来源：Directed evolution of stereoselective enzymes meets click reactions: Asymmetric synthesis of chiral triazoles using a Cu(I)-compatible halohydrin dehalogenase（Green Synthesis and Catalysis）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
手性三唑是药物化学中的重要骨架，但传统合成路线依赖昂贵的手性催化剂。本研究首次将聚焦于增强和反转酶立体选择性的定向进化与Cu(I)介导的点击化学（CuAAC）相结合，以卤醇脱卤酶HheG为进化模板，获得两个立体偏好相反的突变体，分别高效催化环氧化物与NaN₃的叠氮开环反应，生成对映体互补的手性叠氮醇。由于HheG与Cu(I)兼容，研究进一步实现了两步一锅法不对称合成多种手性三唑，并借助量子化学（QM）与分子动力学（MD）计算揭示了立体选择性增强与反转的结构机制。
研究背景
手性三唑类化合物在药物研发中占据重要地位，其不对称合成通常依赖过渡金属催化或酶催化。Cu(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）反应以底物适用范围广、条件温和著称，但产物为外消旋混合物，缺乏立体选择性。卤醇脱卤酶HheG可催化环氧化物与叠氮化钠的立体选择性开环反应，但野生型对底物1a的对映体偏好极弱（ee仅40%），难以满足实际应用需求。本研究旨在通过半理性定向进化策略，增强并反转HheG的立体选择性，同时利用该酶与Cu(I)的兼容性，将酶催化与CuAAC串联，实现手性三唑的一锅不对称合成。
研究方法
4.1 一般信息
使用大肠杆菌BL21（gold）菌株表达HheG。KOD热启动DNA聚合酶购自Toyobo Idears & Chemistry。除非另有说明，所有化学品均购自Bide Pharmtech、leyan、东京化成工业、Macklin Biochemical、Sangon或Aladdin。底物和产物的测定使用Shimadzu Nexis GC-2030气相色谱仪和Shimadzu HPLC-20A高效液相色谱仪完成。Dpn I购自Thermo Fisher。除非另有说明，溶剂和化学品均按原样使用。¹H NMR、¹³C NMR和¹⁹F NMR谱图使用AVANCE Neo 400 MHz Bruker波谱仪和AV2 500 MHz Bruker波谱仪采集。化学位移以ppm为单位报告。产物鉴定采用正离子模式电喷雾电离的LC-MS分析。单晶X射线晶体学分析在Agilent Technologies Inc. Super X-Ray衍射仪上进行。采用pET28a载体进行表达，HheG基因由Azenta Life Sciences合成。以HheG（WT）-pET28a为模板，通过PCR程序构建突变体。引物购自Sangon Biotech Co., Ltd.。反应动力学、转化率和对映选择性的研究使用配备氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪进行。
【数据】菌株：E. coli BL21 (gold)；载体：pET28a；仪器：Shimadzu Nexis GC-2030、Shimadzu HPLC-20A、AVANCE Neo 400 MHz Bruker、AV2 500 MHz Bruker、Agilent Super X-Ray衍射仪；引物来源：Sangon Biotech Co., Ltd.
4.2 文库构建与筛选
所有文库均采用两步PCR程序构建。首先，使用含有NNK密码子的引物（在特定位点）与HheG-F或HheG-R引物扩增巨引物。巨引物通过电泳确认后，用于扩增完整质粒。所得PCR产物转化至表达细胞中，挑取单菌落至含有200 μL Luria肉汤（卡那霉素：50 μg/mL）的96深孔板中。含有所有突变体的细胞在37°C、220 rpm条件下培养至少8小时以获得种子培养物。然后，将50 μL种子培养物转移至每孔含有50 μL 20%甘油的板中制备种子板，储存于−80°C。剩余种子培养物用于蛋白表达：加入900 μL含有卡那霉素（50 μg/mL）和α-d-乳糖（10 g/L）的TB培养基，在18°C、220 rpm振荡条件下培养18–20小时。表达后的细胞通过离心（4000 rpm，5 min）收集，用Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）洗涤两次，并重悬于约150 μL Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）中。反应在30°C、220 rpm条件下进行，加入20 mmol/L底物1a和100 mmol/L NaN₃。产物用300 μL乙酸乙酯萃取，突变体的对映选择性使用手性气相色谱测定，方法如下：色谱柱：LIPOEDX®E（25 m × 0.25 mm内径）；进样量：2 μL；流速：1 mL/min；进样器温度：200°C；检测器温度：220°C；升温程序：80°C保持5 min；然后以10°C/min升至110°C保持5 min，再以2°C/min升至180°C保持5 min。氢气用作色谱过程的载气。
【数据】培养基：LB（卡那霉素50 μg/mL）、TB（卡那霉素50 μg/mL + α-d-乳糖10 g/L）；培养温度：37°C（种子）、18°C（表达）；培养时间：8 h（种子）、18–20 h（表达）；转速：220 rpm；离心：4000 rpm、5 min；缓冲液：Tris-H₂SO₄ 100 mmol/L、pH 7.8；底物浓度：20 mmol/L 1a；NaN₃浓度：100 mmol/L；反应温度：30°C；萃取剂：乙酸乙酯300 μL；GC条件：LIPOEDX®E柱、进样2 μL、流速1 mL/min、进样器200°C、检测器220°C、程序升温80°C→110°C→180°C；载气：氢气
4.3 蛋白表达与纯化
挑取单菌落转移至添加卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中。培养物在37°C、220 rpm下过夜培养以获得种子培养物。对于表达，将5 mL种子培养物转移至500 mL添加卡那霉素（50 μg/mL）的TB培养基中。培养物在37°C、220 rpm下培养3–4小时，直至600 nm处光密度（OD600）达到0.6–0.8。此时加入诱导剂α-d-乳糖（终浓度10 mg/mL），培养物在18°C、220 rpm下继续培养18–20小时。表达完成后，培养物在8000 rpm下离心2分钟。沉淀重悬于pH 7.8的Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L）中，该步骤重复两次。最后加入3 mL Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）重悬细菌细胞。细胞储存于−80°C直至纯化。
【数据】培养基：LB（卡那霉素50 μg/mL）、TB（卡那霉素50 μg/mL）；诱导剂：α-d-乳糖（终浓度10 mg/mL）；诱导前培养：37°C、220 rpm、3–4 h、OD600 0.6–0.8；诱导培养：18°C、220 rpm、18–20 h；离心：8000 rpm、2 min；缓冲液：Tris-H₂SO₄ 100 mmol/L、pH 7.8；重悬体积：3 mL
4.4 蛋白纯化
细胞在冰水浴中解冻，然后进行超声破碎。超声后，裂解液在12,000 rpm、4°C条件下离心以进行后续处理。离心后获得的上清液通过膜过滤器过滤。过滤后的上清液上样至Ni柱进行进一步纯化。柱子首先用含有20 mmol/L咪唑和10%甘油的Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）洗涤。随后，使用含有500 mmol/L咪唑和10%甘油的Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）洗涤并洗脱目标蛋白。目标蛋白使用30,000 Da分子量超滤管浓缩。浓缩后的蛋白溶液在4000 rpm、4°C条件下离心10 min。重复该操作直至体积减少至500 μL以下。随后，使用PD-10柱对蛋白进行脱盐。纯化蛋白的浓度通过使用微量分光光度计（AllSeng Nano 300）测量其在280 nm处的吸光度来评估，并制备等分试样（每管50 μL）进行储存。等分试样在液氮中快速冷冻并储存于−80°C。
【数据】离心：12,000 rpm、4°C；Ni柱洗涤：20 mmol/L咪唑 + 10%甘油 + Tris-H₂SO₄ 100 mmol/L（pH 7.8）；洗脱：500 mmol/L咪唑 + 10%甘油 + Tris-H₂SO₄ 100 mmol/L（pH 7.8）；超滤管截留分子量：30,000 Da；浓缩离心：4000 rpm、4°C、10 min；终体积：<500 μL；脱盐：PD-10柱；检测波长：280 nm；分装：50 μL/管；储存：液氮速冻、−80°C
4.5 动力学测定
使用纯化的野生型、GZ-2和GZ-1酶测定反应动力学。反应体系由Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）组成，总体积500 μL，酶浓度为2 μmol/L。底物环己烯氧化物1a在以下不同浓度下测试：1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L和100 mmol/L。反应在30°C、1200 rpm条件下进行10 min。反应后，加入3 × 500 μL乙酸乙酯进行萃取。合并有机相，除去溶剂后加入500 μL丙酮。然后按照先前报道的方法⁶，依次加入1 mol/L抗坏血酸溶液、0.1 mol/L五水硫酸铜溶液和苯乙炔，并将体积调整至1 mL。反应进行12小时，除去溶剂丙酮并用乙酸乙酯萃取三次，进行HPLC测定。
TON（转换数）测定使用纯化的野生型HheG、突变酶Y18G-M198L-F200W和T195G-T154Y–N196A-M14L-S207F–I104V进行。反应体系由Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）组成，总体积500 μL，酶浓度为2 μM。底物环己烯氧化物1a在以下不同浓度下测试：1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L和100 mmol/L。如文献[6]所述，按比例加入1 mol/L抗坏血酸溶液、1 mol/L NaN₃、0.1 mol/L五水硫酸铜溶液和苯乙炔。反应在30°C、1200 rpm条件下进行，继续反应16小时。产物量通过HPLC测定。
【数据】缓冲液：Tris-H₂SO₄ 100 mmol/L、pH 7.8；总体积：500 μL；酶浓度：2 μmol/L（动力学）、2 μM（TON）；底物浓度梯度：1–100 mmol/L（12个浓度点）；反应条件：30°C、1200 rpm、10 min（动力学）、16 h（TON）；萃取：3 × 500 μL乙酸乙酯；衍生化试剂：1 mol/L抗坏血酸、0.1 mol/L CuSO₄·5H₂O、苯乙炔；衍生化时间：12 h；测定方法：HPLC
4.6 手性三唑的一锅法合成
在2 mL离心管中，将HheG突变体全细胞（OD600 = 80）、20 mmol/L环己烯氧化物1a或环庚烯氧化物1b、20 mmol/L NaN₃、0.3当量新鲜制备的1 mol/L抗坏血酸钠溶液、0.1当量新鲜制备的0.1 mol/L硫酸铜溶液以及20 mmol/L炔烃化合物加入Tris-H₂SO₄缓冲液（100 mmol/L，pH = 7.8）中，总体积500 μL。反应在30°C、1200 rpm振荡条件下进行16小时。反应终止后……
【数据】全细胞浓度：OD600 = 80；底物：20 mmol/L 1a或1b；NaN₃：20 mmol/L；抗坏血酸钠：0.3当量（1 mol/L新鲜配制）；CuSO₄：0.1当量（0.1 mol/L新鲜配制）；炔烃：20 mmol/L；缓冲液：Tris-H₂SO₄ 100 mmol/L、pH 7.8；总体积：500 μL；反应条件：30°C、1200 rpm、16 h
研究结果
定向进化
选择廉价易得的环己烯氧化物（1a）作为模型底物。由于野生型HheG催化1a的叠氮解反应时仅对(1S, 2S)-2a有微弱偏好（ee = 40%）[30,31]，因此采用半理性定向进化[4,33]来改善和反转对映选择性。基于WT HheG的晶体结构[30,31]，将1a直接对接至其活性口袋中（详见支持信息图S2）。选择结合口袋5 Å范围内底物1a周围的共13个残基（Y18、I104、T151、A153、T154、G194、T195、N196、Y197、M198、F200、F203、M231）进行基于NNK的饱和突变，该策略利用全部20种天然氨基酸作为构件[33–35]。使用96深孔板中的全细胞催化，通过手性气相色谱筛选活性和对映选择性。发现突变体Y18G、Y18A、Y18W、I104M、T154A、T154S、N196Q、Y197N、Y197R、Y197H、M198Q、M198G、M198L和F200W显示出显著改善的对映选择性，而T195突变体（T195P、T195G、T195A、T195S）显示出反转的对映选择性（详见支持信息图S3）。由于Y18G优先形成(1S, 2S)-2a（ee = 78%），而T195G表现出最好的相反选择性，偏好(1R, 2R)-2a（ee = 65%），因此它们被选为迭代饱和突变（ISM）[34,35]的模板，在单独实验中聚焦于上述其余12个残基。构建并筛选了24个基于NNK的文库，发现了双突变体GL（Y18G/M198L）和GY（T195G/T154Y），分别对(1S, 2S)-2a和(1R, 2R)-2a具有改善的对映选择性（ee值：90%和76%）。为了进一步提高对映选择性，以GL和GY为模板，结合突变位点5 Å范围内的11个残基进行了又一轮ISM。获得了更好的变体GLW（Y18G/M198L/F200W），用于生成(1S, 2S)-2a，以及GYA（T195G/T154Y/N196A），用于生成(1R, 2R)-2a，ee值分别提高至94%和87.5%。为了获得更完美的突变体，我们基于GLW和GYA进行了第四轮ISM，结合了5 Å范围内的其余10个残基。获得了突变体GYAV（T195G/T154Y/N196A/I104V），其对(1R, 2R)-2a的ee值略有提高（89%），但此时未能进化出更好的(1S, 2S)-2a选择性突变体。虽然关于HheG对1a对映选择性的可用信息有限[30,31,36,37]，我们基于GLW和GYAV将ISM范围扩展至1a周围7 Å（表S2）。进化出突变体GYAVL（T195G/T154Y/N196A/I104V/M14L），其对(1R, 2R)-2a的ee值略有提高（90%）。随后，基于GLW和GYAVL将ISM范围扩展至1a周围9 Å。最终，获得了六重突变体GYALFV（T195G/T154Y/N196A/M14L/S207F/I104V），命名为GZ-1，其对(1R, 2R)-2a的ee值提高至92%；但对于(1S, 2S)-2a选择性突变体，额外突变未能对变体GLW产生进一步改善；该突变体被命名为GZ-2，作为生产(1S, 2S)-2a的最终突变体（图1）。
【数据】模型底物：环己烯氧化物1a；WT ee值：40%（(1S, 2S)-2a）；突变残基：13个（5 Å范围）；筛选突变体：Y18G、Y18A、Y18W、I104M、T154A、T154S、N196Q、Y197N、Y197R、Y197H、M198Q、M198G、M198L、F200W（选择性增强）；T195P、T195G、T195A、T195S（选择性反转）；Y18G ee = 78%（(1S, 2S)）；T195G ee = 65%（(1R, 2R)）；GL ee = 90%；GY ee = 76%；GLW ee = 94%；GYA ee = 87.5%；GYAV ee = 89%；GYAVL ee = 90%；GZ-1（GYALFV）ee = 92%；GZ-2（GLW）为(1S, 2S)最终突变体
机制研究
由于部分突变位点远离活性口袋，我们推测对映选择性控制的机制可能不同于经典卤醇脱卤酶[38–41]——后者与有机底物的常规结合有关。为了揭示突变体性质改变的来源，首先对变体WT、GZ-1和GZ-2针对1a进行了动力学分析（详见支持信息图S5–S7）。如表1所示，两个突变体的Km值相对于WT相似，表明1a的结合紧密程度相同。kcat值显著增加，突变体GZ-1和GZ-2分别显示出2.6倍和2.1倍的增强。两种突变体在底物转化方面均更高效。由于转换数（TON）对于衡量催化剂的实际价值很重要，我们还测试了两个最佳HheG变体的TON。两种突变体都催化了非常高的转化率，并且相对于WT均显示出增强的催化能力（表1）。到目前为止，催化变化（对映选择性和活性）发生的分子机制仍不清楚。因此，我们重新审视了其晶体结构，试图阐明功能与结构之间的关系。根据先前的工作[30,31,36,37,42]，我们可以将活性口袋分为两部分：一部分包含由S152、Y165和R169组成的催化三联体，负责结合底物1a；另一部分是卤化物结合位点（HBS），负责在邻位卤醇脱卤反应中结合卤化物，并在环氧化物开环反应中接受亲核试剂。HBS由β6和α6之间的环构成，位于T195和P201之间。对GZ-1和GZ-2突变体所涉及残基的分析表明，有效突变位点大多靠近或完全位于HBS区域。因此，我们推测HBS对于稳定脱卤和开环反应中的过渡态以及介导亲核试剂攻击方向（促进底物转化）至关重要。
为了理解突变体的立体选择性，进行了计算模拟。原则上，在1a的开环反应中，由于产物中存在两个手性中心，可以生成四种手性化合物，构型分别为(1R, 2R)、(1S, 2S)、(1S, 2R)和(1R, 2S)。我们的分析表明，亲核攻击在热力学上排除了不稳定非对映异构构型(1R, 2S)和(1S, 2R)的形成[42–45]。因此，对主要构象之间自由能差的量子化学（QM）计算支持排除这两种高能非对映异构体（详见支持信息图S10）。随后，采用分子动力学（MD）模拟研究两种突变体的对映选择性机制。将环己烯氧化物（1a）对接至活性口袋中，发现其与S152和T165形成了稳定的氢键。将叠氮离子对接至HBS附近进行MD模拟，以确定叠氮离子在蛋白口袋中的统计分布（详见支持信息图2）。通过底物轨迹的均方根偏差分析确认分子动力学平衡后，对1000个提取的模拟帧中对接叠氮离子的方位角取向进行检验，显示出单峰分布，主要集中在他唑结合位点环的一侧。这一观察结果表明叠氮只能从一侧攻击，始终定位于HBS所在的环区域。由于1a的结构是对称的，开环产物的构型由被攻击的碳原子位置决定。如图2c所示，攻击C6形成(1S, 2S)构型的产物，而攻击C1则生成(1R, 2R)构型的产物。根据这一假设，计算了叠氮中带负电的N离子与C1和C6之间的距离分布，以确定突变体的立体选择性。结果以小提琴图和散点分布表示（图3）。
对于WT，我们发现(1S, 2S)构型的分布约为(1R, 2R)构型的两倍（在4 Å范围内），这表明WT偏好产物(1S, 2S)-2a（(1S, 2S/1R, 2R = 48/35）。分析两种突变体的计算结果后发现，变体GZ-1偏好(1R, 2R)构型（(1S, 2S/1R, 2R = 2/74），而GZ-2主要偏好……
【数据】Km值：突变体与WT相似；kcat增强：GZ-1为2.6倍、GZ-2为2.1倍；WT距离分布：(1S, 2S)约为(1R, 2R)的2倍（4 Å内）；WT产物比：(1S, 2S/1R, 2R = 48/35；GZ-1产物比：(1S, 2S/1R, 2R = 2/74；QM计算：排除(1R, 2S)和(1S, 2R)构型；MD模拟：1000帧、单峰分布、叠氮定位于HBS环一侧
制备规模合成
【数据】制备规模产物：(1R, 2R)-4a、(1R, 2R)-5a、(1R, 2R)-5n、(1S, 2S)-4a、(1S, 2S)-5a、(1S, 2S)-5n；一锅法转化率：见图7（conv值）
讨论与解读
本研究首次将控制立体选择性的定向进化与Cu(I)介导的点击化学（CuAAC）相结合。这一贡献提升了两个研究领域的重要性。首先，通过定向进化获得了卤醇脱卤酶HheG的两个突变体，在环己烯氧化物和环庚烯氧化物的叠氮解反应中表现出高对映选择性和活性。据我们所知，此前仅有关于该酶蛋白质工程改造的报道两篇[36,46]，但改善的对映选择性仍然有限（<70%），且未创建出对映选择性反转的突变体。此外，关于该酶的立体选择性机制及相关热点残基的研究相当有限。在进化结果之外，我们进行了MD和QM模拟以阐明所需的增强和反转立体选择性，这些数据将有助于设计进一步的酶工程改造。随后，构建了一个独特的互利实验系统，将HheG突变体的高立体选择性与CuAAC的广泛底物范围相结合。该系统能够高效一锅不对称合成多种三唑化合物。关于未来工作，这一概念为获取广泛的药物重要产物和其他高价值化合物打开了大门。
编译者解读
本研究的技术亮点在于"酶进化+点击化学"的模块化组合策略——用定向进化解决酶立体选择性问题，再用Cu(I)兼容性实现一锅串联，避免了中间产物分离纯化步骤。从合成生物学应用角度看，这种"改造天然酶以适应化学合成需求"的思路具有较高推广价值，特别是HBS区域突变热点对立体选择性的调控机制为后续酶设计提供了明确靶点。值得留意的是，尽管GZ-1和GZ-2分别实现了92%和94%的ee值，但(1S, 2S)选择性突变体在第四轮ISM后未能进一步提升，反映出该方向可能存在进化瓶颈。此外，文中对Cu(I)与酶的兼容性机制未作深入探讨，这或许是一锅体系进一步优化时值得关注的问题。
参考来源
Tian S, et al. Directed evolution of stereoselective enzymes meets click reactions: Asymmetric synthesis of chiral triazoles using a Cu(I)-compatible halohydrin dehalogenase. Green Synthesis and Catalysis, 2026. DOI: 10.1016/j.gresc.2024.01.001
DOI: 10.1016/j.gresc.2024.01.001