来源：Gel microdroplet–based high-throughput screening for directed evolution of xylanase-producing Pichia pastoris（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木聚糖酶在工业领域应用广泛，毕赤酵母已成为大规模生产木聚糖酶的重要宿主平台。然而，实现过表达和高效分泌仍需基因组工程改造。本研究将荧光底物与凝胶微滴技术结合，建立了基于液滴微流体的高通量筛选方法，对分泌木聚糖酶的毕赤酵母进行定向进化。经三轮诱变与筛选，从约10⁸个变体中鉴定出木聚糖酶产量提升1.3倍以上的优良克隆，阳性筛选准确率达98%，通量较机器人辅助微板法提高10³倍以上，试剂消耗降低约10⁶倍。
研究背景
木聚糖酶在食品、饲料、造纸和生物燃料等行业具有广泛的应用价值。毕赤酵母凭借其强大的蛋白分泌能力和翻译后修饰系统，成为大规模生产木聚糖酶最具吸引力的宿主平台之一。尽管如此，要实现木聚糖酶的高效过表达与分泌，仍然依赖基因组工程的系统改造。传统的定向进化筛选策略受限于低通量和繁琐的操作流程，难以满足大规模突变库的筛选需求。液滴微流控技术因其高通量、低试剂消耗和单细胞分辨能力，为酶定向进化提供了新的技术路径。本研究利用凝胶微滴结合荧光底物，开发了一套完整的毕赤酵母木聚糖酶高产菌株筛选流程。
研究方法
菌株与材料
毕赤酵母GS115/XynA-4由本课题组前期构建。酿酒酵母BY4741/POT2-pGPD-sfGFP-tADH1通过化学转染BY4741菌株获得，该菌株在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基中培养并诱导表达超折叠绿色荧光蛋白。环氧树脂SU-8 2015及显影液购自Microchem公司；聚二甲基硅氧烷购自Dow Corning公司；二甲基二氯硅烷购自Macklin公司；青霉源木聚糖酶、木糖、二硝基水杨酸溶液和刚果红购自上海源叶生物科技公司；山毛榉木木聚糖购自北京HarveyBio公司；EnzChek Ultra木聚糖酶检测试剂盒购自Invitrogen公司；琼脂糖购自Sigma–Aldrich公司；2-(全氟己基)乙醇购自Ark Pharm公司；氟化油购自Bio-Rad公司；其他化学试剂除非特别注明，均购自国药集团化学试剂有限公司。
【数据】菌株：P. pastoris GS115/XynA-4、S. cerevisiae BY4741/POT2-pGPD-sfGFP-tADH1；试剂来源：Microchem、Dow Corning、Macklin、Yuanye、HarveyBio、Invitrogen、Sigma–Aldrich、Ark Pharm、Bio-Rad、Sinopharm
微流控芯片制作
采用软光刻法制作微流控芯片。将厚度为14 μm的光敏环氧树脂SU-8 2015薄膜涂布在洁净硅片上，通过铬掩模进行i-line紫外曝光。显影后用二甲基二氯硅烷对模具进行硅烷化处理。将固化剂加入PDMS预聚体中至终浓度9.09%（w/w），脱气至所有微小气泡消失后浇铸于模具上，80°C加热固化。将固化后的PDMS芯片从模具上剥离，用0.5 mm打孔器打孔。芯片与玻璃基片接触面用等离子体清洗机进行空气等离子体处理后键合。
【数据】SU-8厚度：14 μm；曝光波长：365 nm；PDMS固化剂浓度：9.09%（w/w）；固化温度：80°C；打孔直径：0.5 mm
纯化酶液滴内木聚糖酶活性测定
将青霉源木聚糖酶用EnzChek Ultra木聚糖酶检测试剂盒中的反应缓冲液稀释。荧光底物（100 μg/mL）与4%（w/v）琼脂糖溶液按1:1比例混合。在微流控芯片上进行乳化，氟化油、琼脂糖-底物混合液和木聚糖酶溶液的流速均设为1 μL/min。所有注射器由注射泵控制，通过聚四氟乙烯管将溶液引入芯片入口。设定50°C热风枪保持琼脂糖在凝胶微滴生成过程中维持液态。乳液收集于PCR管中20 min，然后在42°C水浴中反应10 min。乳液于4°C硬化成微珠。微珠破乳后悬浮于磷酸盐缓冲液中，经50 μm滤网过滤，用BD FACSAria SORP分析。
【数据】荧光底物浓度：100 μg/mL；琼脂糖浓度：4%（w/v）；流速：1 μL/min；热风温度：50°C；收集时间：20 min；反应温度：42°C；反应时间：10 min；硬化温度：4°C；滤网孔径：50 μm
突变酵母文库构建
所有突变菌株均由毕赤酵母GS115/XynA-4经ARTP诱变产生，使用ARTP诱变育种系统。将毕赤酵母GS115/XynA-4亲本菌株单菌落接种于BMGY培养基中，于30°C、220 rpm摇瓶培养24 h以上。取10 μL细胞悬液均匀涂布于小型圆形无菌金属片上，在输出功率120 W、氦气流量1.667 × 10⁻⁴ m³/s条件下进行ARTP处理180 s，诱导全基因组随机突变。处理后的细胞转移至含1 mL BMGY培养基的Eppendorf管中，30°C、220 rpm过夜培养后进行凝胶微滴包封。
【数据】BMGY培养基成分：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾（pH 6.0）、1.34%酵母氮源碱、4 × 10⁻⁵%生物素、1%甘油；培养条件：30°C、220 rpm、24 h以上；ARTP参数：输出功率120 W、氦气流量1.667 × 10⁻⁴ m³/s、处理时间180 s
高木聚糖酶产量菌株筛选
突变酵母悬液经离心洗涤5次并更换新鲜BMGY培养基，超声处理3次（每次20 s，间隔5 s），然后重悬于含1%（v/v）甲醇的新鲜BMMY培养基中。酵母悬液稀释至10⁶ cells/mL，保持细胞与液滴比例为0.1，转移至注射器中。氟化油及琼脂糖与荧光底物1:1混合物分别吸入注射器并注入微流控芯片。细胞悬液、氟化油和琼脂糖溶液流速均设为1 μL/min。乳液收集于PCR管中30 min，30°C孵育4 h后转移至70°C水浴反应10 min。随后乳液于4°C硬化成微珠。微珠破乳后悬浮于磷酸盐缓冲液中，经50 μm滤网过滤，使用配备AccuDrop技术和Sweet Spot系统的BD FACS Aria SORP进行分选。以亲本菌株为参照进行校准。分选酵母细胞通过涂布于含1%（w/v）木聚糖和1%（w/v）甲醇的木聚糖-BMMY琼脂平板进行回收，30°C培养至菌落形成。
【数据】细胞浓度：10⁶ cells/mL；细胞-液滴比例：0.1；流速：1 μL/min；收集时间：30 min；诱导温度/时间：30°C、4 h；酶反应温度/时间：70°C、10 min；硬化温度：4°C；滤网孔径：50 μm；木聚糖浓度：1%（w/v）；甲醇浓度：1%（v/v）
酵母克隆木聚糖酶活性测定
从每个木聚糖平板中挑取约10个单克隆，以亲本菌株为对照，通过摇瓶发酵分析木聚糖酶活性。种子培养在含5 mL BMGY培养基的50 mL锥形瓶中，30°C、220 rpm培养24 h以上。菌悬液经7809 rpm离心5 min，弃上清，将菌体转移至含25 mL BMMY培养基的250 mL锥形瓶中进行摇瓶发酵，30°C、220 rpm振荡培养。每24 h取样0.5 mL，测定OD₆₀₀，并于4°C、9017 rpm离心10 min收集培养上清。采用二硝基水杨酸还原法测定上清液木聚糖酶活性。每24 h补加甲醇至终浓度1%（v/v），持续4天。将适当稀释的粗酶液加入溶于甘氨酸/NaOH缓冲液（pH 9.0）的1%（w/v）山毛榉木木聚糖溶液中，70°C反应30 min，加入二硝基水杨酸试剂终止反应。所有分析测量至少重复三次。分泌木聚糖酶活性最高的克隆被选作下一轮ARTP诱变、单细胞包封和筛选的起始菌株。
【数据】种子培养：5 mL BMGY、30°C、220 rpm、24 h以上；离心参数：7809 rpm、5 min；发酵培养：25 mL BMMY、30°C、220 rpm；取样：每24 h、0.5 mL；上清收集：9017 rpm、4°C、10 min；底物：1%（w/v）山毛榉木木聚糖、甘氨酸/NaOH缓冲液（pH 9.0）；反应条件：70°C、30 min；甲醇补加：每24 h、1%（v/v）、4天
研究结果
木聚糖酶活性测定
本筛选体系利用EnzChek Ultra木聚糖酶检测试剂盒中的荧光底物6,8-二氟-4-甲基伞形酮基β-D-木二糖苷（DiFMUX2）检测木聚糖酶活性。当木聚糖酶水解DiFMUX2时，荧光团DiFMU从木二糖苷部分释放，荧光强度随之增加。DiFMUX2具有宽泛的工作pH范围（pH 4–10）和优异的温度耐受性，但仍需对其性质进行更具体的了解。为此，在含荧光底物和系列浓度青霉源木聚糖酶的琼脂糖微滴中测试了酶检测体系的动态范围、灵敏度和分辨率。结果发现，液滴的荧光与木聚糖酶活性相关。将微滴中的结果与96孔微板中的结果进行比较，两者高度一致，进一步验证了荧光与酶浓度之间的正相关性。此外，产木聚糖酶的毕赤酵母GS115/XynA-4在96孔微板和液滴中分别诱导不同时间，以确定分选的最佳诱导时间。研究发现液滴的荧光与诱导时间相关，4 h诱导后可分辨出2倍的荧光强度增加。这证实4 h诱导可确保液滴中分泌木聚糖酶的活性处于酶检测动态范围内，且相应的荧光强度变化足以用于后续分选。
【数据】底物：DiFMUX2；pH范围：4–10；诱导时间：4 h；荧光强度分辨率：2倍
木聚糖酶表达模型验证
为验证定向进化工作流程，将包封产木聚糖酶毕赤酵母GS115/XynA-4的微滴与包封不产木聚糖酶的酿酒酵母BY4741及BY4741/POT2-pGPD-sfGFP-tADH1的微滴按不同比例混合。采用0.1的细胞-液滴比例，基于泊松分布实现以单细胞包封为主。各菌株细胞经处理和超声以防止聚集，随后与荧光底物和琼脂糖溶液共同包封于液滴中。乳液在芯片外30°C孵育4 h以诱导木聚糖酶表达，然后70°C反应10 min激活酶水解底物。温度升高对琼脂糖凝胶微滴的形态和荧光强度分布无显著影响。4°C硬化乳液后，三种菌株的微珠按约1:1:1比例混合后进行FACS分选。如图3所示，BY4741/POT2-pGPD-sfGFP-tADH1的绿色荧光用作群体门控对照，门控区域作为阳性样本分选。收集的微珠涂布于SC–Ura琼脂平板，30°C培养48 h。毕赤酵母GS115/XynA-4的存活率估计大于5%。另一方面，阴性菌株BY4741因其营养缺陷型无法在该培养基上存活，而BY4741/POT2-pGPD-sfGFP-tADH1菌株可通过绿色荧光进行区分。结果显示，43个菌落中仅有1个表达sfGFP，阳性筛选准确率达98%。通过将目标菌株比例降至总细胞的0.01%，进一步优化了筛选模型。分选液滴涂布于两块含1%（w/v）木聚糖的BMMY筛选平板，30°C培养48 h。采用木聚糖-刚果红透明圈平板检测法定性验证克隆为木聚糖酶产生菌株。所有菌落周围均出现透明圈，表明木聚糖酶被分泌，从而证实了筛选策略的可行性。
【数据】细胞-液滴比例：0.1；诱导条件：30°C、4 h；酶反应：70°C、10 min；混合比例：约1:1:1；培养条件：30°C、48 h；存活率：>5%；阳性准确率：98%（43个菌落中1个表达sfGFP）；目标菌株比例：0.01%
酵母文库筛选高产木聚糖酶菌株
通过ARTP诱变在毕赤酵母全基因组中随机引入突变，基于凝胶微滴中的相对荧光强度分选木聚糖酶产量提高的细胞。第一轮筛选分选了约10⁷个液滴，包封亲本菌株的液滴荧光强度作为群体门控和回收的对照。验证了分选平板上菌落的木聚糖酶产量（以每毫升木聚糖酶活性单位计）高于原始文库，证明了基于凝胶微滴高通量筛选方法的有效性。每轮诱变后，选择相对上一轮筛选木聚糖酶活性最高的克隆用于下一轮诱变。由于任何诱变策略中目标突变体的产量受突变概率限制，在接下来两轮诱变和筛选中采用富集策略，以确保从文库中获得改良菌株。每轮筛选后，将分选文库孵育并包封进行第二轮分选。后续轮次分选中改良细胞的比例较当前轮次对照组稳定提高，验证了富集策略的有效性。
三轮诱变和筛选后，共筛选约10⁸个变体，挑取60个克隆进行摇瓶发酵木聚糖酶产量分析。成功鉴定出多个产量提高的毕赤酵母菌株，表现最佳的克隆木聚糖酶产量为亲本菌株的1.3倍以上。对最优突变菌株的遗传稳定性进行了测试，经过六代传代后，该菌株仍保持分泌木聚糖酶产量为亲本菌株1.3倍以上。
【数据】第一轮筛选液滴数：约10⁷个；总筛选变体数：约10⁸个；分析克隆数：60个；产量提升：>1.3倍；遗传稳定性：六代后仍保持>1.3倍
讨论与解读
本研究提出的凝胶微滴高通量筛选方法，可在一天内筛选多达10⁸个变体，通量较机器人辅助微板法提高10³倍以上，试剂消耗降低10⁶倍。三轮全基因组诱变与筛选后获得木聚糖酶产量提升1.3倍的毕赤酵母菌株。每轮约10⁷个突变体的生成、诱导和分选仅需8小时，大幅缩短了筛选前的孵育时间，显著加速了定向进化进程。凝胶微滴系统与FACS兼容性优于双乳液微滴法——后者虽可实现流式分选，但受限于通量和复杂的乳液修饰。荧光激活液滴分选虽已成为高通量筛选的有力工具，但系统构建的固有复杂性和缺乏商业化供应限制了其应用。
编译者解读：该研究将琼脂糖凝胶微滴与商品化荧光底物巧妙结合，规避了双乳液体系复杂的表面修饰步骤，使FACS分选可直接应用于凝胶微珠，这是方法学上的一大亮点。1.3倍的产量提升虽不算惊人，但考虑到ARTP全基因组随机诱变的特性，该增幅反映了宿主细胞分泌通路的整体优化潜力。值得注意的是，凝胶微滴对温度变化的耐受性为酶反应条件的独立调控提供了便利，这一设计思路对其它分泌蛋白的定向进化具有直接借鉴价值。未来若能将微滴分选与自动化培养和活性验证平台衔接，有望进一步缩短进化周期。
参考来源
Ma C. Gel microdroplet–based high-throughput screening for directed evolution of xylanase-producing Pichia pastoris. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2019.
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2019.05.008
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2019.05.008