来源：Dynamic regulation and enhancement of synthetic network for efficient biosynthesis of monoterpenoid α-pinene in yeast cell factory（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蒎烯是植物源挥发性单萜，广泛用于香精、农药和生物燃料领域。微生物细胞工厂合成α-蒎烯效率长期受限。本研究通过葡萄糖依赖的动态调控策略实现酵母细胞生长与α-蒎烯生产的解偶联，使产量较对照提升101.1倍；随后强化甲羟戊酸（MVA）途径与胞质乙酰-CoA库，过表达转运蛋白Sge1重塑全局基因转录，最终在3-L生物反应器中通过优化通气速率使α-蒎烯产量达1.8 g/L，为目前细胞工厂报道的最高水平。
研究背景
蒎烯是从针叶树中提取的植物挥发性单萜，具有独特香气及抗炎、抗癌、杀虫活性，应用于调味品、香料、化妆品、药品和农药等领域。其紧凑的双环结构使其成为高密度可再生燃料的潜在候选物。目前蒎烯主要来源于纸浆工业副产物——松节油，但植物提取效率低且不可持续，难以实现大规模工业化生产。近年来，蒎烯已在微生物细胞工厂中成功合成。细胞内单萜的直接前体香叶基二磷酸（GPP）由异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）缩合而成。IPP和DMAPP的生物合成主要有两条途径：主要存在于革兰氏阳性菌、动物和酵母中的甲羟戊酸（MVA）途径，以及甲基赤藓醇4-磷酸（MEP）途径。尽管已有α-蒎烯合成的报道，合成效率低仍是限制其生产的关键瓶颈。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
基因片段的聚合酶链式反应（PCR）扩增使用Phanta Flash Master Mix和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，中国）。质粒通过Gibson assembly或Golden Gate Assembly方法构建。使用E. coli Fast-T1（Vazyme，中国）感受态细胞进行克隆和质粒构建。酵母转化采用LiAc法。以酿酒酵母CEN.PK2-1D为合成α-蒎烯的初始菌株。本研究构建的所有酵母菌株和质粒列于补充材料中。
【数据】PCR酶：Phanta Flash Master Mix/Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase；组装方法：Gibson assembly/Golden Gate Assembly；宿主菌：E. coli Fast-T1；酵母转化：LiAc法；初始菌株：S. cerevisiae CEN.PK2-1D
2.2 培养基与发酵条件
大肠杆菌在37°C、220 rpm条件下于Luria-Bertani（LB）培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）中培养，添加100 μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素。酵母菌株使用YPD培养基（2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）或合成完全（SC）缺陷培养基（2%葡萄糖、0.67%含硫酸铵的酵母氮碱、0.13%混合氨基酸粉末）培养。摇瓶培养时，单菌落接种于1.25 mL培养基中，30°C、250 rpm培养20 h，然后取0.25 mL预培养物转接至2.25 mL培养基中，在相同条件下培养。种子培养物随后转接至含20 mL培养基的100 mL摇瓶中，初始OD600为0.2。向摇瓶中加入肉豆蔻酸异丙酯（IPM，10%，v/v）作为有机萃取相，在发酵过程中同时萃取α-蒎烯。发酵在30°C、250 rpm条件下进行72 h。
【数据】大肠杆菌培养：37°C、220 rpm、LB培养基、100 μg/mL抗生素；酵母培养：YPD或SC缺陷培养基；摇瓶培养：30°C、250 rpm、20 h预培养、初始OD600=0.2；IPM添加量：10%（v/v）；发酵条件：30°C、250 rpm、72 h
2.3 代谢物分析
发酵液中的葡萄糖和乙醇通过配备Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad，300 mm × 7.8 mm）的HPLC（Agilent 1260 Infinity II）测定。α-蒎烯分析时，两相培养的有机相经12000 rpm离心2 min收集，然后用己烷稀释。样品在配备HP-5 ms色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的Agilent 8890-5977B GC/MSD Ultra上定量。进样量1 μL，分流比1:30，载气为氦气（1 mL/min）。进样口温度230°C。色谱柱初始温度60°C保持1 min，以1°C/min升至73°C，再以5°C/min升至165°C，然后以20°C/min升至280°C并保持5 min。离子源温度230°C，采用扫描模式，监测m/z范围40-500，溶剂延迟5 min。胞内代谢物分析时，取2 mL酵母培养物离心收集并破碎。胞内代谢物用乙酸乙酯和己烷（1:1，v/v）萃取，干燥后用N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化。检测程序：进样量1 μL，分流比1:5，氦气载气1.5 mL/min。进样口温度250°C。色谱柱初始温度60°C保持1 min，以20°C/min升至310°C并保持11.5 min。离子源温度230°C，扫描模式，m/z监测范围50-800，溶剂延迟8 min。使用标准品定量代谢物浓度。α-蒎烯、棕榈酸、油酸、硬脂酸、角鲨烯和羊毛甾醇购自Aladdin（中国），棕榈反油酸和麦角甾醇购自Macklin（中国）。有机相中α-蒎烯浓度换算为发酵液中的浓度作为α-蒎烯产量。
【数据】HPLC色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm × 7.8 mm）；GC/MS色谱柱：HP-5 ms（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；进样量：1 μL；分流比：1:30（α-蒎烯）/1:5（胞内代谢物）；程序升温：60°C→73°C（1°C/min）→165°C（5°C/min）→280°C（20°C/min）；衍生化试剂：BSTFA；标准品来源：Aladdin/Macklin
2.4 RNA-seq
工程菌株在YPD培养基中30°C、250 rpm条件下培养。分别在24、48和72 h收集细胞提取RNA。RNA-seq使用Illumina Bcl2fastq平台完成，数据质量评估使用FastQC软件（v0.10.1）。基因表达量使用Htseq软件（v0.6.1）计算，采用每千碱基每百万读段的片段数（FPKM）方法。差异表达分析使用Bioconductor软件包中的edgeR（v3.28.1），经DESeq和TMM标准化后进行。差异表达基因（DEG）筛选标准为log2FoldChange ≥ 2且Q值（FDR，Padj）≤ 0.05。DEG的Gene Ontology（GO）富集分析使用GOseq进行。原始测序数据已上传至NCBI SRA数据库，登录号PRJNA1192002。
【数据】培养条件：YPD培养基、30°C、250 rpm；取样时间点：24、48、72 h；DEG筛选阈值：log2FoldChange ≥ 2、Q值 ≤ 0.05；SRA登录号：PRJNA1192002
2.5 补料分批发酵
补料分批发酵时，单菌落转接至10 mL YPD培养基中，250 rpm、30°C培养24 h。一级种子接种至90 mL YPD培养基中培养18 h。二级种子转接至含900 mL培养基的3-L生物反应器（T&J Bio-engineering，中国）中，培养基成分为：3%葡萄糖、1%酵母提取物、1%蛋白胨、1%玉米浆、0.8% KH₂PO₄、0.3% MgSO₄·7H₂O、0.02% ZnSO₄·7H₂O、0.5% (NH₄)₂SO₄。36 h时向反应器中加入400 mL IPM，收集瓶含800 mL IPM用于收集从空气出口蒸发的α-蒎烯。补料液I（50%葡萄糖、1%酵母提取物、1%蛋白胨、1%玉米浆、0.5% KH₂PO₄、0.5% MgSO₄·7H₂O、0.35% K₂SO₄、0.028% Na₂SO₄）在12至36 h期间以平均流速0.35 mL/min补加用于细胞生长。补料液II（75%乙醇）在36至120 h期间以0.17 mL/min流速补加。空气流速设置为0.5至2 Nl/min。通过控制搅拌速度（300至800 rpm）维持溶解氧为30%。通过补加15%氨水控制pH为5.0。反应器和收集瓶中IPM中的α-蒎烯浓度换算为发酵液中的浓度以表示其产量。
【数据】反应器体积：3-L；初始培养基：3%葡萄糖、1%酵母提取物、1%蛋白胨、1%玉米浆、0.8% KH₂PO₄、0.3% MgSO₄·7H₂O、0.02% ZnSO₄·7H₂O、0.5% (NH₄)₂SO₄；IPM添加：400 mL（36 h）；收集瓶IPM：800 mL；补料液I流速：0.35 mL/min（12-36 h）；补料液II：75%乙醇、0.17 mL/min（36-120 h）；空气流速：0.5-2 Nl/min；溶解氧：30%；pH：5.0；搅拌速度：300-800 rpm
2.6 产物纯化与NMR表征
发酵结束后，收集油相（IPM上层）并离心。通过真空蒸馏（148.6°C，10 Mpa）获得纯α-蒎烯。纯产物为无色油状物，用于核磁共振（NMR）分析。将产物溶于CDCl₃，使用600 MHz NMR波谱仪（Bruker Avance NEO）进行¹H和¹³C分析。NMR谱图使用MestReNova软件分析（见补充材料）。
【数据】真空蒸馏条件：148.6°C、10 Mpa；NMR波谱仪：600 MHz Bruker Avance NEO；溶剂：CDCl₃
研究结果
3.1 生产与细胞生长之间的动态平衡提高α-蒎烯合成效率
为生产α-蒎烯，在酵母中表达了来自火炬松的α-蒎烯合酶Pt30以及关键酶tHmg1和Idi1。作为α-蒎烯的直接前体，GPP是Erg20合成的FPP合成过程中的中间产物。Erg20对GPP具有较高亲和力，导致Pt30催化GPP的效率较低（图1a）。为降低Erg20对GPP的催化活性从而为单萜合酶提供充足前体，研究人员开发了两个对GPP亲和力较低的Erg20突变体F96W和N127W，以及一个正交的NPP合酶Npps1。本研究测试了使用这些酶提高产量的效果。结果显示，使用NPP合酶时α-蒎烯产量增幅最大，从0.4 mg/L增至6.4 mg/L（图1c），与文献报道一致。然而，由于Erg20的表达将GPP导向甾醇合成而非单萜合成，α-蒎烯产量仍然较低。
为减少Erg20对GPP的消耗，采用动态解偶联策略重新配置α-蒎烯生产与细胞生长之间的平衡（甾醇合成正向影响酵母生长）（图1b）。将天然ERG20和ERG7启动子替换为葡萄糖感应启动子P HXT1或弱启动子P ERG7，而Pt30和Erg20突变体或Npps1由GAL启动子表达，该启动子在葡萄糖耗尽时被诱导。P HXT1在葡萄糖存在时强度高于P ERG20和P ERG7，但在葡萄糖耗尽时被抑制。这使得细胞在葡萄糖存在时快速生长，而葡萄糖耗尽时细胞生长停止并启动α-蒎烯合成（图1b）。结果显示，采用P HXT1调控甾醇合成途径并采用Erg20N127W增强单萜合成时获得最高α-蒎烯产量，达37.8 mg/L（菌株Pi10），较初始菌株Pi01提高101.1倍（图1c）。这进一步证明使用P HXT1调控甾醇合成途径是单萜合成的高效策略。
发酵曲线也表明动态调控实现了生长与生产的解偶联（图1d和e）。在葡萄糖存在时，菌株Pi10与Pi01相比具有更高的生物量和葡萄糖利用能力。在α-蒎烯生产阶段，菌株Pi10的生长受到抑制，更多碳源用于α-蒎烯生产。同时，Pi10表现出较低的甾醇和游离脂肪酸含量，表明动态调控系统使更多碳流向α-蒎烯生产（图1f和补充材料）。
【数据】初始产量：0.4 mg/L；NPP合酶产量：6.4 mg/L；动态调控最高产量：37.8 mg/L（菌株Pi10）；提升倍数：101.1倍；启动子：P HXT1、P ERG7、GAL启动子；突变体：Erg20F96W、Erg20N127W、Npps1
3.2 强化前体供应提高α-蒎烯产量
为提高α-蒎烯的前体供应，过表达MVA途径中的基因以增加合成通量（图2a）。过表达ERG10、ERG12、ERG8和ERG19时，最高α-蒎烯产量达103.0 mg/L，提高了172.6%（图2b）。此外，乙醛脱氢酶（ADA）和消耗NADH的HMG-CoA还原酶（NADH-HMGr）据报道可提高萜类产量。然而，过表达这些酶仅改善了细胞生长而非产量（图2b）。其他MVA基因的过表达也无法进一步提高产量，表明MVA途径并非α-蒎烯生产的瓶颈。此外，使用质粒pRS426过表达α-蒎烯合成相关基因后产量下降，进一步证明MVA途径无需继续强化（见补充材料）。甾醇和游离脂肪酸含量的增加也表明前体已得到强化（图2c和d）。
为进一步减少GPP向FPP的分流，测试了其他Erg20突变体。用候选Erg20同工酶和突变体替换Erg20后发现，除Erg20K197V略微提高α-蒎烯滴度6.8%外，大多数酶无法提高α-蒎烯产量（图3a）。提高催化特异性的另一种方法是形成底物通道，使中间产物快速进入下游酶的催化区域。这可通过使用肽连接子或肽标签使酶靠近来实现。然而，GPP合酶与Pt30的偶联并未增强α-蒎烯产量，而GPP合酶与Idi1的偶联使α-蒎烯产量略微提高约6.6%（图3b）。此外，过表达辅因子相关基因后α-蒎烯产量无显著变化（见补充材料）。
乙酰-CoA的可利用性也影响MVA途径的通量（图4a）。为提高胞质乙酰-CoA库，强化了来自酿酒酵母的线粒体丙酮酸输入蛋白Mpcox、内源柠檬酸输出蛋白Yhm2，以及来自构巢曲霉的ATP-柠檬酸裂解酶Acla和Aclb、来自解脂耶氏酵母的Acl1和Acl2、来自小鼠的Acl。结果显示，AnAcl对α-蒎烯产量的提升最为显著，达138.1 mg/L（图4b）。总体而言，强化GPP和乙酰-CoA供应使α-蒎烯产量提高了34.1%。
【数据】MVA过表达最高产量：103.0 mg/L；提升幅度：172.6%；过表达基因：ERG10、ERG12、ERG8、ERG19；Erg20K197V提升：6.8%；Idi1偶联提升：约6.6%；AnAcl最高产量：138.1 mg/L；总提升：34.1%
3.3 转运蛋白Sge1提高α-蒎烯产量
生物燃料的毒性被认为是影响其生物合成效率的重要因素之一。因此，筛选了一系列潜在转运蛋白以表征它们是否能促进α-蒎烯外排。多个转运蛋白表现出对α-蒎烯产量的显著改善，其中酵母内源转运蛋白Sge1效果最为突出，使α-蒎烯产量提高了27.2%（图5a）。相反，敲除Sge1降低了α-蒎烯产量（见补充材料）。在最优工程菌株Pi63中过表达Sge1后，α-蒎烯产量达152.6 mg/L，提高了10.5%（图5b）。然而，由于胞内α-蒎烯比例较小，难以准确检测转运蛋白对产物外排的影响（见补充材料）。尽管如此，发现Sge1能促进α-蒎烯生产、刺激细胞生长和葡萄糖利用（图5c和d）。
为探究Sge1促进α-蒎烯产量的原因，进行了转录组分析。在Sge1过表达菌株中，差异表达基因（DEGs）在细胞生长阶段（24 h，67个显著上调基因和18个显著下调基因）主要表现为上调，在生产阶段（72 h，131个显著上调基因和166个显著下调基因）主要表现为下调（见补充材料）。为进一步探究DEGs的途径分布信息，对不同时间的DEGs进行了Gene Ontology富集分析和KEGG富集分析。富集分析显示，生长阶段脂肪酸和乙醇代谢显著增强。然而，生产阶段的脂肪酸β-氧化被下调。此外，麦角甾醇和甾醇生物合成途径也……
【数据】Sge1过表达提升：27.2%；最优菌株Pi63中过表达Sge1产量：152.6 mg/L；提升幅度：10.5%；24 h DEGs：67个上调、18个下调；72 h DEGs：131个上调、166个下调
3.4 补料分批发酵
（原文此部分内容在节选中未完整呈现，图6展示了补料分批发酵的示意图及不同通气条件下的发酵结果。图7未提供图注。）
【数据】发酵规模：3-L生物反应器；α-蒎烯最终产量：1.8 g/L（原文摘要数据）
讨论与解读
本研究构建了高效合成α-蒎烯的酵母菌株。通过葡萄糖依赖的时序控制实现α-蒎烯生产与竞争途径的动态调控，促进了发酵前期细胞的快速生长和发酵后期α-蒎烯的积累。动态调控实现了工程菌株生长与生产的解偶联，α-蒎烯产量提高101.1倍，是α-蒎烯生物合成中最高效的调控策略。过表达MVA途径使α-蒎烯滴度进一步提高172.6%。随后通过强化前体和利用转运蛋白进一步增强了α-蒎烯产量。最后，优化生物反应器中的空气流速，在3-L生物反应器中实现α-蒎烯产量1.8 g/L，为微生物细胞工厂中报道的最高α-蒎烯产量。该代谢工程策略为酵母细胞工厂中单萜的生物合成奠定了基础。
编译者解读
本研究的技术路线体现了合成生物学中"动态调控"与"多模块协同强化"的系统思维——先用葡萄糖感应启动子实现生长与生产的时序解偶联，再逐层打通前体供应和产物外排瓶颈。这种先解偶联再强化的策略对其它萜类乃至脂肪族化合物的微生物合成具有直接借鉴价值。值得注意的是，动态调控带来的101.1倍提升远大于后续代谢途径强化的效果，提示"调控逻辑设计"往往比"通量堆叠"更具杠杆效应。局限在于，Sge1促进产量的机制尚未完全阐明，转录组显示的多效性效应可能涉及复杂的全局调控网络；此外，1.8 g/L的产量距离工业化仍有距离，两相发酵中有机溶剂IPM的成本与回收也是工程化落地的现实约束。
参考来源
Zhang Y. Dynamic regulation and enhancement of synthetic network for efficient biosynthesis of monoterpenoid α-pinene in yeast cell factory[J]. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132064
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132064