来源：Combined approaches to enhance the Pichia pastoris-expressed PET hydrolase（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料废弃物中聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的酶法降解是极具前景的绿色回收策略。本研究以高效突变体FAST-PETase-N212A为起点，通过引入二硫键提升热稳定性，结合机器学习辅助的序列预测，筛选出七个活性增强的变体。研究还解析了变体与底物类似物MHET的复合物晶体结构，揭示了α3-β5环区T140D突变的关键作用。最终在工业菌株毕赤酵母中实现了变体的高效表达，展现出比大肠杆菌表达系统更高的活性和热稳定性。
研究背景
PET凭借轻质、耐用和化学惰性被广泛应用于商业领域，但其稳定的化学结构使其极难自然降解，废弃物累积已成为全球性环境问题。酶法降解提供了一条环境友好的解决路径——PET水解酶可将PET分解为对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）两种基础单体。目前已鉴定的PET水解酶中，效果最佳者多为角质酶或其同源物，根据底物结合位点、延伸环区和额外二硫键等关键特征可分为I型和II型角质酶。2016年发现的来源于PET降解菌Ideonella sakaiensis 201-F6的IsPETase能在常温下解聚PET，但其低活性和稳定性差限制了进一步应用。已有研究通过理性设计获得ThermoPETase（含S121E、D186H和R280A三个突变），活性提高14倍，Tm值提升8.81°C。本研究在此基础上，以FAST-PETase-N212A为母本，尝试通过引入二硫键和机器学习辅助突变进一步提升其催化性能，并在毕赤酵母中实现高效表达。
研究方法
质粒构建与突变引入
编码FAST-PETase和FAST-PETase-N212A的重组质粒构建方法见前期报道。目标基因克隆至pET32a载体用于大肠杆菌表达，密码子优化后的基因克隆至pPICZαA载体用于毕赤酵母表达。FAST-PETase-N212A的突变体通过基于聚合酶链式反应的定点突变方法产生，并经DNA测序验证。
大肠杆菌中的重组蛋白表达与纯化
将构建好的质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含100 mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）平板上37°C过夜培养。挑取单菌落接种于LB液体培养基，37°C、220 rpm振荡培养，当OD600达到约0.8时，加入0.3 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），16°C诱导蛋白表达18小时。细胞沉淀经5000g离心8分钟收集，重悬于裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、20 mM咪唑，pH 7.5），使用French Press在4°C下破碎细胞。细胞裂解液经17,000g、4°C离心1小时后，含目标蛋白的上清液上样至Ni-NTA柱，使用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统（GE Healthcare）纯化，以20–300 mM咪唑线性梯度洗脱。收集含目标蛋白的组分，对含25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl的缓冲液透析，加入烟草蚀纹病毒蛋白酶去除His标签，随后进行第二次Ni-NTA层析以收集无标签蛋白。纯化后的酶经浓缩后保存于−80°C，用于后续活性测定和结晶实验。
【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)；抗生素：100 mg/L 氨苄青霉素；诱导剂：0.3 mM IPTG；温度：37°C（培养）/16°C（诱导）；时间：18h；转速：220 rpm；离心：5000g×8min、17000g×1h；缓冲液：25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、20 mM咪唑，pH 7.5；洗脱：20–300 mM咪唑线性梯度
毕赤酵母中的重组蛋白表达与纯化
重组表达质粒经PmeI线性化后电转化至毕赤酵母X33感受态细胞，涂布于含100 μg/mL zeocin的YPD平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂），30°C培养48小时筛选转化子。挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C、230 rpm培养24小时。随后离心收集细胞，重悬于BMMY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾（pH 6.0）、1.34%含铵酵母氮碱、4×10⁻⁵%生物素和0.5%甲醇），30°C、230 rpm振荡培养3天。培养上清液中的蛋白表达水平通过SDS-PAGE评估，选择表达量最高的克隆接种至10 mL YPD，30°C培养。24小时后，取1 mL菌液转接至500 mL BMGY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾（pH 6.0）、1.34%含铵酵母氮碱、4×10⁻⁵%生物素和1%甘油）继续培养24小时。随后转至500 mL BMMY培养基进行诱导，每24小时补充1%甲醇。诱导5天后离心收集培养基上清液，使用10-kDa截留分子量的超滤单元（Millipore）浓缩约10倍，然后对含25 mM Tris（pH 7.5）的缓冲液于4°C透析24小时。采用离子交换层析纯化无标签的目标酶——蛋白样品上样至SP Sepharose柱（GE Healthcare），以0至1 M NaCl线性梯度、4 mL min⁻¹流速洗脱。收集含纯目标蛋白的组分，浓缩后保存于−80°C。所有蛋白样品浓度通过Bradford法测定。
【数据】筛选平板：YPD+100 μg/mL zeocin；培养温度：30°C；转速：230 rpm；诱导时间：5天；甲醇补充：1%/24h；浓缩倍数：~10倍；截留分子量：10-kDa；流速：4 mL/min；NaCl梯度：0–1 M
酶活性测定
为评估FAST-PETase及其变体的PET水解活性，采用与前期报道相似的实验装置并略作修改。简要而言，1 mL反应体系包含10 μg/mL纯化酶、一片Goodfellow PET膜（GfPET，直径6 mm，约8 mg）和50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 8.0–10.0）或100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0–8.0），在指定温度下、800 rpm振荡孵育6小时。反应通过100°C加热10分钟终止，经0.22 μm滤膜过滤去除残余底物。使用配备C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）的高效液相色谱（HPLC）分析水解产物。流动相A为20 mM磷酸盐缓冲液（pH 2.5），流动相B为甲醇，色谱柱以35%至55%流动相B的线性梯度、1 mL min⁻¹流速洗脱。流出液在240 nm波长下监测，测定单(2-羟乙基)对苯二甲酸（MHET）和TPA的峰面积，根据已知浓度标准品计算含量。
【数据】酶浓度：10 μg/mL；底物：GfPET膜（直径6mm，~8mg）；缓冲液：50 mM甘氨酸-NaOH（pH 8.0–10.0）或100 mM磷酸钾（pH 7.0–8.0）；时间：6h；转速：800 rpm；终止：100°C×10min；检测波长：240 nm；流速：1 mL/min
结晶与结构解析
结晶筛选实验按照前期报道的方法进行。取1 μL蛋白溶液与1 μL储备液混合，在96孔Crys chem板中与100 μL储备液平衡。衍射质量最佳的晶体生长条件如下：Pp-FAST-ACC为25% PEG1500、0.1 M MMT、pH 9.0；ACC-A47E和ACC-T140E为1.5 M硫酸铵、0.1 M NaCl、0.1 M Bis-Tris、pH 6.5；ACC-A248E为1 M硫酸铵、0.15 M NaCl、0.1 M Bis-Tris、pH 6.5。为获得复合物结构，使用这些蛋白的双突变体S160A/R132G。引入失活突变S160A以防止配体水解，R132替换为Gly以避免底物结合槽中Arg侧链造成的空间位阻。鉴于活性和失活形式的PET水解酶整体结构相同，省略了活性形式酶的结晶筛选。最终成功获得T140E_S160A/R132G（T140E_AG）和T140D_S160A/R132G（T140D_AG）的晶体，优化结晶条件为1.2 M硫酸铵、0.15 M NaCl、0.1 M Bis-Tris（pH 6.5）。与MHET的复合物通过将晶体浸泡在含10 mM化合物的母液中3小时获得。X射线衍射数据收集于国家同步辐射研究中心（NSRRC）TPS-07A光束线和湖北大学Bruker D8 Venture（配备CMOS-PHOTON II检测器）。使用HKL-2000（版本722）软件和Proteum 3（Bruker AXS GmbH）处理衍射数据。结构通过PHASER程序的分子置换法解析，后续模型构建和结构精修使用Refmac5、Coot和PHENIX完成。所有结构图使用PyMOL程序生成。
【数据】蛋白/储备液比例：1 μL:1 μL；复合物浸泡：10 mM化合物×3h；结晶条件：见正文各变体对应条件
机器学习策略
采用前期报道的基于结构的机器学习算法来提升蛋白性能。使用TensorFlow和RDkit重新实现该模型。数据预处理模块中，RDkit用于处理从RCSB蛋白数据银行获取的蛋白结构PDB文件。首先，每个PDB文件仅保留标准氨基酸后加载至RDKit，随后通过RDKit子程序添加缺失氢原子。关注的属性——特定原子（碳、氢、氧、氮和硫）的存在性、部分电荷总和及溶剂可及表面积总和——在以目标残基为中心、边长2纳米的立方体的20×20×20网格中计算。最终获得一个残基在一个结构中的特征矩阵，其维度为……
【数据】网格：20×20×20；立方体边长：2 nm；原子类型：C/H/O/N/S
研究结果
通过引入二硫键提升FAST-PETase-N212A的热稳定性
为进一步提升FAST-PETase-N212A的降解效率，研究旨在通过引入额外二硫键来增加酶的稳定性和工作时长。这通过引入Cys突变实现，策略参考了已在多种角质酶中成功提升热稳定性的方案（图1B）。首先，基准PET水解酶LCC-ICCG含有D238C/S283C突变，该位置通过配位金属离子增强蛋白稳定性，使蛋白Tm值较母本酶提高9.8°C。据此在FAST-PETase-N212A中引入等效二硫键K233C/S282C。此外，PET2的R47C/G89C变体和Z1-PETase的A171C/S193C变体分别使酶Tm值提升3.1°C和4°C。因此，这两个二硫键也分别通过引入R34C/G76C和A171C/S193C突变单独构建。
在毕赤酵母中表达的重组蛋白FAST-PETase-N212A/K233C/S282C（以下称Pp-FAST-ACC）在50、60和70°C下均表现出高于大肠杆菌表达蛋白的活性（图S1A和S1B）。与Pp-FAST-PETase-N212A相比，Pp-FAST-ACC在60°C下活性约高10%（图1C）。在70°C下，无论是否经Endo H处理，Pp-FAST-ACC的活性均比Pp-FAST-PETase-N212A高约十倍，表明蛋白热稳定性得到改善（图1C）。值得注意的是，Pp-FAST-ACC经Endo H处理后活性相当，表明该变体的性能不受N-糖基化影响。含有A171C/S193C和R34C/G76C的变体分别表现为蛋白表达量可忽略不计和未能增强热稳定性，因此未作进一步研究。
【数据】Tm提升：LCC-ICCG +9.8°C，PET2 +3.1°C，Z1-PETase +4°C；Pp-FAST-ACC 60°C活性：较Pp-FAST-PETase-N212A高~10%；70°C活性：高~10倍
机器学习辅助的FAST-ACC工程改造
接下来，采用基于结构的机器学习策略进一步提升FAST-ACC的性能。预测基于Pp-FAST-ACC的结构，序列特征提取作为计算输入信息，预测的变异通过评估PET降解效果进行验证（图S2A）。共选择基于24个残基的119个单点突变进行进一步研究（图2A）。为实现高效的初步筛选，利用大肠杆菌系统进行蛋白表达——其增殖速率快于毕赤酵母。最终通过大肠杆菌表达成功获得86个变体蛋白。这些变体对GfPET膜的PET水解活性在逐步升温条件下测定（图S2B）。其中七个变体显示活性增强，且其预测氨基酸值也是最高的，尽管部分略低于原始氨基酸的预测值（图S2C）。
变体ACC-A47E、ACC-T140E和ACC-T140D在50°C下活性比FAST-ACC高约1.5倍，而变体ACC-A40D、ACC-A41D、ACC-A248E和ACC-A248D的活性提高约20%（图2B）。在60°C下，ACC-T140D活性最高，较FAST-ACC提高约60%，且其预测值在这些变体中最高（图S2C）。值得注意的是，DuraPETase在第140位也含有Asp突变，该突变被认为与S142形成新的氢键。ACC-A40D、ACC-T140E、ACC-A248E和ACC-A248D在60°C下也表现出高于FAST-ACC的活性（图2B）。所有变体在70°C下的降解活性与FAST-ACC相当，但比FAST-PETase高约1.5倍。研究还选取了部分突变进行两两组合，但未观察到进一步改善（图S3）。
随后评估了七个PET水解活性提高的FAST-ACC变体的最佳反应条件。与FAST-PETase和FAST-ACC类似，所有在大肠杆菌系统中表达的变体的最适温度和pH均确定为50°C和pH 9（图S4和图S5）。接着测定了这些变体的熔解温度（Tm）。如前所述，二硫键的引入可增强蛋白热稳定性。研究发现FAST-ACC的Tm值为71.2°C，比FAST-PETase高8.5°C（图2C）。然而，所有FAST-ACC变体的Tm值均未进一步升高（图2C）。这表明除蛋白热稳定性外的其他因素可能导致了高温下的更高活性。
【数据】突变总数：119个单点突变（基于24个残基）；成功表达：86个变体；活性提高变体：7个；50°C活性：ACC-A47E/T140E/T140D约为FAST-ACC的1.5倍，ACC-A40D/A41D/A248E/A248D提高~20%；60°C活性：ACC-T140D提高~60%；70°C活性：所有变体比FAST-PETase高~1.5倍；Tm：FAST-ACC 71.2°C（比FAST-PETase高8.5°C）
FAST-ACC变体的结构研究
在Pp-FAST-ACC的晶体结构中（图3A和表S1），连接C233和C282的二硫键（本文称DS3）的电子密度图清晰可见（图S6A）。Pp-FAST-ACC与Pp-FAST-PETase叠合良好（Cα均方根偏差RMSD为0.09 Å）（图S6A），表明DS3的引入未对整体蛋白折叠造成显著改变。DS3连接β8和β9链，C233和催化三联体组分H237位于同一环上（图3A和图S6A）。与Pp-FAST-PETase一致，在N114、N138、N190和N277处观察到四个Asn连接的糖链。与Pp-FAST-PETase相比，Pp-FAST-ACC中含N-糖基化位点N277的β9-α7环略有偏移，N277连接的糖转向另一方向（图3B）。
为探究有益变体的分子机制，研究还解析了变体ACC-A47E、ACC-T140E和ACC-A248E的晶体结构（表S1）。此外，构建了含失活突变S160A和R132G的T140D-S160A/R132G（T140D_AG）和T140E-S160A/R132G（T140E_AG）双突变体，尝试解析与底物的复合物结构。在FAST-PETase中，T140的侧链与S136的主链形成氢键（图S6B）。在T140D_AG与MHET的复合物结构（T140D_AG/MHET）中，D140与S142的侧链形成氢键，T140E_AG/MHET中观察到相同的氢键相互作用网络（图S6B）。有趣的是，ACC-T140E结构中E140的侧链重新定向，与S136的侧链相互作用（图S6B）。这些结果表明E140可在S136和S142之间摆动，构成局部稳定网络。对于变体ACC-A248E，母本和变体中的局部相互作用网络保持不变（图S6B）。在第47位，Ala和Glu均未发现与邻近氨基酸形成相互作用（图S6B）。
在T140D_AG和T140E_AG与MHET的复合物晶体结构中（表S1和图S7），两个复合物结构高度一致（Cα RMSD值为0.047 Å），并共享相似的MHET结合模式（图3C和D）。工程改造未改变底物结合环境——由W185、M161、W159、H237、D206、I208、T88和Y87组成的MHET结合口袋与IsPETase相比保持不变（图3C、D、E和图S7B）。底物相互作用网络包括MHET的羰基氧与由M161和Y87组成的氧阴离子孔之间的极性相互作用、MHET芳香环上的羟基与H237的相互作用，以及乙二醇的羟基与I208主链的相互作用（图3C和D）。MHET的芳香环被I208、W185和M161夹持。在底物结合中起重要作用的W185在两个复合物中也均采用B型构象，与IsPETase和TfCut-DM中观察到的结果一致（图3H）。值得注意的是，两个复合物中MHET的乙二醇部分从底物结合槽向外伸展（图3C、D和图S7C）。类似的结构特征……
【数据】RMSD：Pp-FAST-ACC vs Pp-FAST-PETase为0.09Å；T140D_AG vs T140E_AG为0.047Å；N-糖基化位点：N114、N138、N190、N277；MHET结合口袋残基：W185、M161、W159、H237、D206、I208、T88、Y87
讨论与解读
本研究通过组合策略显著提升了PET水解酶的性能。在FAST-PETase-N212A基础上引入额外二硫键（K233C/S282C）获得了热稳定性增强的FAST-ACC，其在70°C下的活性比母本高约十倍。机器学习辅助筛选从119个候选突变中鉴定出七个活性增强变体，其中T140D在60°C下活性提高约60%。结构分析揭示了T140D/E通过形成新的氢键网络（与S142或S136相互作用）来稳定局部构象的分子机制。研究还发现α3-β5环区在II型角质酶中比I型更长，该环上的N138糖基化位点在毕赤酵母表达时赋予蛋白更高活性。毕赤酵母表达的变体酶在高温下展现出优于大肠杆菌表达体系的活性和热稳定性，这归因于N-糖基化修饰的贡献。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"理性设计+机器学习+宿主工程"三位一体的酶优化策略。毕赤酵母表达系统的引入是亮点——N-糖基化修饰不仅提升了热稳定性，还避免了额外纯化标签的需求，这对工业化放大极具吸引力。不过，T140D突变提升活性的机制尚未完全阐明，机器学习预测的"黑箱"属性也限制了策略的可迁移性。未来若能结合分子动力学模拟解析糖基化对构象动态的影响，或可进一步释放该酶的工业应用潜力。
参考来源
Li X. Combined approaches to enhance the Pichia pastoris-expressed PET hydrolase. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145862
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145862