来源：Automated strain-to-peptide conversion: a high-throughput proteome analysis platform empowering rational design of microbial cell factories（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
合成生物学改造微生物细胞工厂时，快速产生的大量突变株给蛋白质组学分析带来严重瓶颈——传统手动样品前处理耗时数小时且重复性差。本文报道了一种名为“菌株-肽段转换”（SPC）的全自动化策略，利用商业化液体处理系统在1小时内完成96个样品的裂解、蛋白富集、去污和酶解全过程，相比经典SP3方法节省94%处理时间，同时蛋白鉴定深度相当、膜蛋白定量提升28%。研究将该平台应用于96株TCA循环工程大肠杆菌的蛋白质组分析，揭示了代谢通路改造引发的系统性蛋白重塑。
研究背景
合成生物学已深刻影响医药、化工、能源和农业等多个领域。为提升微生物细胞工厂的生物合成性能，研究人员常需进行酶改造和细胞代谢网络重连。然而，蛋白表达调控的内在不可预测性及其对宿主的复杂影响，使得仅靠代谢通路修饰难以稳定达到预期效果。基于质谱的蛋白质组学是阐明蛋白表达动态、指导代谢通路优化的关键工具。但基因编辑技术的飞速发展和“设计-构建-测试-学习”循环的普及，使研究人员能在短时间内产生数千株突变体，对大规模样本进行蛋白质组表征以获得统计学上可靠的生物学洞察，已成为亟待解决的需求。现有自动化系统在细胞裂解和高效蛋白提取等关键环节仍存在根本性局限，往往需要额外仪器和人工样品转移，影响通量并带来样品损失风险。
研究方法
4.1 菌株与培养条件
用于方法建立和评估的大肠杆菌K-12（ATCC 29425）和谷氨酸棒杆菌（ATCC 13032）分别在LB和TSB培养基中培养。预培养在含2 mL培养基的15 mL试管中进行，大肠杆菌于37°C、谷氨酸棒杆菌于30°C、220 rpm振荡培养。随后将预培养细胞接种至250 mL摇瓶中，在相同条件下过夜培养。细胞通过1,200 × g离心5 min收获，用预冷PBS洗涤三次。细胞沉淀保存于−80°C备用。
用于生物学应用的ASKA大肠杆菌开放阅读框（ORF）文库菌株（Takara，日本）在深孔板中制备。预培养在24深孔板中过夜培养，工作体积为2.5 mL新鲜LB培养基，37°C、200 rpm。实验培养时，重悬细胞以0.1起始OD600接种至MicroScreen HT 48孔平底板中，总培养体积1 mL LB培养基，用0.2 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。同时，重悬细胞以相同条件接种至另一MicroScreen HT 48孔平底板作为对照组。微板实验在MicroScreen HT微型生物反应器（Gering，中国）上于30°C、800 rpm运行。每30 min检测OD600nm绘制生长曲线，直至大肠杆菌细胞达到稳定期。处于对数生长中后期的细胞用预冷PBS缓冲液洗涤三次后收获，沉淀保存于−80°C备用。
HEK-293T细胞在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2加湿气氛中维持培养。贴壁细胞层在后续处理前用PBS洗涤。
【数据】菌株：E. coli K-12 (ATCC 29425)、C. glutamicum (ATCC 13032)、ASKA E. coli ORF文库；培养基：LB/TSB/DMEM；温度：37°C（E. coli）/30°C（C. glutamicum）；转速：220 rpm/200 rpm/800 rpm；离心：1,200 × g，5 min；IPTG浓度：0.2 mM；起始OD600：0.1；培养体积：1 mL；HEK-293T条件：37°C、5% CO2
4.2 SPC策略的开发
本节评估了裂解条件、mSPA反应时间和消化条件，具体见补充材料。
【数据】原文未详述
4.3 手动SPC样品制备
将约2.5 × 10^8个大肠杆菌K-12细胞（50 μL PBS缓冲液）与150 μL含8 M GdnHCl、1%（v/v）蛋白酶抑制剂混合物、10 mM TCEP和20 mM Tris的50 mM NH4HCO3缓冲液混合，在热振荡器上95°C处理5 min。蛋白提取、变性和还原在单一步骤中完成。随后向溶液中加入50 mM NH4HCO3缓冲液中的mSPA颗粒（1 mg，25 μL）以捕获蛋白，在热振荡器上40°C孵育15 min。后续清洗过程遵循4.2节详述的方案。随后加入含Trypsin和Lys-C混合溶液（1:1，w/w）的50 mM NH4HCO3缓冲液（110 μL），按酶与蛋白比1:50（w/w）进行消化，在热振荡器上50°C孵育5 min。磁分离2 min后，将上清转移至新管中回收肽段。最后，管中上清进行真空干燥，−80°C冷冻备用。在通用性评估中，以谷氨酸棒杆菌为模型样品，所有后续步骤与前述方案完全相同。
【数据】细胞量：~2.5 × 10^8 cells；裂解液：8 M GdnHCl + 1%蛋白酶抑制剂 + 10 mM TCEP + 20 mM Tris（50 mM NH4HCO3）；裂解条件：95°C，5 min；mSPA用量：1 mg（25 μL）；mSPA孵育：40°C，15 min；酶与蛋白比：1:50（w/w）；消化条件：50°C，5 min；磁分离：2 min
4.4 SP3样品处理
手动SP3样品制备参照先前描述的方法进行适当修改。简言之，将大肠杆菌K-12细胞沉淀（约5 × 10^9个细胞）与裂解缓冲液和0.4–0.6 mm玻璃珠（约200 mg）混合，使用高速低温研磨机（Servicebio，中国）以4.5 m/s研磨10个循环，每循环40 s，间隔60 s。裂解缓冲液由1%（w/v）SDS和1%（v/v）蛋白酶抑制剂混合物组成，溶于50 mM HEPES缓冲液（pH 8.5）。蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒测定。大肠杆菌裂解物用含10 mM TCEP的1% SDS在95°C变性还原10 min，然后在室温避光条件下用20 mM碘乙酰胺（IAA）烷基化30 min。Sera-Mag Speed Beads A和B混合后悬浮于Milli-Q水中。向25 μL细胞裂解液中加入磁珠（25 μL，40 mg/mL）和50 μL 100%乙腈（ACN），使ACN终浓度达到50%。蛋白与磁珠在室温结合18 min，然后在磁力架上孵育2 min固定磁珠。去除上清后，磁珠分别用80%乙醇洗涤三次、100% ACN洗涤一次。最后，加入含Trypsin的50 mM NH4HCO3缓冲液混合溶液，酶与蛋白比为1:30（w/w），在热振荡器上37°C孵育16 h。磁珠在磁力架上固定，将上清转移至新管回收肽段，残余磁珠用50 mM NH4HCO3（50 μL）冲洗两次。合并上清进行真空干燥，−80°C保存备用。
在SPC替代实验中，大肠杆菌K-12裂解物按4.3节制备，随后在室温避光条件下用20 mM IAA烷基化30 min。向裂解物中加入SP3磁珠（10 μL，100 mg/mL）和190 μL 100% ACN。低盐浓度样品通过将6 M GdnHCl稀释至1 M制备，然后按1:1（v/v）加入ACN使终浓度达到50%。蛋白与磁珠在室温结合18 min，随后在磁力架上孵育2 min固定磁珠。后续清洗和消化过程见本节前述描述。
【数据】SP3细胞量：~5 × 10^9 cells；玻璃珠：0.4–0.6 mm，~200 mg；研磨：4.5 m/s，10循环×40 s，间隔60 s；裂解缓冲液：1% SDS + 1%蛋白酶抑制剂（50 mM HEPES，pH 8.5）；还原：10 mM TCEP，95°C，10 min；烷基化：20 mM IAA，室温，30 min（避光）；磁珠：25 μL（40 mg/mL）；ACN终浓度：50%；结合时间：18 min；酶与蛋白比：1:30（w/w）；消化：37°C，16 h；SPC替代实验：20 mM IAA，室温，30 min；磁珠：10 μL（100 mg/mL）+ 190 μL ACN；GdnHCl稀释至1 M；ACN终浓度：50%；结合时间：18 min
4.5 autoSPC样品制备
本研究使用的RayKol液体处理平台被编程为同时处理96个样品，包括菌株裂解、蛋白还原和烷基化、蛋白富集、脱盐和消化。约2.5 × 10^8个大肠杆菌菌株在自动化处理开始前手动分装至含PBS缓冲液的96深孔板中。autoSPC工作流程如下：实验步骤、试剂和组成比例遵循4.3节详述的方案。肽段通过将上清转移至新的96深孔板中回收。最后，上清进行真空干燥，−80°C保存备用。
【数据】通量：96样品/批次；细胞量：~2.5 × 10^8 cells；平台：RayKol液体处理系统
4.6 mSPA材料性能评估
本节评估了mSPA材料与裂解缓冲液的兼容性、耐温性和保质期，具体见补充材料。
【数据】原文未详述
4.7 NanoLC-MS/MS分析与数据分析
使用LTQ Orbitrap Velos、Q-Exactive和Lumos Fusion（Thermo Fisher Scientific）质谱仪。MS原始文件使用Proteome Discoverer（PD）软件（2.5版，Thermo Fisher Scientific）和MaxQuant（2.1.0.0版）处理。具体细节见补充材料。
【数据】质谱仪：LTQ Orbitrap Velos、Q-Exactive、Lumos Fusion；软件：Proteome Discoverer 2.5、MaxQuant 2.1.0.0
研究结果
2.1 面向细胞工厂的全自动化蛋白质组学样品前处理工作流程的理性设计
微生物细胞工厂的理性工程需要对工程菌株进行全面的蛋白质组学分析，但菌株文库的大量产生在高通量样品处理中造成了关键瓶颈。当前自动化系统在细胞裂解和高效蛋白提取等关键过程中仍面临根本性限制，往往需要额外仪器和人工样品转移，这可能降低处理通量并引入样品损失风险。这一空白促使我们开发全自动化的菌株-肽段转换系统（命名为SPC）。
为满足这一需求，我们策略性地避免引入专用裂解装置和与MS不兼容的试剂以确保可行性。随后，我们开发了与自动化液体处理系统兼容的mSPA材料用于蛋白富集。全面表征表明，mSPA磁珠与常见变性剂（4% SDS、8 M尿素和6 M GdnHCl）完全兼容，对高温孵育（95°C，30 min）具有强大耐受性，在妥善保存条件下保质期超过24个月。菌株到肽段转换的每一步都经过优化，以最大化通量同时最小化处理时间。最终流程简单且全自动化，适用于高通量蛋白质组学应用。
如图1所示，该工作流程以使用离液剂（如6 M GdnHCl）的高效微生物裂解和蛋白提取开始。经三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原二硫键后，蛋白通过硫醇特异性偶联共价固定到mSPA颗粒上。随后用甲醇和碳酸氢铵（NH4HCO3，50 mM）缓冲液洗涤，有效去除细胞污染物。然后进行颗粒上胰蛋白酶消化以产生肽段混合物。整个方案使用配备轨道振荡器、可编程加热模块和磁分离系统的商业化液体处理工作站实现自动化。从初始菌株处理到最终肽段制备，工作流程只需一次“开始”命令启动。
【数据】mSPA兼容性：4% SDS、8 M尿素、6 M GdnHCl；耐温：95°C，30 min；保质期：>24个月；裂解剂：6 M GdnHCl；还原剂：TCEP；洗涤：甲醇 + 50 mM NH4HCO3
2.2 SPC策略的开发与优化
细菌细胞壁的存在使得从微生物菌株中有效提取蛋白必须采用机械破碎（如研磨或超声处理）。然而，这些传统方法涉及劳动密集的多步骤操作，延长了处理时间并存在样品损失风险。为解决这一限制，我们系统评估了高温条件下化学裂解剂（SDS、GdnHCl、Triton X-100和NP40）作为物理破碎替代方案的可行性。4% SDS和6 M GdnHCl均实现了与机械研磨相当的蛋白产量（见补充材料）。这一发现表明，在处理有限微生物生物量（<10^9个细胞）时，物理破碎并无显著优势。与SDS相比，GdnHCl因其与下游去除过程的优异兼容性而被选为最佳离液剂。同时补充10 mM TCEP以实现完全的二硫键还原。
对于大队列样品，在肽段测量中消除干扰MS的化合物至关重要。进一步研究了加热时间对提取效率的影响。补充材料显示，95°C处理5 min与10 min GdnHCl处理的蛋白产量相当，确定5 min为最佳时长。为验证提取的可扩展性，我们使用热GdnHCl方案在2.5 × 10^8至2 × 10^9个细胞的细菌载量范围内量化了蛋白回收率。初始细胞数与提取蛋白量之间存在强线性相关性（R² > 0.98），证实了方法的可重复性（见补充材料）。
为研究mSPA磁珠富集对蛋白鉴定的影响，我们优化了15 min至1 h的孵育时长。在此时间范围内，蛋白质组覆盖度保持一致，每个样品平均鉴定到1,193 ± 26个蛋白组（n = 9，均值±SD）和6,836 ± 224条肽段（n = 9）。值得注意的是，1 h孵育后的蛋白鉴定数与15 min处理相比无显著差异，蛋白丰度跨三个数量级的表征也保持一致（见补充材料）。其原因可能主要归因于微球在溶液中的良好分散性以及碘乙酰胺与硫醇基团间的快速反应，提高了化学反应的效率。
此外，蛋白消化是样品处理流程中的另一个关键阶段。传统酶解方案通常需要长时间孵育（37°C，12–16 h），造成显著瓶颈。为提高消化效率，我们采用了胰蛋白酶和Lys-C组成的双蛋白酶系统。在相同时长下，单独胰蛋白酶与双酶处理的蛋白鉴定数相当（图2A），但混合蛋白酶系统（1:1，w/w）将漏切率从12.48%显著降低至7.73%。进一步优化消化参数发现，50°C热加速可在5 min内完成完全酶解，在漏切率（8.47% vs. 9.57%）和蛋白鉴定数（1,138 vs. 1,149；图2B）方面均达到与37°C、20 min常规消化相当的性能。这一效率提升可能源于胰蛋白酶（K/R特异性）和Lys-C（K特异性）之间互补的切割特异性。此外，升高的温度提高了反应速率，使得在显著缩短的时间内实现近乎完全的酶解。50°C、5 min的时长代表了动力学加速与酶完整性之间的平衡，确保高效消化而不产生实质性活性损失。
使用这些优化条件，包括蛋白提取和富集、干扰物去除和消化在内的整个样品制备时间可大幅缩短至1 h，有望显著提高样品制备通量。作为原理验证，使用SPC策略处理大肠杆菌菌株，随后进行nano-LC-MS/MS分析。如图2C所示，使用Orbitrap Velos质谱仪在三个生物学重复中鉴定到的蛋白数分别为1,186、1,206和1,191。其中，1,026个蛋白在所有三个重复中均被鉴定到，占所有鉴定蛋白的73%。此外，蛋白消化的漏切率低于10%，表明消化效率高（图2D）。为进一步评估SPC策略对蛋白质组定量的影响，计算了三个重复中蛋白无标记定量（LFQ）强度的变异系数（CV），显示主要频率分布区间为5%∼6%，中位CV为6.7%（图2E）。图2F显示三个生物学重复的Pearson相关系数达到0.994，证明我们的方法可实现高定量精度。
【数据】化学裂解：4% SDS和6 M GdnHCl产量与机械研磨相当；最佳裂解时间：95°C，5 min；线性范围：2.5 × 10^8–2 × 10^9 cells，R² > 0.98；mSPA孵育：15 min–1 h；蛋白组鉴定：1,193 ± 26（n = 9）；肽段鉴定：6,836 ± 224（n = 9）；漏切率：双酶7.73% vs 单酶12.48%；热加速消化：50°C，5 min vs 37°C，20 min（漏切率8.47% vs 9.57%；蛋白数1,138 vs 1,149）；三重复蛋白鉴定：1,186/1,206/1,191；三重复共有蛋白：1,026（73%）；漏切率：<10%；中位CV：6.7%；Pearson相关系数：0.994
2.3 SPC策略的性能评估
为进一步评估SPC策略的性能，我们采用了Abele课题组的比较研究结果。在分析的七种细菌快速蛋白质组表征方法中，选择SP3进行比较，因其具有优越的蛋白质组覆盖度、自动化兼容性以及在微生物蛋白质组学中的常用性。为确保公平比较，相同的大肠杆菌菌株分别用SPC和SP3方案处理。
图3A显示，SPC方案在1 h内鉴定到的蛋白组和肽段数与SP3方案在18 h内的鉴定结果相当。这一结果直接证明了SPC在保持鉴定深度的同时大幅缩短了处理时间。图3B的Venn图展示了两种方法鉴定蛋白的重叠情况，表明SPC与SP3在蛋白质组覆盖度上具有高度一致性。
【数据】SPC处理时间：1 h；SP3处理时间：18 h；蛋白鉴定深度：相当
（注：原文节选在此处截断，后续结果内容未在给定节选中完整呈现。）
讨论与解读
我们开发了一种新型SPC策略，使用标准液体处理系统在1小时内完成96个微生物样品的完整蛋白质组学前处理，实现了优异的可重复性（Pearson相关系数>0.95，中位CV<13%）。该集成工作流程结合了快速化学裂解、mSPA蛋白富集和加速消化方案。当应用于TCA循环工程大肠杆菌菌株时，SPC流程揭示了翻译、跨膜转运和代谢过程中的系统性蛋白质组重塑，证明了平衡通路工程优于单酶过表达的必要性。
编译者解读： 这项工作的核心价值在于将蛋白质组学样品前处理从“手工技艺”转化为“标准化工业流程”。传统SP3方法18小时的过夜消化被压缩至5分钟，且未牺牲鉴定深度，这得益于GdnHCl化学裂解与mSPA共价富集的巧妙组合——既绕开了物理破碎的仪器依赖，又通过硫醇特异性共价偶联实现了耐洗涤的固相载体。94%的时间缩减使“设计-构建-测试-学习”循环中蛋白质组学环节不再成为通量瓶颈。值得注意的是，mSPA材料超过24个月的稳定性和与SDS、尿素、GdnHCl的广泛兼容性，为未来整合入全自动化“菌株进-数据出”的云端分析管道奠定了基础。局限在于当前方案仍依赖商业化液体处理工作站，小型实验室的普及门槛尚存。
参考来源
Wu, Y. (2026). Automated strain-to-peptide conversion: a high-throughput proteome analysis platform empowering rational design of microbial cell factories. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134010
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134010