来源：Systematic modular engineering of genome-integrated Escherichia coli MG1655 for high-level 2′-fucosyllactose production（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）是人乳中含量最丰富的低聚糖，具有益生元与免疫调节功能，在婴幼儿营养领域应用前景广阔。本研究以大肠杆菌MG1655为底盘，通过系统模块化优化——包括α-1,2-岩藻糖基转移酶基因BKHT多拷贝整合、GDP-L-岩藻糖供给路径协同增强、以及外排转运蛋白MdfA的引入——最终获得一株完全基因组整合、无需抗生素和诱导剂的高产菌株。摇瓶产量达17.18 g/L，5-L发酵罐补料分批发酵60小时产量高达154.12 g/L，生产强度2.57 g/L/h，为目前报道的最高2′-FL产量。
研究背景
人乳低聚糖（HMOs）是母乳中第三大固体组分，在新生儿健康与发育中发挥多重作用。在已鉴定的200多种HMO结构中，2′-FL含量最高、研究最为深入，占人乳总HMO的30%以上。化学结构上，2′-FL是由半乳糖、葡萄糖和岩藻糖组成的三糖。由于牛乳中缺乏2′-FL，而牛乳是婴儿配方奶粉的主要基底，这推动了对其生物学功能与应用潜力的广泛研究。临床证据表明，2′-FL对婴儿安全，具有调节肠道菌群组成、增强肠道屏障功能、免疫调节及支持认知发育等健康益处。2′-FL已获EFSA批准为新型食品成分（EU 2015/2283法规），并获FDA GRAS认定（GRN Nos. 650和1099），是全球首个获准商业化应用的HMO。
微生物发酵法是规模化生产2′-FL的主流策略。近年来，Li等人通过鉴定新型α-1,2-FT（NsFutC）结合迭代代谢工程实现141.27 g/L产量（3.14 g/L/h）；Liang等人利用BKHT酶在E. coli BL21Star(DE3)中实现136.71 g/L产量且无副产物生成。然而，这些高产策略多依赖质粒表达系统，需抗生素和诱导剂维持，存在遗传不稳定性和法规合规性问题。本研究以野生型E. coli MG1655为底盘，通过系统模块化工程实现全基因组整合的高产2′-FL菌株构建。
研究方法
2.1 摇瓶培养
采用Luria-Bertani（LB）培养基制备种子培养物。2′-FL生物合成使用基于甘油的限定培养基，其组成为：5 g/L酵母提取物、20 g/L甘油、13.5 g/L KH₂PO₄、4 g/L (NH₄)₂HPO₄、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O、4.5 mg/L硫胺素、1.7 g/L柠檬酸，以及10 mL/L微量元素溶液（含10 g/L FeSO₄·7H₂O、2 g/L CaCl₂、1 g/L CuSO₄·5H₂O、2.2 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.38 g/L MnSO₄·H₂O、0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄和0.02 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O）。无菌挑取单菌落接种至含4 mL LB培养基的10-mL试管中，37°C、200 rpm恒温振荡过夜培养。种子培养时间为10–12小时。随后以2%（v/v）接种量转接至含25 mL改良培养基的250-mL摇瓶中。培养物于37°C培养至对数生长中期（OD600 = 0.6–0.8），此时添加乳糖至终浓度15 g/L。乳糖添加后，培养物于30°C、200 rpm振荡继续培养72小时以支持高效2′-FL合成。
【数据】培养基：LB/甘油限定培养基；温度：37°C（种子及前期）/30°C（诱导期）；时间：10–12h（种子）/72h（产糖期）；转速：200 rpm；接种量：2%（v/v）；乳糖浓度：15 g/L；OD600：0.6–0.8
2.2 基因编辑
本研究所用菌株汇总于表1。以本实验室前期构建的E. coli MG1655衍生菌株MGC06为遗传操作亲本菌株。基因组编辑采用双质粒CRISPR-Cpf1系统，按先前发表的程序进行。针对靶向基因敲除和整合，通过将模板质粒中的N23间隔序列替换为靶标特异性引导序列来构建定制sgRNA表达载体，从而在靶基因组位点介导位点特异性切割。组装后，将整合片段和sgRNA表达质粒共电转化至含有pEcCpf1质粒的感受态细胞中。感受态细胞采用标准10%甘油法制备。电转化后，转化子在37°C复苏1小时，随后涂布于含壮观霉素（50 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）的LB琼脂平板进行筛选。阳性克隆通过跨整合位点的侧翼引物进行菌落PCR鉴定，编辑事件经PCR产物Sanger测序确认。该方案应用于后续所有额外靶位点的基因组修饰，仅需相应调整sgRNA序列和同源臂。本研究所用整合位点包括poxB、yjiT、iclR和yeeL，这些位点基于先前报道被鉴定为E. coli中性基因组位点，其破坏不影响细胞生长或中心代谢。在BKHT拷贝数优化中，额外拷贝依次整合至不同位点，以评估整合位点对基因表达和2′-FL产量的潜在位置效应。
为获得无质粒菌株用于发酵，进行了顺序质粒消除。将单菌落接种至含1.64 mg/mL L-鼠李糖和50 μg/mL卡那霉素的4 mL LB培养基中，37°C培养。在含卡那霉素的LB琼脂上划线后，将菌落转移至仅含卡那霉素或卡那霉素加壮观霉素（各50 μg/mL）的LB琼脂平板。仅在卡那霉素平板上生长的菌落（表明sgRNA质粒已消除）在含5 g/L葡萄糖的LB培养基中37°C、200 rpm振荡培养10–12小时。随后将培养物划线于含5 g/L葡萄糖和10 g/L蔗糖的LB琼脂。仅在无抗生素平板上生长的菌落（表明pCpf1质粒已消除）被选为无质粒接种物用于后续实验。
【数据】抗生素浓度：壮观霉素50 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL；L-鼠李糖：1.64 mg/mL；葡萄糖：5 g/L；蔗糖：10 g/L；温度：37°C；时间：1h（复苏）/10–12h（质粒消除培养）；转速：200 rpm；整合位点：poxB、yjiT、iclR、yeeL
2.3 补料分批发酵
2′-FL生产的中试放大发酵在5-L生物反应器（T&J Bioengineering，上海）中进行，使用含20 g/L甘油和5 g/L酵母提取物的甘油基础培养基。生物反应器初始工作体积设定为2 L。所有发酵过程均以补料分批模式运行。发酵在37°C下以10%（v/v）接种量启动。通过自动添加14%（w/v）氢氧化铵将培养液pH维持在6.8。浓缩补料溶液含600 g/L甘油、20 g/L MgSO₄·7H₂O和0.2 g/L硫胺素，间歇补充。当OD600达到约15–20时，培养温度降至30°C，并添加乳糖至终浓度8 g/L。随后采用底物控制补料策略，定期取样检测残余甘油和乳糖水平以合理调整补料。
【数据】反应器体积：5-L；初始工作体积：2 L；接种量：10%（v/v）；甘油：20 g/L（初始）/600 g/L（补料）；酵母提取物：5 g/L；pH：6.8；温度：37°C→30°C；乳糖：8 g/L；氢氧化铵：14%（w/v）；MgSO₄·7H₂O：20 g/L（补料）；硫胺素：0.2 g/L（补料）；OD600阈值：15–20
2.4 分析方法
胞外代谢物浓度按既定标准程序测定。培养物以10,000g离心10分钟去除细胞生物量，所得上清液用0.22-μm PVDF膜（Millipore，Bedford，MA）无菌过滤。2′-FL、乳糖和甘油水平通过高效液相色谱（HPLC，1200系列；Waters，Milford，MA）定量，配备温控示差折光检测器，检测器温度35°C。HPLC进样量固定为10 μL。色谱分离在Rezex™ ROA-Organic Acid H⁺（8%）柱（300 × 7.8 mm；Phenomenex，Torrance，CA）上进行，采用等度洗脱模式。流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.6 mL/min，柱温维持在60°C。数据采集和峰积分使用HPLC系统标准软件完成。定量使用分析标准品制备的标准曲线进行，以确保测量准确性。
【数据】离心：10,000g、10 min；滤膜：0.22-μm PVDF；进样量：10 μL；色谱柱：Rezex™ ROA-Organic Acid H⁺ (8%) 300 × 7.8 mm；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：60°C；检测器温度：35°C
2.5 遗传稳定性连续传代试验
为评估最终工程菌株MGC064在无抗生素和无诱导剂条件下的遗传稳定性，进行了连续传代试验。将MGC064单菌落接种至4 mL LB培养基（不含抗生素），37°C、200 rpm振荡过夜培养。该培养物标记为第0代（T0）。取500 μL等分试样与50%（v/v）甘油混合，保存于−80°C。连续传代时，将过夜培养物以1:1000（v/v）比例稀释至新鲜LB培养基中，每12小时传代一次，在相同条件下培养。每次稀释步骤计为一代，重复5次（T1至T5）。每次传代时取样并按上述方法保存。传代结束后，将T0、T1、T2、T3、T4和T5的甘油储备液解冻并划线于LB琼脂平板（不含抗生素）。从各代次挑取单菌落用于摇瓶发酵。摇瓶发酵按2.1节所述进行，添加15 g/L乳糖。培养72小时后，按2.4节所述通过HPLC测定2′-FL浓度，并在同一时间点通过OD600监测细胞生长。所有测量均进行三次重复。各代次的2′-FL滴度和OD600均以T0对应值（设为100%）进行归一化，结果以相对百分比（均值±标准差）表示。
【数据】传代次数：5次（T1–T5）；稀释比例：1:1000（v/v）；传代间隔：12h；甘油：50%（v/v）；乳糖：15 g/L；培养时间：72h；重复次数：3次
研究结果
3.1 BKHT多拷贝整合增强2′-FL产量
在大肠杆菌2′-FL生物合成工程中，必须引入异源α-1,2-FT，以GDP-L-岩藻糖为糖基供体，催化外源补充的乳糖发生岩藻糖基化反应，从而生成2′-FL（图1）。成功构建基因组整合型2′-FL生产菌株取决于三个关键因素：乳糖底物的高效利用、GDP-L-岩藻糖供体的充足供给以及α-1,2-FT的适当表达。
在本实验室前期研究中，我们基于野生型E. coli MG1655构建了基因组整合型2′-FL生产菌株MGC06。具体而言，乳糖转运蛋白基因lacY的天然启动子被替换为强组成型启动子PJ23119以增强乳糖摄取，同时敲除lacZ和wcaJ以防止内源乳糖水解并重定向代谢流。为确保充足的GDP-L-岩藻糖供给，基因簇cpsB-cpsG和gmd-fcl的天然启动子同样被替换为PJ23119。最后，整合了编码来自螺杆菌属的高效α-1,2-FT的BKHT基因单拷贝，以催化转糖基反应。BKHT具有强产物特异性，未检测到二岩藻糖基乳糖（DFL）和3-岩藻糖基乳糖（3-FL）等副产物的形成。该酶的卓越潜力近期已被Liang等人证实，他们通过"推-拉"策略结合辅因子工程在E. coli BL21Star(DE3)中实现了136.71 g/L的高2′-FL产量，凸显了BKHT用于高产2′-FL生产的适用性。在此基础上，我们通过模块化代谢工程对MGC06菌株进行系统改造，充分释放其生产潜力，实现高产基因组整合型2′-FL生产菌株的开发。
在HMOs生产的基因组整合型微生物细胞工厂工程中，关键糖基转移酶的多拷贝整合是增强催化能力和提高产物滴度的便捷有效策略。充足的基因剂量可充分利用酶学潜力，从而推动途径通量流向目标产物。该方法已在前期研究中得到成功验证。Liao等人构建了一系列携带2–6拷贝hpgalT基因的菌株，观察到乳糖-N-新四糖（LNnT）产量随拷贝数增加而上升，但超过最适阈值后下降。三拷贝菌株产量最高，摇瓶中较单拷贝菌株提高98.72%，5-L发酵罐中提高73.28%。类似地，Yang等人在构建乳糖-N-岩藻糖五糖I（LNFP I）生产菌株时系统优化了三种糖基转移酶的拷贝数。鉴于我们前期构建的菌株MGC06仅携带单拷贝BKHT基因，优化该α-1,2-FT的拷贝数自然是增强2′-FL产量的首要策略。
以MGC06为亲本菌株，我们依次将额外的BKHT表达盒整合至poxB和yjiT位点，分别生成菌株MGC062（双拷贝）和MGC063A（三拷贝）。摇瓶发酵结果如图2所示。携带一、二、三拷贝BKHT的菌株分别产生3.15 g/L、7.95 g/L和5.83 g/L的2′-FL，同时维持相当的细胞密度，OD600值在12至14之间。双拷贝菌株MGC062获得最高产量，而进一步增加至三拷贝导致产量显著下降至5.83 g/L。这些结果表明α-1,2-FT基因剂量显著影响2′-FL生物合成能力。
染色体上的基因表达水平可能受其特定整合位点的影响。为评估位置效应是否导致三拷贝构型性能下降，我们以MGC062为基础菌株，将第三个BKHT表达盒整合至替代位点iclR或yeeL，分别构建了额外三拷贝菌株MGC063B和MGC063C。如图2所示，这些菌株的2′-FL产量分别为6.76 g/L和6.32 g/L。尽管三个三拷贝菌株（MGC063A、MGC063B和MGC063C）的产量存在一定差异（5.83 g/L至6.76 g/L），但均显著低于最优双拷贝菌株MGC062（7.95 g/L）。这些发现表明，虽然整合位点对表达有可测量的影响，但超过最适拷贝数的负面效应无法简单通过重新定位额外基因拷贝来克服。基于上述结果，双拷贝BKHT整合菌株MGC062被选为后续工程改造的最适宿主菌株，在增强生产能力和稳健细胞生长之间取得平衡。
【数据】BKHT拷贝数：1/2/3；2′-FL产量：3.15/7.95/5.83 g/L（MGC06/MGC062/MGC063A）；6.76/6.32 g/L（MGC063B/MGC063C）；OD600：12–14；整合位点：poxB、yjiT、iclR、yeeL
3.2 GDP-L-岩藻糖生物合成途径增强
大肠杆菌内源GDP-L-岩藻糖生物合成途径从果糖-6-磷酸出发，经过五个连续酶催化反应（图3A）。第一步由ManA催化，将果糖-6-磷酸转化为甘露糖-6-磷酸，被认为是关键的流量控制点，因为果糖-6-磷酸是多种途径竞争的关键代谢中间体。前期研究表明，增强manA表达可有效提高GDP-L-岩藻糖途径通量，从而提升2′-FL或3-FL产量。
为进一步提高MGC062的2′-FL产量，我们将天然manA启动子替换为强组成型启动子PJ23119，生成菌株MGC062A。出乎意料的是，摇瓶发酵显示MGC062A的2′-FL产量显著下降至3.64 g/L，远低于亲本水平（7.95 g/L）（图3B）。这一结果表明manA过表达可能破坏2′-FL生物合成途径的平衡并导致产量下降，该现象与前期观察一致。此例说明，即使是公认的工程靶点，在不同菌株背景或途径环境中也可能产生适得其反的结果，凸显了代谢工程中经验验证的必要性。
鉴于manA增强效果不佳，我们将注意力转向GDP-L-岩藻糖途径的下游基因，特别是基因簇cpsG-cpsB和gmd-fcl。在前期工作中，在不同菌株背景下同时将cpsG-cpsB和gmd-fcl的启动子替换为PJ23119，显著提升了2′-FL产量，从4.19 g/L提高至9.21 g/L。为解析这两个基因簇在MGC062背景下的各自贡献，我们构建了整合gmd-fcl或cpsG-cpsB表达盒的菌株，分别命名为MGC062B和MGC062C。摇瓶发酵获得MGC062B和MGC062C的2′-FL产量分别为7.78 g/L和6.14 g/L，均略低于亲本MGC062（7.95 g/L）（图3B）。考虑到在成功的工程报道中cpsG-cpsB和gmd-fcl常从质粒共过表达或在基因组水平同时增强，我们接下来构建了同时整合增强两个基因簇的菌株MGC062D。值得注意的是，这种组合工程策略产生了协同效应：MGC062D产生11.55 g/L的2′-FL，较亲本MGC062提高45.3%（图3B）。这一显著提升证明cpsG-cpsB和gmd-fcl的协同增强有效提高了GDP-L-岩藻糖供给并释放了进一步的2′-FL生产潜力，而单独增强任一基因簇均不足以实现显著提升。
【数据】2′-FL产量：MGC062A 3.64 g/L、MGC062B 7.78 g/L、MGC062C 6.14 g/L、MGC062D 11.55 g/L；提高幅度：45.3%（MGC062D vs MGC062）；亲本对照：7.95 g/L（MGC062）
讨论与解读
本研究通过系统模块化代谢工程，在基因组整合型E. coli MG1655底盘上实现了2′-FL的高水平生产。从基础菌株MGC06出发，逐步优化了三个关键模块：α-1,2-FT（BKHT多拷贝整合）、GDP-L-岩藻糖供给（cpsG-cpsB和gmd-fcl协同增强）以及外排转运（mdfA过表达）。这种逐步优化策略充分释放了宿主菌株的生产潜力。最终工程菌株MGC064在摇瓶中产生17.18 g/L 2′-FL，在5-L生物反应器补料分批发酵中60小时达到154.12 g/L，生产强度2.57 g/L/h。整个发酵过程无需抗生素和诱导剂，凸显了该无质粒系统的遗传稳定性和法规合规性。据我们所知，这是迄今报道的最高2′-FL产量，使该工程菌株成为2′-FL商业化生产的有力候选者。该工作也证明，通过合理的模块化设计和基因组整合策略，可以在不依赖质粒系统的前提下实现超越质粒体系的产量，为其他HMOs的微生物合成提供了可借鉴的范式。
编译者解读：本研究的方法论价值在于"全基因组整合"路线——完全摒弃质粒表达系统，将全部遗传修饰稳定锚定于染色体，从源头规避了工业发酵中抗生素添加和诱导剂使用的合规性难题。BKHT拷贝数优化中呈现的"先升后降"曲线与manA过表达的意外负效应，共同揭示了代谢工程中"经验验证优于理论推演"的朴素真理。154.12 g/L的产量标注着该领域的里程碑，但需注意，该产量依赖乳糖底物补料策略，其工业化经济性——包括乳糖成本与转化率——仍是商业化落地前需要审视的关键维度。
参考来源
Chen R. Systematic modular engineering of genome-integrated Escherichia coli MG1655 for high-level 2′-fucosyllactose production. Enzyme and Microbial Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110937
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110937