来源：Multidimensionally engineered Escherichia coli for efficient gadusol biosynthesis with high-throughput quantitative analysis（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
高丝菌素（gadusol）是一种天然环己烯酮化合物，具有强效紫外线吸收与抗氧化活性，在化妆品与食品领域应用前景广阔。本研究通过重构斑马鱼来源的生物合成途径、运用RBS工程和ssl-sRNA全局调控策略，在大肠杆菌中实现了高丝菌素的高效生产。同时，基于其抗氧化特性建立了DPPH高通量比色定量方法，最终在5升生物反应器中产量达4.2 g/l，技术就绪水平约5级。
研究背景
高丝菌素（3,5,6-三羟基-5-羟甲基-2-甲氧基环己-2-烯-1-酮）是一种天然环己烯酮化合物，因其强效紫外线吸收特性和广泛的生物学功能而受到关注。与类菌孢素氨基酸（MAAs）一样，高丝菌素源自共同的生物合成前体——景天庚酮糖-7-磷酸（S7P），随后两条途径分化进入不同的生物合成分支。高丝菌素在UVB（280–320 nm，pH 7）或UVC（<280 nm）区域表现出强吸收带，中性条件下最大吸收波长为296 nm，酸性条件下为268 nm。天然状态下，高丝菌素存在于斑马鱼、鲑鱼和鲟鱼等多种鱼类的卵中，以及珊瑚礁生态系统中，在保护海洋胚胎和珊瑚免受紫外线辐射方面发挥关键作用。除光保护功能外，高丝菌素还表现出显著的抗氧化活性，鱼卵提取物在生理pH下具有与抗坏血酸相当的自由基清除能力，甚至对过氧自由基具有更优异的断链活性。以往获取高丝菌素主要依赖从特定发育时期的鱼卵或组织中提取，例如从鲟鱼鱼卵中提取。
研究方法
sRNA文库的构建
为设计具有抑制功能的合成单茎环小RNA（ssl-sRNA），首先开发了一段21核苷酸（nt）序列，该序列能够桥接各潜在靶基因的ATG起始密码子与5′非翻译区（5′UTR）。随后，采用一锅法PCR策略组装最终的抑制性ssl-sRNA构建体，其中包含24 nt反向配对碱基、茎环结构和polyU尾，具体方法如前所述。为鉴定大肠杆菌BL21（DE3）基因组中靶基因对应的特异性21 nt序列，利用sRNA评分功能并访问sslRNAD网络服务器（http://www.kangzlab.cn/）。接下来，使用设计好的引物和质粒模板pTargetF进行混合PCR，从而在pTargetF载体上生成sRNA。将混合PCR产物（总体积50 μl）加入1 ml大肠杆菌JM109感受态细胞中。转化混合物在冰上（4°C）孵育20 min，随后在42°C热激90 s，并立即在冰上（4°C）冷却3 min。然后向混合物中加入700 μl LB培养基，在37°C、220 rpm振荡培养45 min。回收的菌液以4000 rpm离心1 min，细胞沉淀用50 μl LB培养基重悬以浓缩细胞。将重悬细胞等分涂布于含50 μg/ml壮观霉素的固体LB琼脂平板上。平板在37°C静置培养12 h，收集所有菌落合并形成sRNA细菌文库，并按照上述方法进行质粒文库提取，获得靶向基因的sRNA文库。本研究使用的所有质粒已提交至GenBank数据库，对应的GenBank登录号范围为PX682359-PX682458（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PX682359）。
【数据】菌株：E. coli JM109；质粒：pTargetF；抗生素浓度：50 μg/ml壮观霉素；热激温度：42°C；热激时间：90 s；培养温度：37°C；振荡转速：220 rpm；培养时间：45 min（复苏）/12 h（平板）；离心：4000 rpm，1 min；GenBank登录号：PX682359-PX682458
DPPH自由基清除实验
DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除活性通过紫外分光光度法测定：以无水乙醇配制15 mM DPPH储备液，用无水乙醇稀释至0.15 mmol/l作为工作液。测定时，取100 μl稀释的高丝菌素样品与100 μl DPPH工作液混合，充分混匀后于37°C避光孵育30 min。在517 nm处测定吸光度，记为A1。对照实验中，100 μl蒸馏水与100 μl乙醇混合，在相同条件下孵育，测定吸光度记为A2。另外，100 μl蒸馏水与100 μl 0.15 mmol/l DPPH乙醇溶液混合，在相同条件下孵育，测定吸光度记为A3。所有样品使用96孔平底微孔板测定，517 nm处吸光度由配备1 cm光程的微孔板读取器获取。所有测量均以蒸馏水校准。所有实验均进行三次生物学重复和三次技术重复。DPPH自由基清除率按以下公式计算：DPPH自由基清除率% = (A3 − A1 − A2) / A3 × 100%。
【数据】DPPH储备液浓度：15 mM；工作液浓度：0.15 mmol/l；反应体积：100 μl样品 + 100 μl DPPH工作液；温度：37°C；时间：30 min；检测波长：517 nm；光程：1 cm；重复：生物学三次 × 技术三次
ABTS自由基清除实验
ABTS（2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））自由基清除活性测定如下：将7 mM ABTS溶液与2.45 mM过硫酸钾溶液等体积混合制备ABTS+·储备液，于37°C避光孵育12 h。然后用10 mmol/l磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将ABTS+·工作液稀释至0.35 mM。测定时，取100 μl稀释的高丝菌素样品与100 μl ABTS+·工作液混合，充分混匀后于37°C避光孵育30 min。在734 nm处测定吸光度，记为B1。对照实验中，100 μl蒸馏水与100 μl磷酸盐缓冲液混合，在相同条件下孵育，测定吸光度记为B2。另外，100 μl蒸馏水与100 μl ABTS+·工作液混合，在相同条件下孵育，测定吸光度记为B3。所有样品使用96孔平底微孔板测定，734 nm处吸光度由配备1 cm光程的微孔板读取器获取。所有测量均以蒸馏水校准。所有实验均进行三次生物学重复和三次技术重复。ABTS+·自由基清除率按以下公式计算：ABTS+·自由基清除率% = (B3 − B1 − B2) / B3 × 100%。
【数据】ABTS浓度：7 mM；过硫酸钾浓度：2.45 mM；工作液浓度：0.35 mM；缓冲液：10 mmol/l磷酸盐缓冲液（pH 7.4）；孵育温度：37°C；孵育时间：30 min（储备液12 h）；检测波长：734 nm；光程：1 cm；重复：生物学三次 × 技术三次
邻菲啰啉铁还原实验
邻菲啰啉铁还原活性测定如下：将10 mM 1,10-邻菲啰啉与10 mM FeCl3·6H2O等体积混合制备储备液，于37°C避光孵育12 h。然后用10 mmol/l磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将工作液稀释至0.5 mM。测定时，取100 μl稀释的高丝菌素样品与100 μl邻菲啰啉铁工作液混合，充分混匀后于37°C避光孵育30 min。在510 nm处测定吸光度，记为C1。对照实验中，100 μl蒸馏水与100 μl磷酸盐缓冲液混合，在相同条件下孵育，测定吸光度记为C2。另外，100 μl蒸馏水与100 μl邻菲啰啉铁工作液混合，在相同条件下孵育，测定吸光度记为C3。所有样品使用96孔平底微孔板测定，510 nm处吸光度由配备1 cm光程的微孔板读取器获取。所有测量均以蒸馏水校准。所有实验均进行三次生物学重复和三次技术重复。Fe3+还原率按以下公式计算：Fe3+还原率% = (C3 − C1 − C2) / C3 × 100%。
【数据】邻菲啰啉浓度：10 mM；FeCl3·6H2O浓度：10 mM；工作液浓度：0.5 mM；缓冲液：10 mmol/l磷酸盐缓冲液（pH 7.4）；孵育温度：37°C；孵育时间：30 min（储备液12 h）；检测波长：510 nm；光程：1 cm；重复：生物学三次 × 技术三次
Trolox等效抗氧化能力（TEAC）测定
ABTS自由基清除活性测定如下：将7 mM ABTS溶液与2.45 mM过硫酸钾溶液等体积混合制备储备液，于37°C避光孵育12–16 h。然后用10 mmol/l磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将ABTS+·工作液稀释至0.35 mM。Trolox标准品用无水乙醇溶解配制成1 mmol/l储备液，再用无水乙醇进一步稀释至0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/l用于标准曲线构建。测定时，空白对照（D1）为100 μl ABTS+·工作液与100 μl乙醇混合，Trolox标准品样品为100 μl稀释Trolox与100 μl ABTS+·工作液混合。所有混合物充分涡旋混匀，于37°C避光孵育30 min，用微孔板读取器在734 nm处测定吸光度。空白对照吸光度记为D1，Trolox标准品吸光度记为D2。吸光度降低值（ΔD）按ΔD = D1 − D2计算。以ΔD（Y轴）对相应Trolox浓度（X轴）绘制标准曲线，回归线方程用于以待测样品的Trolox当量量化抗氧化能力（D = 0.25x + 0.04）。抗坏血酸溶于蒸馏水至1 g/l（5.68 mmol/l），高丝菌素溶于蒸馏水至1 g/l（4.90 mmol/l）。使用Trolox标准曲线推导的线性回归方程（D = 0.25x + 0.04）计算高丝菌素和抗坏血酸的Trolox当量浓度，分别得到0.52 mmol/l和0.56 mmol/l。基于这些结果，高丝菌素和抗坏血酸的TEAC值分别确定为1.29 mM和1.62 mM。
【数据】ABTS浓度：7 mM；过硫酸钾浓度：2.45 mM；ABTS+·工作液浓度：0.35 mM；Trolox标准品浓度：0.1–0.8 mmol/l；抗坏血酸浓度：1 g/l（5.68 mmol/l）；高丝菌素浓度：1 g/l（4.90 mmol/l）；标准曲线方程：D = 0.25x + 0.04；孵育温度：37°C；孵育时间：30 min；检测波长：734 nm；TEAC值：高丝菌素1.29 mM，抗坏血酸1.62 mM
研究结果
大肠杆菌中高丝菌素生物合成途径的重编程
在生物系统中，高丝菌素通过磷酸戊糖途径合成，S7P作为关键前体。S7P首先由2-表-5-表-缬氨醇合酶（EEVS）转化为2-表-5-表-缬氨醇（EEV），随后通过甲基转移酶-氧化还原酶（MT-Ox）的催化作用转化为高丝菌素（图1A）。模拟这一天然生物合成途径，招募斑马鱼来源的EEVS和MT-Ox酶编码基因，在大肠杆菌BL21（DE3）中重构高丝菌素生物合成途径。为确认高丝菌素的生物合成，对重组大肠杆菌菌株的培养上清液和细胞裂解液进行UV吸光度扫描。如图1B所示，在268 nm处观察到明显吸收峰。这一发现通过负离子模式液相色谱-质谱（LC-MS）分析进一步验证，检测到m/z 203.06的分子离子，与高丝菌素的理论分子质量一致（图1C）。
为增强高丝菌素生物合成，采用多种策略优化EEVS和MT-Ox的表达。值得注意的是，在两个基因上游同时引入Psh启动子显著提高了UV吸光度（图1D,E）。对菌株GA1–GA4的转录分析进一步揭示，菌株GA4中EEVS和MT-Ox的表达水平显著高于GA1、GA2和GA3，与其优越的生产性能一致。为在翻译水平进一步平衡MT-Ox和EEVS的表达，应用了核糖体结合位点（RBS）工程策略。为验证RBS强度对翻译效率的影响，将红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP）分别融合至MT-Ox和EEVS，以荧光强度作为翻译输出的指标。此外，使用多功能微孔板读取器对纯化的高丝菌素进行240–360 nm全波长UV-Vis扫描。在工程菌株中，GA12菌株对MT-Ox含有强RBS（AAGGAGGAAAATAT）、对EEVS含有弱RBS（TGGAGAATCGAC），表现出最显著的UV吸收信号，表明其高丝菌素生物合成效率最高（图1F,G）。
为实现高丝菌素的准确定量，制备高纯度参考标准品至关重要。因此，采用配备C18柱的半制备型高效液相色谱（pre-HPLC）分离高丝菌素（图1H）。通过优化流动相组成，在溶剂A（1%甲酸水溶液，v/v）和溶剂B（HPLC级乙腈）条件下成功收集到对应高丝菌素的单一峰，并经HPLC-MS分析确认。所得产物经分析型HPLC测定，色谱纯度为95%。冻干和称重后，建立了高丝菌素浓度与吸光度之间的校准函数（图1I）。使用该标准品对所有重组菌株进行重新定量，菌株GA12表现出最高的高丝菌素产量（45.2 mg/l）。
【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)；吸收峰：268 nm；LC-MS分子离子：m/z 203.06；强RBS序列：AAGGAGGAAAATAT（MT-Ox）；弱RBS序列：TGGAGAATCGAC（EEVS）；色谱纯度：95%；流动相：A为1%甲酸水溶液，B为HPLC级乙腈；最高产量：GA12菌株45.2 mg/l
高丝菌素高通量定量分析平台的构建
邻菲啰啉铁还原实验（PIRA）、ABTS和DPPH通常用于评估抗氧化活性，通过监测抗氧化化合物引起的试剂特异性比色变化来实现。为评估高丝菌素的抗氧化能力并实现其定量测定，系统评估了这些实验检测高丝菌素的适用性。在PIRA实验中，铁离子（Fe3+）与邻菲啰啉形成淡黄色复合物，被高丝菌素还原为亚铁离子（Fe2+），导致可见的颜色从黄色变为红色。相应的还原率根据510 nm处吸光度变化计算，反映高丝菌素将Fe3+还原为Fe2+的比例。在ABTS实验中，呈深蓝绿色的ABTS•+自由基被高丝菌素还原为无色的ABTS，导致颜色从绿色变为无色。在DPPH实验中，高丝菌素提供氢原子将DPPH•自由基还原为DPPH–H，伴随颜色从紫色变为无色（图2A）。ABTS和DPPH实验的自由基清除率分别根据734 nm（ABTS•+）和517 nm（DPPH•）处吸光度降低进行量化，代表高丝菌素清除自由基的比例。
随后，基于各显色系统的特征吸收波长——邻菲啰啉-Fe3+复合物为510 nm、ABTS•+为734 nm、DPPH•为517 nm——定量测量加入高丝菌素后吸光度的降低（图2B,C）。这些变化被转化为抗氧化能力的定量指标。在所评估的实验中，所有比色响应均表现出对高丝菌素浓度的明确依赖性。DPPH实验在吸光度降低与高丝菌素浓度之间表现出最强的线性相关性，相关系数（R²）为0.99（图2D）。通过调整试剂浓度和孵育时间进一步优化DPPH实验体系，确定0.15 mM DPPH和30 min反应时间（R² = 0.995）适用于高丝菌素的高通量定量分析。在此条件下，相关方程确定为Y（ΔA517nm）= 0.099X（高丝菌素）+ 0.2602，代表一种可靠且定量的高丝菌素比色定量方法。同时，结果证明了高丝菌素强大的抗氧化活性，1.0 g（4.9 mmol）高丝菌素表现出相当于0.8 g（4.5 mmol）抗坏血酸的抗氧化能力。
【数据】PIRA检测波长：510 nm；ABTS检测波长：734 nm；DPPH检测波长：517 nm；DPPH线性相关系数：R² = 0.99；优化后R² = 0.995；DPPH浓度：0.15 mM；反应时间：30 min；相关方程：Y = 0.099X + 0.2602；抗氧化当量：1.0 g（4.9 mmol）高丝菌素 ≈ 0.8 g（4.5 mmol）抗坏血酸
利用sRNA文库筛选鉴定高丝菌素合成调控靶点
细菌sRNA通常约50 nt长，通过直接与靶mRNA的非翻译区或编码区碱基配对，在应激反应、群体感应和毒力等条件下的基因调控中发挥关键作用，能够实现高效且多功能的转录后基因激活或抑制，相比传统调控策略具有优势。建立高丝菌素高通量定量检测方法后，构建了sRNA文库以系统筛选影响大肠杆菌高丝菌素产量的代谢靶点。具体而言，选择参与中心碳代谢以及SAM和NADH等关键辅因子生物合成途径的100个候选基因进行下调，评估其对高丝菌素生物合成的影响。据此，建立了快速构建sRNA文库的简化工作流程（图3A）。在初次筛选中，300个转化子（三次重复）在13组24孔板中培养，采用前述高通量比色法快速评估高丝菌素滴度（图3B）。随后通过HPLC分析验证了9个候选基因。
结果显示，抑制tal（转醛醇酶）、pfkA（磷酸果糖激酶A）、pgk（磷酸甘油酸激酶）、fba（果糖-二磷酸醛缩酶）、gmhA（磷酸庚糖异构酶）和pykA（丙酮酸激酶A）基因导致高丝菌素滴度显著增加，分别达到450、350、240、189、140和95 mg/l（图3C）。相比之下，抑制zwf（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）……
【数据】sRNA长度：约50 nt；候选基因数：100个；初次筛选转化子数：300个（三次重复）；培养板：13组24孔板；tal抑制产量：450 mg/l；pfkA抑制产量：350 mg/l；pgk抑制产量：240 mg/l；fba抑制产量：189 mg/l；gmhA抑制产量：140 mg/l；pykA抑制产量：95 mg/l
讨论与解读
高丝菌素作为一种具有强抗氧化和生物学特性的环己烯酮化合物，在制药、化妆品和营养保健品领域显示出重要的应用潜力。尽管高丝菌素已受到广泛关注，但其高效生物合成，尤其是利用微生物细胞工厂进行生产，仍然是一个重大挑战。原因可能在于难以制备高纯度高丝菌素标准样品，以及缺乏快速定量分析方法。本研究通过优化C18柱和流动相的制备工艺，开发了可靠的高丝菌素纯化方法，并基于其强抗氧化活性建立了高通量定量比色法。与HPLC或ESI-MS等常规分析方法相比，这种高通量定量方法提供了一种快速高效的替代方案，将加速高丝菌素生产细胞工厂的构建。值得注意的是，纳入缺乏高丝菌素生物合成途径的阴性对照组菌株对于减少非特异性信号或裂解液组分与测定试剂相互作用的干扰至关重要。此外，该方法在扩展应用于其他抗氧化物质（如花青素）的快速筛选和定量分析方面具有重要前景。
编译者解读
本研究的技术亮点在于将"标准品制备—高通量检测—全局调控—放大生产"形成完整闭环。DPPH比色法以R²=0.995的线性度替代了HPLC的繁琐流程，使数百个sRNA突变体的筛选成为可能——这是代谢工程中典型的"分析瓶颈"问题，作者用化学原理巧妙化解。sRNA文库筛选策略覆盖了中心碳代谢与辅因子途径，100个靶点的系统下调体现了合成生物学"全局扰动+表型筛选"的工程思维。5升反应器4.2 g/l的产量验证了从摇瓶到放大过程的可靠性。不过，当前菌株的多批次稳定性仍有待提升，且高丝菌素衍生物的活性保持也是后续修饰改造的关键挑战。
参考来源
Zhang P. Multidimensionally engineered Escherichia coli for efficient gadusol biosynthesis with high-throughput quantitative analysis. Trends in Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.03.013
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.03.013