些Asn残基逐一突变为Ala，所有Ala变体的重组蛋白均在毕赤酵母中表达并纯化，用于PET水解活性测定。变体N37A、N114A、N205A和N264A的性能与野生型酶相似，其活性在Endo H处理后均有所提升（图2a）。变体N138A、N173A、N190A和N288A即使在Endo H处理后也表现出较低活性，提示改变这些残基对酶作用产生了负面影响。值得注意的是，变体N212A和N277A的未处理蛋白表现出高于野生型酶的活性（WT，2.8 ± 0.14 mM；N212A，4.57 mM；N277A，3.92 ± 0.08 mM），且其性能仅受去糖基化处理轻微影响（图2a）。研究者进一步将N212A和N277A组合，生成变体N212A/N277A（以下简称212/277），其活性不受Endo H处理影响。与野生型酶类似，变体212/277在50°C和60°C下的活性相当（图S2），表明Pp-FAST-PETase-212/277的热稳定性未受损。

研究者还解析了野生型Pp-FAST-PETase的晶体结构（表S3）。Pp-FAST-PETase的整体结构与Ec-FAST-PETase高度一致，所有对齐的Cɑ原子的均方根偏差低至0.09 Å（图S3）。值得注意的是，Pp-FAST-PETase表面存在多个N-乙酰葡糖胺，它们与Asn残基共价连接，且对Endo H的作用具有抗性（图2b和图S3）。在N114、N138、N190和N277残基处观察到共价连接的糖分子，而在N212残基附近未发现可被糖分子建模的电子密度图（图2b）。然而，SDS-PAGE分析清楚表明N212A的糖基化程度低于野生型酶（图S4），提示N212应为一个N-糖基化位点。由蛋白糖基化导致的弥散条带在变体212/277中较N212A进一步减少，验证了N277连接糖的结构观察结果。从结构上看，N212位于FAST-PETase底物结合隧道附近（图2b），因此N212上的糖基化可能干扰酶与PET的接触。另一方面，N277远离底物结合位点，因此该残基上糖修饰的贡献可能不如N212那样直接，需要进一步研究来阐明。

【数据】预测N-糖基化位点：10个；WT活性：2.8 ± 0.14 mM；N212A活性：4.57 mM；N277A活性：3.92 ± 0.08 mM；RMSD：0.09 Å（Cɑ原子）

3.3 粗Pp-FAST-PETase-212/277的PET分解活性

接下来，研究者着手提升Pp-FAST-PETase-212/277的产量以促进工业应用。如图3a所示，首先使用高浓度抗生素筛选212/277转化子的高表达克隆。选取蛋白表达水平最高的菌落，随后转化一组分子伴侣以促进蛋白表达。最终获得一个共表达Ero1的克隆，在摇瓶试验中分泌0.223 mg/mL蛋白。该菌株（Fast-PETase-212/277-Ero1-9）通过30-L发酵罐补料分批培养，经甲醇诱导212小时，上清液中蛋白产量达到3.23 g/L（图3a和图S5）。值得注意的是，FAST-PETase-212/277-Ero1-9的蛋白产量高于其他已报道的用于生产PET水解酶的表达系统。随后考察了粗发酵上清液的PET水解活性。如图3b所示，粗酶可分解GfPET膜，产生的水解产物略低于纯化蛋白（粗酶，3.8 ± 0.12 mM；未处理纯化酶，4.8 ± 0.06 mM；Endo H处理纯化酶，4.7 ± 0.1 mM）（图3b）。研究者继续按照先前报道的方案考察粗酶对GfPET膜的分解——该方案中反应溶液每天更换。值得注意的是，在该反应条件下，GfPET膜在8天内完全分解，其效率与纯化酶相当（图3c）。

【数据】摇瓶蛋白产量：0.223 mg/mL；发酵罐蛋白产量：3.23 g/L；诱导时间：212h；粗酶活性：3.8 ± 0.12 mM；未处理纯化酶：4.8 ± 0.06 mM；Endo H处理纯化酶：4.7 ± 0.1 mM；完全分解时间：8天

3.4 pH对PET分解效率的影响

上述方案会产生大量水解液，使后续TPA回收过程复杂化。研究者尝试每隔一天更换反应溶液，但实现GfPET完全分解所需时间延长至13天（图S6）。还尝试每天添加酶而不更换反应溶液，但在观察期内PET膜未出现可见变化（图S6）。这些结果引出一个假设：反应体系中的某些组分可能降低分解效率。研究者怀疑PET水解释放的TPA浓度不断升高会使反应溶液酸化，从而影响酶活性，于是开始监测反应pH。采用含更大片GfPET膜的3-mL反应体系以方便pH测量。发现反应混合物的pH值在24小时内从9降至约7，三天内降至<5（图4a）。鉴于Pp-FAST-PETase-212/277在pH 7时仅表现出约30%的最大活性，在pH 5时活性不可检测（图4b），研究者假设随着PET在长时间反应中水解，酶活性可能会降低。因此，每天通过添加适量1 M NaOH溶液将反应pH调回9。结果，第8天实现完全降解，与每天更换反应溶液的分解速率相当（图4c）。最后，使用该反应条件滴定酶用量。如图4d所示，低至2.5 μg/mL的酶即可实现相似的分解结果——GfPET膜在第7天完全降解。为降低酶用量、减少粗酶中杂质的可能干扰并维持分解效率，后续试验选用5 μg/mL酶。

【数据】pH变化：9→约7（24h），→<5（3天）；pH 7活性：约30%最大活性；pH 5活性：不可检测；NaOH浓度：1 M；完全降解时间：8天（每日调pH）；最低酶量：2.5 μg/mL（第7天完全降解）；选定酶量：5 μg/mL

3.5 粗Pp-FAST-PETase-212/277的大规模PET分解

接下来，研究者考察了Pp-FAST-PETase-212/277对消费后PET的分解效率。试验前，发酵上清液经硫酸铵沉淀以方便储存和运输。所得干粉与粗上清液表现出相当的活性和稳定性。

【数据】原文未详述

讨论与解读

本研究通过毕赤酵母实现了PET水解酶的高水平分泌表达，产量达3.23 g/L，远超已报道的其他PET水解酶表达系统。关键突破在于：其一，通过鉴定并去除两个N-糖基化位点（N212和N277），消除了糖基化对酶活性的不利影响——结构解析显示N212靠近底物结合隧道，其糖基化可能直接干扰酶与PET的接触；其二，粗发酵上清液无需纯化即可直接用于PET降解，大幅降低了酶生产成本；其三，发现反应过程中pH下降是限制长时程分解的关键因素，通过每日调节pH至9即可维持高效分解，8天内实现PET膜完全降解。

编译者解读： 该研究提供了一个教科书级的"菌株工程—发酵优化—过程控制"完整链条。从合成生物学角度看，亮点在于将酶分子改造（去糖基化）与宿主工程（分子伴侣共表达）有机结合，而非单点优化。粗酶直接使用的策略极具产业价值——省去纯化步骤意味着成本数量级下降。pH调控的发现也提示，酶法降解的瓶颈往往不在酶本身，而在反应工程。局限在于目前仍以批次补料为主，连续化降解工艺和TPA高效回收尚待开发。整体而言，该工作为PET酶法回收的工业化铺平了道路。

参考来源

Chen, C.-C. Complete decomposition of poly(ethylene terephthalate) by crude PET hydrolytic enzyme produced in Pichia pastoris. Chemical Engineering Journal, 2024. DOI: 10.1016/j.cej.2023.148418

DOI: 10.1016/j.cej.2023.148418