来源：Creating a glycolysis-minimized central metabolism for efficient biosynthesis and cell growth in yeast（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）凭借底物谱广、耐高温等优势，正成为合成生物学的重要底盘。然而，天然糖酵解（EMP）途径的溢流代谢——乙醇大量积累——长期制约目标产物合成效率。本研究通过CRISPR/Cas9敲除醛缩酶基因FBA阻断EMP上半段，结合适应性实验室进化（ALE）与反向代谢工程，发现了一个负性中央代谢调控因子CMR（A3612）。敲除CMR可将碳流近乎完全转向磷酸戊糖途径（PPP），NADPH/NADP⁺比值提升3倍，游离脂肪酸摇瓶产量达1.43 g/L，补料分批发酵产量达27.1 g/L，经后续优化更创下41.7 g/L的实验室纪录。这一单基因重连策略对檀香烯合成同样有效，展示了NADPH密集型生物合成的通用平台价值。
研究背景
细胞生长依赖碳在各代谢通路间的均衡分配，这一过程被称为"碳预算"。自然进化使几乎所有生物都依赖EMP途径（糖酵解）供能供碳——因其对环境扰动不敏感。但糖酵解并非葡萄糖代谢的最优路径，尤其对工业目标分子生产而言：酵母中过度的糖酵解常导致乙醇积累，代谢通量失衡，目标产物合成困难。因此，有必要探索能平衡代谢通量与能量传递的替代途径。大多数生物拥有糖酵解的替代通路，如磷酸酮醇酶途径、Entner–Doudoroff途径和磷酸戊糖途径（PPP）。本研究旨在通过阻断EMP、激活PPP，构建一种糖酵解最小化的中央碳代谢网络，同时保障细胞生长与高效合成游离脂肪酸。
研究方法
CRISPR/Cas9系统遗传操作
所有菌株均通过本课题组此前在多形汉逊酵母中建立的CRISPR/Cas9系统构建。基因的删除与整合按照标准流程执行，包括gRNA设计、质粒与供体DNA构建、转化、菌落验证及选择性标记去除。所得质粒、引物、供体DNA构建体及优化的异源基因分别列于补充表S2、S3、S4和S5。
所有同源定向修复供体片段均通过重叠延伸PCR（OE-PCR）组装：各同源臂、启动子和编码序列以带重叠末端的引物扩增，融合为完整的线性模板。无痕基因删除时，1000 bp上游与下游同源臂直接连接，不插入任何标记。多基因整合时，完整表达盒融合至1000 bp位点特异性同源序列。每次转化使用等量（500 ng）纯化线性供体DNA和序列验证的gRNA质粒。
酵母电转化感受态细胞制备：将菌株（OD600=0.2）接种于YPD培养基，37°C、220 rpm培养至OD600达0.8–1.0。细胞经含DTT的磷酸盐缓冲液洗涤以通透细胞壁，再用蔗糖基电转缓冲液重悬。取60 μL感受态细胞悬液与DNA混合物混合，在7.5 kV/cm、50 μF、129 Ω条件下电击，产生约4 ms脉冲。电击后细胞于新鲜YPD培养基中37°C静置复苏1 h，无菌水洗涤后涂布于SD选择性平板，37°C培养72–96 h获得转化子。
挑取单转化菌落，以结合在同源臂外侧的引物对进行菌落PCR验证，区分精确同源重组与随机非同源末端连接修复事件。基因型确认后，阳性菌株划线于含5-FOA的SD培养基以消除携带URA3的附加型gRNA质粒；无残留质粒的治愈菌株在发酵或二次基因组编辑前经PCR重新验证。
【数据】供体DNA用量：500 ng；电转条件：7.5 kV/cm、50 μF、129 Ω、~4 ms脉冲；复苏：37°C、1 h；筛选培养：37°C、72–96 h；同源臂长度：1000 bp
适应性实验室进化（ALE）
ALE流程如图S1C所示。简要而言，亲本菌株NX10点种于YPD平板，5个独立单菌落于YPD培养基中37°C、220 rpm培养16–20 h。进化第一阶段：这5株菌转移至含葡萄糖与木糖10:1混合物的极限培养基（G10×1）。若OD600达到6–8，进化菌株转移至以10 g/L葡萄糖为唯一碳源的培养基（G10）；若未达到，则以初始OD600=0.4转接至相同培养基。进化第二阶段：5株菌以初始OD600=0.4转接至G10培养基。若48 h内OD600达到3–6，进化菌株以更低初始OD600转接至相同培养基。当菌株能在G10培养基中正常生长（36 h内OD600达5–6）时，进化过程结束。每转接5次，菌株保存并经PCR验证。最终进化菌株点种于YPD平板，每组挑取8个菌落，在含20 g/L葡萄糖为唯一碳源的极限培养基（G20）中评估细胞生长与FFA产量。
【数据】起始培养基：G10×1（葡萄糖:木糖=10:1）；G10：10 g/L葡萄糖；G20：20 g/L葡萄糖；培养条件：37°C、220 rpm；第一阶段起始OD600=0.4；第二阶段48 h内OD600达3–6；进化终点：36 h内OD600达5–6；每5次转接保存验证
基因组测序分析
选取5株菌进行基因组测序，包括第I组（5号）、第II组（2号）、第III组（3号）、第IV组（7号）和第V组（8号）的进化菌株。采用SDS法提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，Qubit DNA检测试剂盒配合Qubit 3.0荧光计（Invitrogen，美国）定量。每样本0.2 μg DNA作为文库制备投入材料。测序文库使用NEBNext Ultra™ DNA文库制备试剂盒（Illumina，NEB，美国）按厂商推荐方案构建，并为每样本添加索引码。简要流程：基因组DNA经超声打断至350 bp片段；片段经末端修复、加A尾、连接Illumina全长接头，随后进行PCR扩增。PCR产物经AMPure XP系统（Beckman Coulter，Beverly，美国）纯化后，DNA浓度用Qubit 3.0荧光计测定，文库大小分布用Agilent 2100 Bioanalyzer分析，并通过实时定量PCR定量（>2 nM）。索引编码样本的簇生成在cBot簇生成系统上用Illumina PE Cluster Kit完成。簇生成后，DNA文库在Illumina平台上测序，产生150 bp双端读段。Illumina平台获得的原始荧光图像文件经碱基识别转换为短读段（原始数据），记录为FASTQ格式。有效测序数据通过Burrows–Wheeler Aligner（BWA）软件比对至参考基因组，获得BAM格式的原始比对结果（参数：mem -t 4 -k 32 -M）。随后用SAMtools（参数：rmdup）和Picard对结果进行去重复重排。
【数据】测序读长：150 bp双端；DNA投入量：0.2 μg/样本；打断片段大小：350 bp；文库定量：>2 nM；比对软件：BWA（mem -t 4 -k 32 -M）；去重复：SAMtools rmdup + Picard
转录组分析
为进行转录分析，对照菌株NX1、进化菌株NXE1015和反向代谢工程菌株NX1A在G20极限培养基中37°C、220 rpm培养至OD600达3–4。每样本总RNA用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）按厂商说明提取。完整性大于6.5的RNA（2130 Bioanalyzer，Agilent Technologies检测）用于文库构建和测序。cDNA文库由北京基因组研究所BGISEQ-500平台构建和测序。为检测各样本间基因表达差异，采用单端技术，单次运行获得约40–50 bp读段。差异表达基因（DEGs）用DESeq2 R包（v.1.20.0）分析，以每组3个克隆的平均值显示。
【数据】培养条件：G20培养基、37°C、220 rpm、OD600=3–4；RNA完整性阈值：>6.5；测序平台：BGISEQ-500；读长：40–50 bp单端；分析软件：DESeq2 v.1.20.0；每组克隆数：3
同位素标记实验
同位素标记实验的样品制备使用含10 g/L 100% D-葡萄糖-1-¹³C（Sigma–Aldrich）的极限培养基，于摇瓶中进行。菌株以OD600=0.2接种，在指数中后期（OD600约6–8）收获。色谱分离在Thermo Fisher Ultimate 3000 UHPLC系统上进行，使用Waters BEH酰胺柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）。进样量1 μL，流速0.4 mL/min。流动相为含15 mM乙酸铵和0.2%氢氧化铵的水溶液（相A）和90%乙腈（相B）。线性梯度洗脱程序：0–0.5 min，90% B；8 min，70% B；8.1–9.5 min，50% B；9.6–12 min，90% B。洗脱液经Thermo Fisher Q Exactive™杂合四极杆-Orbitrap™质谱仪（QE）在加热电喷雾电离负离子模式下分析。喷雾电压4000 V，毛细管温度和探针加热器温度均为320°C，鞘气流量35（Arb），辅助气流量10（Arb），S-Lens RF水平50（Arb）。全扫描在70000 FWHM（m/z=200）高分辨率下进行，扫描范围70–1050 m/z，AGC目标设定为3×10⁶。质量同位素分布数据……（原文截断）
【数据】标记底物：10 g/L 100% D-葡萄糖-1-¹³C；接种OD600=0.2；收获OD600≈6–8；色谱柱：Waters BEH酰胺柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；进样量：1 μL；流速：0.4 mL/min；喷雾电压：4000 V；温度：320°C（毛细管与探针）；分辨率：70000 FWHM；扫描范围：70–1050 m/z；AGC：3×10⁶
研究结果
糖酵解阻断菌株（FBAΔ）在葡萄糖极限培养基中的生长缺陷
酵母天然通过EMP和PPP代谢葡萄糖（图2A），其中EMP承担主要代谢通量。本研究尝试通过阻断多形汉逊酵母——一种具有广泛底物利用能力的潜在工业酵母——的上半段EMP，构建仅通过PPP代谢葡萄糖的菌株。以FFA生产菌株NX1为起始菌株，研究细胞生长与产物合成之间的代谢调控，因为FFA生物合成对NADPH的强依赖性恰好响应PPP调控。醛缩酶（Fba）在糖酵解中发挥关键作用，在多形汉逊酵母中由单基因编码（图2A），是阻断EMP的理想靶点。FBA缺失（菌株NX10）导致葡萄糖极限培养基中生长缺陷（图2C），表明天然PPP途径无法为酵母生长提供充足的物质与能量。
进一步在木糖培养基中评估NX10的生长——因为木糖代谢对PPP的依赖大于糖酵解。有趣的是，菌株NX10在极限木糖培养基（X20）和含木糖与葡萄糖的极限培养基（G10X10）中均能生长（图S1B），尽管迟滞期长于对照菌株NX1。这些结果表明，PPP在葡萄糖存在时能为酵母生长提供物质和能量，但葡萄糖培养条件下PPP的代谢通量有限。
【数据】菌株：NX10（FBAΔ）；生长缺陷：葡萄糖极限培养基；可生长培养基：X20、G10X10；对照菌株：NX1
ALE恢复FBAΔ菌株生长并提高FFA产量
随后尝试通过ALE恢复菌株NX10（FBAΔ）在葡萄糖极限培养基中的生长。5个独立NX10菌落先在含10 g/L葡萄糖和1 g/L木糖的极限培养基（G10X1）中传代培养4次，再在葡萄糖培养基（G10）中培养16次（图2D、S1C和S1D）。5组菌株均恢复了以葡萄糖为唯一碳源的G10培养基中的细胞生长，但FFA产量各异（图S1E）。与对照菌株NX1相比，所有选出的进化菌株均表现出较低的最大比生长速率（μmax）或较长迟滞期，但FFA产量和最终生物量更高（NX4-4除外）（图S2）。这些结果表明，进化后的FBAΔ菌株重新连接了FFA生物合成的代谢网络。
选择最终生物量和FFA产量相对较高（1.04 g/l）的菌落NXE1015进行后续研究（图2E）。随后在补料分批生物反应器培养中比较原养型菌株NX1U（对照）和NXE1015U（进化FBAΔ菌株）的细胞生长与FFA产量——这两株菌分别通过在NX1和NXE1015中原位互补营养缺陷标记基因URA3构建。互补URA3显著改善了摇瓶中的细胞生长和FFA产量，尤其NXE1015U产生了1.43 g/l FFA（图S3）。然而，在生物反应器中，尽管最终生物量相近，菌株NXE1015U仍表现出显著长于对照菌株NX1U的迟滞期和更低的葡萄糖消耗（图2F）。菌株NXE1015U产生27.1 g/l FFA，比菌株NX1U高1.23倍（图2G）。此外，与NX1U相比，进化菌株NXE1015U的FFA产量和生物量得率（YXS）均显著提高（图2H）。
【数据】FFA产量：NXE1015为1.04 g/L；NXE1015U为1.43 g/L（摇瓶）；NXE1015U为27.1 g/L（生物反应器）；倍数：比NX1U高1.23倍；进化传代：G10X1中4次+G10中16次
代谢谱分析揭示进化菌株PPP途径活性与ATP产生增加
进一步利用同位素标记检测菌株NXE1015和NX1的代谢通量（图3A）。通过EMP代谢1-¹³C标记葡萄糖应导致C3代谢物甘油醛-3-磷酸（G3P）和3-磷酸甘油酸（3PG）的标记（M+1）与未标记（M+0）形式各占50%——而通过PPP代谢则因葡萄糖第一位碳以CO₂形式释放，应产生100%的M+0代谢物（图3B）。
¹³C同位素示踪代谢分析显示，进化菌株NXE1015中检测到的EMP途径代谢物几乎100%为未标记的M+0形式，而对照菌株NX1中M+0比例始终低于75%（图3B）。由于EMP中间体的M+0同位素体完全来源于PPP的碳通量，这一模式直接证明NXE1015中的葡萄糖代谢以PPP为主导。相比之下，NX1中较低的M+0比例对应计算的PPP通量仅为43.29%（补充表S6），证实对照菌株主要利用糖酵解（EMP）分解葡萄糖。同样，菌株NXE1015中所有检测到的三羧酸（TCA）循环代谢物的M+0比例接近100%，远高于菌株NX1（图3B）；更重要的是，菌株NXE1015的NADPH/NADP⁺比值比菌株NX1高3倍（图3C）。
这些结果表明，通过阻断EMP并施加ALE，成功实现了通量从上EMP向PPP的转移，构建了一株完全依赖进化适应的PPP主导、糖酵解最小化代谢网络的酵母菌株，且生物量得率和FFA产量均提高。有趣的是，菌株NXE1015的NADH/NAD⁺和ATP水平远高于菌株NX1（图3C），表明全局代谢重连增强了还原力和能量供应。虽然糖酵解（EMP）理论上每分子葡萄糖的ATP产量更高（图1B），但工程化的PPP主导、糖酵解最小化菌株表现出显著升高的稳态ATP水平（图3C）。这一表观矛盾反映了理论化学计量与体内生理学之间的差异：天然糖酵解主导代谢常伴随溢流代谢、呼吸效率降低和蛋白质组分配次优，限制了实际ATP产生。相比之下，以PPP为中心的代谢可能重塑菌株的整个中央碳代谢（能量代谢），以平衡辅因子、前体代谢物和能量的供应。
【数据】PPP通量：NXE1015近100% M+0；NX1中PPP通量计算值43.29%；NADPH/NADP⁺比值：NXE1015为NX1的3倍；M+0比例：NXE1015中EMP/TCA代谢物近100%，NX1中<75%
A3612作为负性中央代谢调控因子，控制EMP向PPP的转换
为探究EMP向PPP代谢转变的机制，以野生型菌株为参考，对各进化组中性能最优的独立进化克隆进行全基因组测序。在不同功能类别中鉴定出多种单核苷酸多态性和小片段插入/缺失，涉及核糖体生物发生（MAK21）、翻译调控（Rie1p）、pH稳态（KHA1和SLY41）、氧化还原平衡（CYSL）相关基因，以及数个未表征的开放阅读框（ORFs：PJ4664.02、A3822）。推测这些突变共同增强细胞适应性、优化能量与氧化还原稳态、微调全局细胞生理。
值得注意的是，假定的转录因子基因A3612（基因ID：28920315）在全部5个进化组中均发生突变（图4A）。NCBI同源搜索显示，其最接近的特征化同源物是酿酒酵母的Gal4转录激活因子，同一性28.8%，查询覆盖率54%。然而，A3612并非半乳糖代谢调控因子——这与多形汉逊酵母无法代谢半乳糖的事实一致。敲除A3612（菌株NX10A）部分恢复了FBAΔ菌株NX10在含葡萄糖培养基中的生长……
【数据】突变基因数：8个（5组中共同）；A3612同源物：酿酒酵母Gal4（同一性28.8%，覆盖率54%）；A3612基因ID：28920315；突变检出：全部5个进化组
将乙酰-CoA生物合成从PPP转向增加FFA产量
（原文此部分内容截断，以下根据可获得的图表清单与上下文推断该部分涉及磷酸酮醇酶-磷酸转乙酰酶（PK–PTA）途径的构建与评估）
【数据】原文未详述
讨论与解读
从进化视角看，细胞代谢途径已被优化为高效利用资源支持生长，这导致了对糖酵解产生能量和生物质前体的依赖。然而，这种以生长为导向的代谢架构并不适合工业生物生产。快速且不受调控的糖酵解常导致溢流代谢和乙醇积累，破坏代谢通量平衡，限制FFA等目标代谢物的合成。因此，重新评估和改造中央葡萄糖代谢对于开发更高效的生物催化剂至关重要。
本研究证明，将通量从EMP转向PPP主导状态可以克服这些天然限制。与优先通过EMP实现快速生长和高ATP产量的野生型代谢不同，工程菌株重构代谢以 favoring NADPH供应、氧化还原平衡和前体可用性——这些特性更适合生物合成而非环境竞争。这种转变展示了工业优化如何从自然进化约束中解耦，将细胞优先级转向产物形成。
通过基因组测序和反向代谢工程，进一步揭示了致病变变为负性转录因子A3612的破坏。尽管A3612与GAL4存在一定序列相似性，但功能完全不同。单基因敲除CMR即可实现通量重连，并适用于檀香烯等其他NADPH密集型产物，展示了该策略的通用性。
编译者解读：本研究最值得关注的是"单基因开关"效应——一个转录因子的破坏即可实现近乎彻底的代谢途径切换。这为合成生物学提供了一种简洁的代谢重编程范式：与其多基因精细调控，不如寻找控制全局的"主开关"。但需注意，ALE过程中积累的其他突变（核糖体生物发生、pH稳态等）可能协同贡献了适应度提升，CMR敲除是否足以在工业环境中独立实现同等效果仍需验证。此外，41.7 g/L的产量建立在补料分批策略优化基础上，从摇瓶到工业放大的迟滞期延长和葡萄糖消耗速率下降仍是实际应用的主要瓶颈。
参考来源
期刊：Trends in Biotechnology, 2026
DOI：10.1016/j.tibtech.2026.07.020
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.07.020