来源：Construction of an Escherichia coli cell factory for de novo synthesis of tyrosol through semi-rational design based on phenylpyruvate decarboxylase ARO10 engineering（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酪醇（2-(4-羟苯基)乙醇）是制药工业中广泛应用的天然植物产物。本研究针对酿酒酵母来源的苯丙酮酸脱羧酶ARO10催化效率不足的问题，采用计算机辅助半理性设计策略构建突变文库，并引入异源羟化酶复合物HpaBC建立了高通量筛选方法。通过多轮筛选和位点饱和突变，最终获得两个最优突变体ARO10D331V和ARO10D331C，摇瓶发酵酪醇产量分别达到2.02 g/L和2.04 g/L，较野生型提升超过50%。
研究背景
酪醇因其显著的抗氧化和抗炎特性，在医药和化工领域应用广泛，同时也是合成羟基酪醇、红景天苷等高附加值化学品的重要前体。酪醇天然存在于橄榄油、清酒和绿茶等食品中，工业上对高效合成方法的需求日益增长。目前酪醇的合成方法包括植物提取、化学合成和生物合成。近年来，生物合成作为绿色、可持续且安全的生产方式受到广泛关注。
酪醇可通过微生物中的Ehrlich途径和植物中的酪醇合成途径两条天然途径进行生物合成。目前研究主要使用大肠杆菌和酿酒酵母作为酪醇生物合成的宿主。在大肠杆菌中，从葡萄糖从头合成酪醇主要有三条代谢途径。本研究聚焦于其中的苯丙酮酸脱羧酶ARO10途径，针对该酶催化效率不足的问题展开蛋白质工程改造。
研究方法
2.1 菌株、引物、基因与质粒
宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌JM109以及质粒pEtac和pKK223均来自实验室保存。大肠杆菌JM109用于质粒构建。来自酿酒酵母ATCC 204508的ARO10基因（Q06408）和来自大肠杆菌BL21的HpaBC基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成。用于CAST的常规引物和含NNK的引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成（表S1）。构建的质粒和重组菌株见表S2。
【数据】宿主菌株：E. coli BL21(DE3)、MG1655、JM109；质粒：pEtac、pKK223；基因来源：S. cerevisiae ATCC 204508（ARO10）、E. coli BL21（HpaBC）；引物合成：Genewiz Biotechnology Co., Ltd.
2.2 培养基与培养条件
野生型和重组菌株的单菌落首先通过在琼脂平板上划线获得。随后挑取单菌落接种到LB液体培养基（含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化钠）中，于37°C进行种子培养。之后将培养好的种子以1%接种量接种到50 mL LB液体培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养10小时。随后通过离心收集细胞，并将600 nm处光密度（OD600）调整至一致值。将这些细胞接种到M9Y培养基中（含17.1 g/L十二水合磷酸氢二钠、20 g/L葡萄糖、0.25 g/L酵母提取物、0.5 g/L氯化钠、3 g/L磷酸二氢钾、1 g/L氯化铵，110°C灭菌10分钟；另外加入5 mmol/L七水合硫酸镁溶液，单独121°C灭菌15分钟），于30°C、200 rpm振荡发酵。每12小时取样测定酪醇和羟基酪醇的产量、细胞密度、残糖及其他参数。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；种子培养：37°C；接种量：1%；发酵培养基：50 mL LB，37°C，200 rpm，10 h；M9Y培养基：17.1 g/L Na2HPO4·12H2O、20 g/L葡萄糖、0.25 g/L酵母提取物、0.5 g/L NaCl、3 g/L KH2PO4、1 g/L NH4Cl，110°C灭菌10 min；MgSO4·7H2O：5 mmol/L，121°C灭菌15 min；发酵条件：30°C，200 rpm；取样间隔：12 h
2.3 突变文库的构建与筛选
为生成ARO10突变文库，以质粒pKK223-ARO10-HpaBC为模板，使用CAST方法配合重叠引物（表S1）进行PCR扩增突变质粒。经Dpn I消化后，PCR产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，获得突变转化子。收集琼脂平板上的所有转化子并提取质粒。将提取的质粒转化到表达宿主YMGR（E. coli MG1655 ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR）的感受态细胞中，构建突变文库。随后使用高通量微生物克隆筛选系统（Molecular Devices Qpix420，中国）从突变文库中挑选单菌落。目标单菌落接种到含LB培养基的96孔板中，37°C培养10小时。随后离心去除LB培养基，加入M9Y培养基进行18小时培养。之后取180 μL发酵上清液与20 μL NaIO4混合进行显色反应，用酶标仪测定400 nm处吸光度[18]。选择OD400值较野生型菌株高20%以上的变异株，通过摇瓶发酵进行进一步验证。
【数据】突变方法：CAST；模板：pKK223-ARO10-HpaBC；Dpn I消化后转化JM109；表达宿主：YMGR（MG1655 ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR）；筛选平台：Qpix420；96孔板培养：37°C，10 h（LB），18 h（M9Y）；显色反应：180 μL上清 + 20 μL NaIO4；检测波长：400 nm；筛选阈值：OD400高于野生型20%
2.4 阳性突变体的摇瓶验证
为进一步验证筛选出的突变体能否高效将酪醇转化为羟基酪醇，再次对突变体进行摇瓶发酵。使用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1260，安捷伦科技有限公司，美国）定量测定酪醇和羟基酪醇浓度。为确保羟基酪醇产量的最终提高确实源于ARO10突变，通过删除HpaBC基因，构建了仅含突变ARO10基因的酪醇合成重组菌株。选取酪醇转化效率高的变异株，保存并进行质粒提取。以提取的质粒为PCR模板获得突变ARO10基因。随后将突变基因连接到表达载体上，构建ARO10基因表达质粒。将重组质粒转化到表达宿主YMGR中用于酪醇合成。使用HPLC（Agilent 1260，安捷伦科技有限公司，美国）定量测定酪醇浓度。
【数据】检测方法：HPLC（Agilent 1260）；验证策略：删除HpaBC基因构建仅含突变ARO10的菌株；表达宿主：YMGR
2.5 目标产物检测
发酵结束后，上清液在沸水中加热10分钟，随后1200 rpm离心10分钟。小心收集上清液，用0.22 μm孔径水相滤膜过滤。处理后的样品使用HPLC（Agilent 1260，安捷伦科技有限公司，美国）进行分析。分析使用Agela C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。流动相A为80%（v/v）甲酸[0.1%（w/v）]，流动相B为20%（v/v）甲醇。流速设为1 mL/min，柱温28°C，进样量10 μL，检测波长280 nm。为获得标准曲线，对酪醇和羟基酪醇设置五个不同梯度浓度进行分析并记录对应值。标准曲线的相关系数（R2）值应大于0.999。根据标准曲线确定的浓度计算酪醇和羟基酪醇的发酵含量。
【数据】样品处理：沸水浴10 min，1200 rpm离心10 min，0.22 μm滤膜过滤；色谱柱：Agela C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：80%甲酸[0.1%] + 20%甲醇；流速：1 mL/min；柱温：28°C；进样量：10 μL；检测波长：280 nm；标准曲线R2 > 0.999
2.6 计算机模拟分析
使用AlphaFold2预测ARO10野生型和突变变体的三维结构模型，选择评分最高的模型进行后续分析[19,20]。使用PyMOL分子图形系统展示和渲染三维同源模型。配体分子4HPP从PubChem获得（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。使用Schrödinger 2022-1软件的glide模块对ARO10野生型和突变变体进行分子对接和结合自由能计算[21–23]。详细参数配置和操作流程见先前研究[24,25]。
【数据】结构预测：AlphaFold2；分子对接：Schrödinger 2022-1 Glide；配体：4HPP（PubChem）；可视化：PyMOL
研究结果
3.1 ARO10的半理性设计
在前期研究中，我们通过将酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10整合到大肠杆菌芳香族氨基酸合成途径中，构建了能够从头合成酪醇的重组菌株。我们发现ARO10的基因拷贝数对酪醇合成起关键作用。增加拷贝数可获得更高的酪醇产量，当整合5个拷贝的ARO10基因时产量最高，这表明ARO10的低活性是酪醇生产的限制因素[3]。
为获得活性提高的ARO10变体，我们采用半理性设计方法进行蛋白质工程改造。首先使用AlphaFold2预测ARO10的三维结构模型。随后使用Glide将野生型ARO10分子模型与4HPP进行对接（图2A）。与配体4HPP对接后，在ARO10活性口袋5 Å距离内鉴定出相互作用残基，包括F115、A116、N118、K200、L264、D331、I332、N333、H354和F467（图2B）。其中N118、K200和D331与配体形成氢键，而F467与4HPP的酚环形成π-π堆积相互作用。
【数据】对接软件：Glide；相互作用残基（5 Å内）：F115、A116、N118、K200、L264、D331、I332、N333、H354、F467；氢键残基：N118、K200、D331；π-π堆积：F467
3.2 酪醇快速检测方法的建立
为筛选出能产生高浓度酪醇的含ARO10突变体的重组菌株，有必要建立一种简便快速的酪醇浓度检测方法。由于酪醇可在HpaBC（4-羟苯乙酸3-单加氧酶）复合物的催化下合成羟基酪醇（图3A），可以使用高碘酸钠（NaIO4）比色法快速测定羟基酪醇浓度[26]。据报道，在发酵上清液中，当酪醇与高碘酸钠（一种可将邻二酚化学氧化为邻醌的氧化剂）反应时，产物羟基酪醇呈现黄色，通过测定OD400处的吸光度可定量明显的比色变化。
为验证该方法的可行性，我们在大肠杆菌BL21(DE3)中表达HpaBC基因，并对不同浓度的酪醇进行全细胞催化。当添加的酪醇浓度在0 mmol/L至40 mmol/L范围内时，加入NaIO4后400 nm处吸光度逐渐增加。然而当浓度达到50 mmol/L或更高时，比色值逐渐下降（图3B）。为确认NaIO4比色法在400 nm处吸光度下降与羟基酪醇浓度降低相关，我们进一步使用HPLC测定生成的羟基酪醇浓度。结果显示，当添加的酪醇浓度达到50 mmol/L或更高时，催化产生的相应羟基酪醇也逐渐减少（图3C）。因此，该方法能够检测40 mmol/L范围内的酪醇浓度。
同时，我们还研究了向培养基中添加不同浓度的酪醇对细胞生长的影响，发现随着酪醇浓度增加，细胞生长受到抑制，当酪醇浓度达到50 mmol/L时观察到显著的细胞生长抑制（图3D）。我们通过构建目标产物衍生物合成途径，实现了对目标产物的高通量筛选。该方法也为其他难以产生可见颜色反应的目标化合物的快速检测提供了新途径。
【数据】酪醇浓度检测范围：0–40 mmol/L；显色剂：NaIO4；检测波长：400 nm；酪醇≥50 mmol/L时比色值下降；酪醇≥50 mmol/L时细胞生长显著抑制
3.3 从头合成酪醇的重组大肠杆菌的构建
据报道，NaIO4不仅能与羟基酪醇反应，还能与L-DOPA反应[26]。为避免检测时代谢途径中其他物质的干扰，我们以大肠杆菌MG1655为起始菌株，敲除了与酪醇合成分支途径相关的基因，包括苯乙醛脱氢酶基因feaB、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶基因pheA、酪氨酸转氨酶基因tyrB，以及参与芳香族氨基酸生物合成和转运的全局调控蛋白基因tyrR。由此构建了重组菌株YMGR（MG1655 ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR）。
随后将质粒pKK223-ARO10导入菌株YMGR中，构建重组菌株YMGR pKK223-ARO10。发酵结果表明，将ARO10基因导入YMGR菌株后，实现了酪醇的从头合成，而原始菌株不产生酪醇（图4A）。此外，酪醇是唯一生成的产物，酪醇产量达到1.34 g/L。与对照菌株相比，ARO10基因的导入对YMGR pKK223-ARO10的细胞生长没有显著影响。
【数据】敲除基因：feaB、pheA、tyrB、tyrR；酪醇产量：1.34 g/L；产物：仅酪醇；细胞生长：无显著影响
3.4 ARO10与HpaBC共表达菌株的构建
我们前期研究表明，ARO10基因的导入实现了酪醇的从头合成[3]。为高效筛选活性提高的ARO10突变体，我们旨在通过共表达羟化酶复合物HpaBC基因将酪醇转化为羟基酪醇。如图5A所示，构建了ARO10和HpaBC共表达的重组质粒pKK223-ARO10-HpaBC。
发酵结果显示，酪醇在发酵早期略有积累，36小时后几乎完全转化为羟基酪醇（图5B）。发酵72小时后，羟基酪醇产量达到0.98 ± 0.04 g/L，证明重组菌株YMGR pKK223-ARO10-HpaBC通过ARO10和HpaBC基因的共表达成功合成了羟基酪醇。因此，重组菌株YMGR pKK223-ARO10-HpaBC可用于后续实验中进一步筛选高产酪醇突变体。
【数据】羟基酪醇产量：0.98 ± 0.04 g/L（72 h）；转化时间：36 h几乎完全转化；共表达质粒：pKK223-ARO10-HpaBC
3.5 ARO10突变文库的构建与筛选
基于上述半理性设计策略，我们在ARO10中鉴定了10个潜在突变位点。根据这些残基在序列中的位置将其分为六组。我们为每组设计了随机饱和突变引物，并使用组合CAST策略进行PCR，构建ARO10突变文库[17]。以携带野生型ARO10基因的重组质粒pKK223-ARO10-HpaBC为PCR模板构建ARO10突变文库。
使用高通量筛选平台将单菌落接种到96孔深孔板中进行发酵。使用NaIO4比色法进行初筛。最终从2580个转化子中筛选出一株比色值较野生型提高最多的菌株。测序分析显示ARO10基因发生突变，第331位天冬氨酸残基突变为丝氨酸。
为进一步验证筛选结果，对突变菌株进行摇瓶发酵，并使用HPLC测定酪醇和羟基酪醇浓度。结果显示，发酵72小时后，酪醇几乎完全转化为羟基酪醇。突变菌株YMGR pKK223-ARO10 D331S-HpaBC的羟基酪醇产量高于野生型菌株，达到1.63 ± 0.04 g/L，较野生型提高了66%（图6A和B）。此外，在发酵过程中葡萄糖未被完全消耗（图6C），并且从36小时起观察到细胞密度下降（图6D）。这种下降可能归因于积累的羟基酪醇对细胞活力的抑制作用，导致细胞密度下降和葡萄糖消耗能力降低。
为验证羟基酪醇产量的增加确实源于ARO10突变，我们删除了HpaBC基因，构建了重组菌株Y…
【数据】突变位点数：10个；分组：6组；筛选转化子数：2580；突变体：D331S；羟基酪醇产量：1.63 ± 0.04 g/L（72 h）；较野生型提高：66%；细胞密度下降时间：36 h起
讨论与解读
本研究成功应用基于计算机的半理性设计策略对酪醇合成途径中的关键酶ARO10进行改造。通过蛋白质建模和分子对接分析，鉴定了影响ARO10对AHPP催化活性的潜在热点残基。采用CAST策略缩小突变文库规模。通过引入外源基因HpaBC，建立了快速高效筛选高产酪醇突变体的方法。利用高通量筛选平台，从2580个转化子中成功筛选出一个阳性突变体。基于该阳性突变体进行定点饱和突变，进一步提高了酪醇合成浓度。最终筛选出两个较野生型酪醇合成能力显著提高的突变体ARO10D331V和ARO10D331C。对应的重组菌株YMGR pKK223-ARO10 D331V和YMGR pKK223-ARO10 D331C的酪醇产量分别为2.02 g/L和2.04 g/L，较野生型菌株提高超过50%。通过ARO10基因整合后共表达HpaBC基因，重组菌株YMGR pKK223-ARO10 D331V-HpaBC和YMGR pKK223-ARO10 D331C-HpaBC实现了1.6 g/L的羟基酪醇产量，较相应野生型菌株提高了63%。计算机模拟分析表明…
【数据】最优突变体：ARO10D331V、ARO10D331C；酪醇产量：2.02 g/L（D331V）、2.04 g/L（D331C）；较野生型提高：>50%；羟基酪醇产量：1.6 g/L；较野生型提高：63%
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编译者解读
本研究展示了一个典型的合成生物学闭环流程：途径构建→关键酶半理性改造→高通量筛选→产物验证。巧妙之处在于利用HpaBC将酪醇转化为羟基酪醇，再通过NaIO4显色实现间接高通量检测，绕开了酪醇本身难以快速定量的瓶颈。这种"衍生物筛选"策略具有一定通用性，可推广至其他缺乏便捷检测手段的目标产物。D331位点的发现也提示，活性口袋中与底物形成氢键的残基往往是改造的优先靶点。不过，摇瓶产量与工业发酵之间仍有距离，后续的发酵工艺优化和放大验证尚需开展。
参考来源
Xia Y. Construction of an Escherichia coli cell factory for de novo synthesis of tyrosol through semi-rational design based on phenylpyruvate decarboxylase ARO10 engineering. International Journal of Biological Macromolecules, 2023.
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127385
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127385