来源：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient production of dihydroartemisinic acid（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
青蒿素是世界卫生组织推荐的一线抗疟药物，但其天然供应受限于植物来源的低含量和环境影响。半合成策略虽为替代方案，但传统路线依赖重金属催化的不对称氢化步骤。本研究通过代谢工程改造酿酒酵母，引入青蒿醛还原酶AaDbr2并采用蛋白融合、辅因子工程、磷酸戊糖途径强化及解偶联生长-生产调控等多重策略，最终在5 L生物反应器中实现二氢青蒿酸效价6.8 g/L，为目前报道的最高水平，为青蒿素工业半合成奠定了微生物平台基础。
研究背景
青蒿素是从药用植物黄花蒿中分离得到的倍半萜内酯类化合物，对耐氯喹和甲氟喹的恶性疟原虫株具有显著杀伤效果，青蒿素联合疗法（ACTs）目前仍是临床一线治疗方案。然而，青蒿素在黄花蒿干叶中仅占0.1%–1%，且植物来源产量受环境波动影响显著。其化学结构含过氧桥和多个手性中心，全化学合成在经济和技术上均面临巨大挑战。合成生物学的进展使微生物生产天然产物成为可能——酿酒酵母和大肠杆菌等工程菌株已被用于生产青蒿素前体青蒿酸（AA）。现有半合成路线通常依赖重金属参与的不对称氢化将AA转化为二氢青蒿酸（DHAA），本研究旨在构建能直接生产DHAA的工程微生物平台，以规避化学氢化的立体化学限制和重金属依赖问题。
研究方法
2.1 通用方法、试剂与设备
引物合成和DNA测序由北京擎科生物技术有限公司完成。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs，KOD One™ PCR Master Mix购自TOYOBO株式会社（日本大阪）。凝胶回收和质粒纯化试剂盒购自Omega Bio-tek。pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit购自TransGen Biotech（北京）。所有试剂均按制造商方案使用。抗生素（氨苄青霉素和卡那霉素）购自Inalco S.p.A.（意大利米兰）。青蒿酸（AA）、二氢青蒿酸（DHAA）和青蒿素（AN）购自Sigma-Aldrich。青蒿醛（ALD）和二氢青蒿醛（DHALD）购自Toronto Research Chemicals。紫穗槐-4,11-二烯（AD）和青蒿醇（AOH）购自MedChemExpress。IPP、DMAPP、GPP、FPP和GGPP参考标准品以及百里酚酞单磷酸二钠盐（内标）购自Sigma-Aldrich。发酵培养基组分购自Thermo Fisher Scientific™ Oxoid。HPLC分析使用Agilent 1260系统，LC-MS（ESI）分析使用Waters LC-MS Micromass ZQ系统，UPLC-MS（ESI）分析使用Agilent 6100 UPLC-MS系统，UPLC-HRMS分析使用Waters Xevo G2-XS QTof质谱仪。核酸和蛋白浓度均使用NanoDrop™ One/OneC分光光度计（Thermo Scientific）测定。
【数据】引物合成：擎科生物；限制酶：NEB；PCR Mix：TOYOBO KOD One™；标准品来源：Sigma-Aldrich等；HPLC：Agilent 1260；LC-MS：Waters Micromass ZQ；UPLC-MS：Agilent 6100；UPLC-HRMS：Waters Xevo G2-XS QTof；核酸/蛋白定量：NanoDrop™ One/OneC
2.2 质粒与菌株构建
所有工程酿酒酵母菌株均来源于菌株ScAA02。质粒和引物汇总于表S1–S3。大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，大肠杆菌BL21(DE3)用于蛋白表达。为增强DHAA生物合成，使用多拷贝质粒骨架pRSII326构建了携带AaDBR2的质粒（pUD和pRF01–09）以及融合构建体AaDBR2-Linker-AaALDH1（pRDL01–04）。线性DNA修复供体（pCDL01–02、pCGO、pCZO、pERG、pCPR02–03）使用pSP72构建。目的基因、启动子、终止子和同源臂通过PCR扩增，表达盒使用无缝克隆技术组装。CRISPR-Cas9介导的基因组整合使用基于pML104的质粒（DiCarlo等，2013）。载体在连接gRNA和擎科生物合成的表达片段之前用BclI和SwaI消化。所有重组质粒在酵母转化前均经测序验证。对于基因组整合，修复供体包含靶位点两侧约500 bp的同源臂。gRNA质粒和修复模板使用LiAc/SS-DNA/PEG方法共转化至酵母中。正确整合子通过菌落PCR验证，随后在5-氟乳清酸平板上培养以消除质粒骨架（Akhmetov等，2018；Tang等，2015）。
【数据】宿主菌：ScAA02；质粒骨架：pRSII326（多拷贝）、pSP72（线性供体）；整合方法：CRISPR-Cas9（pML104载体）；同源臂长度：约500 bp；转化方法：LiAc/SS-DNA/PEG；质粒消除：5-氟乳清酸平板
2.3 培养基与培养条件
所有大肠杆菌菌株在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）中培养，需要时添加100 µg/mL氨苄青霉素或100 µg/mL卡那霉素（Bertani，1951）。酿酒酵母菌株在YPD培养基（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）或合成完全（SC）缺陷培养基中于30°C摇瓶培养，用于初始菌株表征和筛选——因其丰富成分促进快速生长。为实现5 L生物反应器中的精确碳源控制和高密度培养，使用化学成分明确的FerM培养基（2.5%葡萄糖、1.5% (NH4)2SO4、0.8% KH2PO4、0.6% MgSO4·7H2O、12 mL/L维生素溶液、10 mL/L微量元素溶液），于30°C培养。该培养基中葡萄糖作为唯一主要碳源，硫酸铵作为唯一氮源，不含氨基酸或复杂有机补充物。维生素溶液含0.05 g生物素、1 g泛酸钙、1 g烟酸、25 g肌醇、1 g盐酸硫胺素、1 g盐酸吡哆醛、0.2 g对氨基苯甲酸和2 g腺嘌呤硫酸盐，溶于1 L ddH2O。微量元素溶液由5.8 g ZnSO4·7H2O、0.3 g MnCl2·4H2O、0.3 g CuSO4·5H2O、0.5 g CoCl2·6H2O、0.5 g Na2MoO4·2H2O、2.9 g CaCl2·2H2O、2.8 g FeSO4·7H2O和80 mL EDTA溶液（含0.5 mol/L Na2EDTA，pH = 8.0）溶于1 L ddH2O组成。维生素、微量元素和葡萄糖储备液（50%）使用前经滤器灭菌（Ai等，2019；Paddon等，2013；Rose，1987）。必要时，不含ura3的酿酒酵母菌株在补充5 g/L尿嘧啶的SC缺陷培养基上培养。摇瓶发酵时，单菌落在SC-U培养基中于30°C、220 rpm预培养12–16小时，至OD600约5。随后以初始OD600 0.05接种至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，于30°C、200 rpm培养84小时。5 L生物反应器发酵时，200 mL种子培养物以初始OD600 0.05接种至含2 L FerM培养基的5 L生物反应器中。pH用5 M NaOH维持在6.0。通气和温度分别控制在3.0 vvm和30°C。接种后6–8小时观察到葡萄糖耗尽时启动葡萄糖补料，维持残余葡萄糖低于5 g/L，溶解氧（DO）通过恒定通气（3.0 vvm）和级联控制搅拌速度（300–600 rpm）维持在20%–35%之间。当OD600达到80–90时，碳源补料切换为乙醇以避免葡萄糖阻遏和碳源饥饿。为保持乙醇浓度低于5 g/L，乙醇补料速率维持在5–15 mL/h之间，DO通过3.0 vvm恒定通气和300–600 rpm级联控制搅拌维持在20%–50%之间。当OD600降至峰值的50%时终止发酵。发酵过程中持续监测OD600、残余葡萄糖、乙醇浓度和产物效价。
【数据】大肠杆菌培养基：LB（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）；温度：37°C；抗生素：100 µg/mL氨苄青霉素或卡那霉素；酵母培养基：YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）或SC缺陷培养基；温度：30°C；FerM培养基：2.5%葡萄糖、1.5% (NH4)2SO4、0.8% KH2PO4、0.6% MgSO4·7H2O、12 mL/L维生素、10 mL/L微量元素；预培养：SC-U、30°C、220 rpm、12–16 h、OD600约5；摇瓶发酵：50 mL YPD/250 mL瓶、初始OD600 0.05、30°C、200 rpm、84 h；5 L反应器：2 L FerM、初始OD600 0.05、pH 6.0（5 M NaOH）、通气3.0 vvm、30°C；葡萄糖补料：残余<5 g/L、DO 20–35%、搅拌300–600 rpm；乙醇补料：5–15 mL/h、乙醇<5 g/L、DO 20–50%；终止条件：OD600降至峰值50%
2.4 蛋白表达与纯化
为构建蛋白表达质粒，使用特异性引物通过PCR扩增AaDbr2基因。回收的基因片段和载体pET28a或pET22b用NdeI/XhoI消化后连接，转化至大肠杆菌DH5α。所有重组质粒在转入异源菌株大肠杆菌BL21(DE3)前经测序验证。表达菌株在含适当抗生素的2 mL LB培养基中于37°C过夜培养。取5 mL过夜培养物接种至400 mL含相同抗生素的LB培养基中，于37°C、220 rpm振荡培养。当OD600达到0.6时，将培养物冷却至18°C，加入150 μM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）。继续在18°C振荡培养18小时。细胞通过8,000 rpm离心5分钟收集，重悬于20 mL裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，含150 mM NaCl和10%（v/v）甘油）。超声破碎15分钟后，裂解液于4°C、12,000 rpm离心30分钟，上清液通过Ni-IDA（生工生物工程（上海）股份有限公司）亲和树脂柱。柱子用含递增浓度咪唑的缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、10%（v/v）甘油中分别含50 mM、100 mM、150 mM、250 mM和300 mM咪唑）洗涤。洗脱的蛋白级分合并后进行透析以去除咪唑。透析使用3.5 kDa分子量透析膜（北京索莱宝科技有限公司），于4°C针对4 L透析缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10%（v/v）甘油）过夜进行。透析后，蛋白溶液使用超滤装置（Merck Millipore Amicon® Ultra-15）浓缩。
【数据】表达载体：pET28a/pET22b；限制酶：NdeI/XhoI；表达宿主：E. coli BL21(DE3)；诱导：OD600 0.6时加150 μM IPTG、18°C、18 h；裂解：超声15 min；离心：8,000 rpm 5 min（收菌）、12,000 rpm 30 min 4°C（裂解液）；纯化：Ni-IDA亲和柱；咪唑梯度：50/100/150/250/300 mM；透析：3.5 kDa膜、4°C过夜、4 L缓冲液；浓缩：Amicon® Ultra-15
研究结果
3.1 通过引入AaDbr2基因获得DHAA生产菌株
ScAA02是本实验室前期工程化的青蒿酸（AA）生产酿酒酵母菌株（Ai等，2019）。AaDbr2催化青蒿醛（ALD）还原为二氢青蒿醛（DHALD），是将代谢流从AA转向DHAA生物合成的关键酶（Zhang等，2008）。AaDbr2的编码序列经合成后在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。体外实验结果证实AaDbr2有效催化了NADPH依赖的ALD向DHALD的转化（图S1）。为构建DHAA生产菌株，将AaDbr2基因克隆至pESC-ura载体中，受PGal1启动子控制，转化至AA生产菌株ScAA02，获得菌株ScDHU01。由于ScAA02此前经GAL80破坏改造，ScDHU01仅需在葡萄糖耗尽后（初始培养基中约18小时）发酵72小时即可启动半乳糖诱导表达（Ai等，2019）。ScDHU01发酵获得DHAA（66.75 mg/L）和AA（123.5 mg/L），但未检测到紫穗槐-4,11-二烯（AD）、青蒿醇（AOH）标准品或ALD的显著积累（图2A）。然而，该菌株积累了31.8 mg/L的DHALD，表明下游通量转化不完全。尽管引入AaDbr2实现了初步的DHAA生物合成，AA仍是主要产物，DHAA/AA比值仅为0.4。
【数据】菌株：ScDHU01（ScAA02 + PGal1-AaDbr2）；DHAA：66.75 mg/L；AA：123.5 mg/L；DHALD：31.8 mg/L；DHAA/AA比：0.4；诱导时间：葡萄糖耗尽后72 h（约18 h耗尽）
3.2 通过启动子替换增强AaDbr2表达
关键生物合成酶的表达水平是微生物细胞工厂高效生产植物源天然产物的主要限制因素。推测ScDHU01提取物中残留的DHALD是由AaDbr2表达不足所致。为增强DHALD向DHAA的转化并进一步提高DHAA效价，通过启动子替换优化AaDbr2表达。选取了8个来自酿酒酵母的组成型启动子来评估其对DHAA生物合成的影响（Wang等，2023）。启动子-基因构建体PTDH3-AaDbr2-TADH1、PFBA1-AaDbr2-TADH1、PCCW12-AaDbr2-TADH1、PPGK1-AaDbr2-TADH1、PENO2-AaDbr2-TADH1、PTPI1-AaDbr2-TADH1、PTEF1-AaDbr2-TADH1和PTEF2-AaDbr2-TADH1分别克隆至高拷贝数pRSII326质粒中（图2B）。为排除载体骨架的潜在背景效应，同时构建了对照质粒pRSII326-PGal1-AaDbr2-TADH1。重组质粒转化至ScAA02底盘菌株，获得菌株ScDHF01-09及对照ScAA03。工程菌株在YPD培养基中进行摇瓶发酵评估。84小时后发酵提取物的HPLC分析证实启动子强度显著影响DHAA产量（图2C）。所有菌株的生物量积累和葡萄糖消耗呈现相似趋势（见补充材料）。然而，在强启动子（PTDH3、PTEF1和PTEF2）下表达AaDbr2的菌株表现出加速的葡萄糖利用和略微降低的生物量形成（图2D）。产物分析显示强启动子显著提高了DHAA产量。在所测试的构建体中，PTDH3驱动的AaDbr2表达产生了最高的DHAA效价和DHAA/AA比值。DHAA效价提高19.0%，达到79.4 mg/L，DHAA/AA比值提高31.9%（图2C）。尽管有这些改进，ScDHF02发酵液中仍检测到残留的AA和DHALD。DHALD积累增加22.6%至39.0 mg/L（图2C），表明仅增强AaDbr2表达不足以将DHALD完全保留在DHAA生物合成分支中。这些结果表明，使用强启动子驱动AaDbr2表达显著改善了DHAA产量，但仍有约51.8%的代谢流导向AA生物合成。同时，重构菌株中产生的DHAA经确认具有非对映体纯性（图2E）。
【数据】启动子：8个组成型启动子（TDH3、FBA1、CCW12、PGK1、ENO2、TPI1、TEF1、TEF2）；最佳启动子：PTDH3；DHAA效价：79.4 mg/L（提高19.0%）；DHAA/AA比：提高31.9%；DHALD：39.0 mg/L（增加22.6%）；流向AA的代谢流：约51.8%
3.3 通过双蛋白融合将代谢流导向DHAA生产
ScDHF02的主要产物为AA，表明尽管AaALDH1能分别催化ALD和DHALD转化为AA和DHAA，但该酶在生物合成过程中优先利用ALD作为底物。因此，工程菌株中的代谢流主要导向AA而非DHAA生产。相比之下，AaDbr2特异性催化青蒿醛的还原，但不能直接还原青蒿酸，这造成AaDbr2与AaALDH1之间对青蒿醛利用的竞争关系。因此，增强AaALDH1介导转化所需的DHALD供应对于将代谢流重新导向DHAA生物合成至关重要。
蛋白融合技术通过将生物合成途径中功能相关的酶进行空间共定位，可实现代谢流优化和催化效率提升（Cheah等，2023；Chen等，2025；Rabeharindranto等，2019）。前期研究也表明融合策略可改善异源宿主中蛋白结构稳定性并延长酶半衰期。据此，我们假设AaDbr2与AaALDH1之间的空间邻近性可促进DHALD向DHAA生物合成的有效通道化（图3A）。
为评估连接肽特性对融合效率的影响，设计了四种不同结构特征的多肽连接肽将AaDbr2和AaALDH1连接：两种刚性连接肽——螺旋型（EAAAK）2和非螺旋型（PT）4P，以及两种柔性连接肽——（AGGGGTGGA）2和（GGGS）3（图3B）（Cheah等，2023；Chen等，2017；Jin等，2019；Zhou等，2021）。四种由PTDH3启动子驱动的融合构建体克隆至pRSII326质粒并转化至酿酒酵母ScAA02，获得菌株ScDLF01-04。
摇瓶发酵分析显示，与单独表达AaDbr2的菌株ScDHF02相比，表达融合蛋白的菌株保持了相似的DHAA和AA总效价，但DHAA/AA生产比值发生逆转（图3C）。携带柔性（AGGGGTGGA）2连接肽的菌株ScDLF03表现最佳。该菌株的DHAA/AA比值从0.6（ScDHF02）提高至4.2，DHAA效价提高127.7%至180.8 mg/L，而AA和DHALD副产物分别降至43.0 mg/L和17.6 mg/L（图3C）。发酵动力学表明融合表达未显著影响细胞生长（见补充材料），总青蒿素倍半萜产量与对照菌株相当。这些结果表明AaDbr2-AaALDH1融合策略有效将代谢流重新导向DHAA生物合成，且不损害细胞生长或整体倍半萜生产能力。DHALD积累的进一步减少表明DHALD向DHAA的催化通道化效率得到改善。
总体而言，该策略通过将AaDbr2与下游ALDH1融合，成功将代谢流从优先合成AA转向DHAA生产。在所测试的连接肽中，柔性连接肽融合表现出最佳催化性能，将副产物转化为主要生物合成产物DHAA。
【数据】连接肽：刚性（EAAAK）2、（PT）4P；柔性（AGGGGTGGA）2、（GGGS）3；最佳菌株：ScDLF03（柔性连接肽(AGGGGTGGA)2）；DHAA/AA比：0.6→4.2；DHAA效价：180.8 mg/L（提高127.7%）；AA：43.0 mg/L；DHALD：17.6 mg/L
3.4 通过将融合基因整合至基因组使菌株适应高密度发酵
酵母中异源基因表达最便捷的策略是将目的基因置于高拷贝数质粒上并转化至宿主细胞。结合强启动子调控，该方法可在摇瓶系统中实现快速高水平的基因表达以进行功能验证。然而，在连续细胞分裂过程中，基于质粒的表达系统可能……
【数据】原文该节后续内容未在节选范围内完整呈现——整合策略相关具体数据原文未详述
3.5 磷酸戊糖途径工程
【数据】原文该节内容未在节选范围内完整呈现——ZWF1/GND1过表达相关具体数据原文未详述
3.6 解偶联生长-生产调控系统
【数据】原文该节内容未在节选范围内完整呈现——动态调控系统相关具体数据原文未详述
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略在酿酒酵母中实现了二氢青蒿酸的高效直接生产。关键策略包括：对AaDbr2进行启动子优化、通过酶融合重定向代谢流、强化磷酸戊糖途径以增加NADPH供应、构建基于二次生长转变的动态调控系统以解偶联细胞生长与产物生物合成。细胞色素P450电子传递系统的进一步强化显著提高了DHAA效价和DHAA/AA比值。整合上述策略后，最终DHAA效价达到6.8 g/L——为迄今报道的最高水平——DHAA/AA比值为7.2。该工作建立了一个稳健且可扩展的微生物底盘，克服了传统化学氢化相关的立体化学限制和重金属依赖，推进了青蒿素生产的工业可行性。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于用蛋白融合策略巧妙解决了两个竞争酶之间的底物分配问题——将AaDbr2与AaALDH1物理连接后，DHAA/AA比值从0.6跃升至4.2，这种空间通道化思路对其它涉及分支途径的天然产物合成具有普适参考价值。从合成生物学应用角度看，研究从摇瓶到5 L反应器的放大路径清晰，6.8 g/L的效价已具备工业半合成青蒿素的商业化潜力。但需注意，当前发酵采用乙醇补料策略维持高密度，工业放大中的成本控制与工艺稳定性仍有待进一步验证。此外，磷酸戊糖途径强化与P450电子传递优化的具体数据在原文节选部分未完整呈现，读者如需深入了解可查阅全文补充材料。
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134823