来源：Reprogramming the intrinsic capsular polysaccharide biosynthesis pathway for efficient secretory production of chondroitin in Escherichia coli Nissle 1917（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
软骨素是硫酸软骨素生物合成的关键前体，在生物医药领域应用广泛，但工业发酵长期受限于其胞内积累、产量低下。本研究以天然产生类肝素的益生菌株大肠杆菌Nissle 1917（EcN）为底盘，通过系统重建β-Kdo合成途径、ABC转运蛋白模块及前体供给平衡，成功实现软骨素的分泌型生产。最终工程菌株CH42在5-L补料分批发酵中产量达5.58 g/L，其中92.3%分泌至胞外。该策略为其他多糖的分泌型生物合成提供了可借鉴的范式。
研究背景
软骨素是由葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）重复二糖单元构成的糖胺聚糖。凭借优异的生物相容性、可降解性、低免疫原性和低毒性，软骨素在药物与基因递送系统中备受关注。长链软骨素在肿瘤学、抗病毒治疗以及肿瘤靶向药物递送的生物材料或纳米载体方面展现出治疗潜力。软骨素骨架经硫酸基转移酶修饰后生成硫酸软骨素，进一步增强其结构多样性和生物活性。然而，基于动物提取或化学合成的传统生产方法受制于交叉污染风险、批次差异和工艺繁琐等瓶颈。微生物合成作为可持续、可规模化的替代方案日益受到重视。大肠杆菌Nissle 1917作为天然产生类肝素的益生菌株，具备合成软骨素所需的UDP-GlcA和UDP-N-GlcNAc内源代谢前体，是构建软骨素合成平台的理想底盘。
研究方法
2.1 质粒构建与菌株构建
本研究所用重组菌株和构建质粒列于表S1和表S2。以大肠杆菌TOP10作为质粒构建和扩增的宿主菌。以大肠杆菌Nissle 1917 ΔkfiABC作为生产软骨素的宿主菌株。
通过构建含有crRNA和同源臂的质粒pcrEG-ΔkpsU，从EcN ΔkfiABC基因组中敲除kpsU片段。随后将该质粒化学转化至携带pEcCpf1质粒的EcN ΔkfiABC细胞中。利用菌落PCR筛选转化子以排除假阳性，并送Sanger测序验证。从EcN ΔkfiABC基因组中敲除kpsC、kpsS、kpsM和kpsT片段，以及将荧光蛋白片段敲入EcN ΔkfiABC基因组的方法均与EcN ΔkpsU的敲除方法相同。强启动子片段设计自本实验室，去除负反馈调节的glmS突变体（glmS E14K, D386V, S449P, E524G）敲入EcN ΔkfiABCΔkpsCS基因组的方法与EcN ΔkpsU相同。引物由Genewiz（中国苏州）合成，序列列于表S3。所有质粒构建的遗传操作均按照标准方案进行。
软骨素生物合成途径基因构建于质粒pRSF-kfoCA中。使用引物kfoC-F/R和kfoA-F/R分别从大肠杆菌K4基因组扩增kfoC和kfoA基因，并将含有核糖体结合位点（RBS，AAGGAGCGTATATC）的P tacO启动子表达盒通过碧云天无缝克隆试剂盒连接至表达载体pRSF-P tacO中。为探究限制重组EcN ΔkfiABC菌株中软骨素转运的关键因子，分别从大肠杆菌K4基因组扩增转运蛋白基因kpsU、kpsC、kpsS、kpsM和kpsT，并分别构建于pETDuet质粒中。重组质粒pET-kpsU K4、pET-kpsC K4、pET-kpsS K4、pET-kpsM K4和pET-kpsT K4的构建方法与pRSF-kfoCA相同。
为从头合成软骨素β-Kdo途径，将来自大肠杆菌K4的两个关键β-Kdo生物合成基因kpsS和kpsC克隆并组合至载体pRSF-kfoCA中，使用无缝克隆试剂盒组装获得质粒pRSF-kfoCA-kpsS K4 C K4。考虑到EcN中的KfiB参与类肝素生物合成过程中的转运，以相同方式将来自大肠杆菌K4的KfoB构建至质粒pRSF-kfoCA-kpsS K4 C K4中，获得质粒pRSF-kfoCAB-kpsS K4 C K4。区域III中ABC转运蛋白包含来自大肠杆菌K4的kpsT和kpsM两个基因，由天霖公司（中国无锡）合成并同时克隆至pETDuet-1质粒中，分别获得质粒pET-kpsT K4、pET-kpsM K4和pET-kpsT K4 M K4。类似地，区域I中参与软骨素从周质空间转运至胞外的另一组基因kpsE和kpsD分别选自大肠杆菌K1、大肠杆菌K5、大肠杆菌BL21和EcN，由天霖公司合成并同时克隆至pET-kpsT K4 M K4质粒中，分别获得质粒pET-kpsT K4 M K4 E K1、pET-kpsT K4 M K4 E K5、pET-kpsT K4 M K4 E BL、pET-kpsT K4 M K4 E Ec、pET-kpsT K4 M K4 D K1、pET-kpsT K4 M K4 D K5、pET-kpsT K4 M K4 D BL和pET-kpsT K4 M K4 D Ec。
为增加前体UDP-GlcA和UDP-GalNAc的代谢通量，将前期研究设计的软骨素途径基因galU-kfiD-glmM从质粒pERCS-bsgalU-eckfiD-ecglmM中克隆并构建至质粒pET-kpsT K4 M K4 E Ec中，获得质粒pET-kpsT K4 M K4 E Ec-bsgalU-eckfiD-ecglmM。使用特异性引物对pMUT1-spcR质粒进行改造以构建壮观霉素抗性基因。随后将glmS突变体（glmS E14KD386VS449PE524G）构建至质粒pMUT1-spcR中，通过转化导入菌株CH20，构建获得菌株CH26。
【数据】宿主菌：E. coli TOP10（质粒构建）、EcN ΔkfiABC（软骨素生产）；引物合成：Genewiz（苏州）；无缝克隆试剂盒：碧云天；基因合成：天霖公司（无锡）；RBS序列：AAGGAGCGTATATC
2.2 培养基、培养条件与试剂
所有克隆宿主菌均在Luria-Bertani（LB）培养基中培养，配方为5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl和10 g/L胰蛋白胨，37°C、220 rpm振荡培养。
摇瓶软骨素生产采用改良葡萄糖复合培养基，配方为：10.0 g/L葡萄糖、13.5 g/L KH₂PO₄、4.0 g/L (NH₄)₂PO₄、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O、1.7 g/L柠檬酸、0.1 g/L硫胺素、6.0 g/L酵母提取物、4 g/L胰蛋白胨，每升补充10 mL微量元素溶液。微量元素溶液含10.0 g/L FeSO₄·7H₂O、2.0 g/L CaCl₂、2.2 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.5 g/L MnSO₄·4H₂O、1.0 g/L CuSO₄·5H₂O、0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.02 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O，溶于1 L 5 M HCl中并调pH至7.0。
重组EcN菌株及其衍生菌株用于软骨素生产。转化菌株在含50 mg/L卡那霉素、100 mg/L氨苄青霉素或50 mg/L壮观霉素的LB琼脂平板上选择性培养以维持选择压力。为诱导质粒携带基因的表达，向培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.2 mM。
种子培养基制备：在50 mL离心管中接种5 mL LB培养基，37°C、220 rpm振荡培养8–10小时。随后将重组菌株以初始OD₆₀₀为0.1接种至250 mL锥形瓶中的30 mL葡萄糖复合培养基中，37°C、220 rpm振荡培养。当OD₆₀₀达到1.0–1.5范围时，加入0.2 mM IPTG诱导表达。
放大培养采用3-L发酵罐（T&J Bio-engineering，中国），装入1.5 L葡萄糖复合培养基，添加50 mg/L卡那霉素、100 mg/L氨苄青霉素和50 mg/L壮观霉素用于重组EcN菌株的软骨素生产。种子培养物在Terrific Broth（TB，11.8 g/L蛋白胨、23.6 g/L酵母提取物、5 g/L甘油、2.3 g/L KH₂PO₄、9.4 g/L K₂HPO₄）中添加10 g/L葡萄糖培养，以10%（v/v）接种量转移至初始发酵培养基。发酵在37°C、1000 rpm、通气量1.8 vvm条件下进行72小时。通过调节搅拌速度在200 rpm至1000 rpm之间维持溶氧水平高于30%。当细胞生长达到稳定期后，以20 mL/h的速率连续补加含15 g/L酵母提取物和600 g/L葡萄糖的补料溶液。整个发酵过程中，用50%（v/v）氨水维持pH在7.0 ± 0.2。当培养物OD₆₀₀达到27.65时，加入0.2 mM IPTG诱导软骨素生物合成。
细菌基因组DNA使用基因组DNA提取试剂盒（生工生物，上海）提取。DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA, USA）。PCR扩增使用PrimeStar HS DNA聚合酶（Takara Biomedical Technology，北京）和Phata max master mix（Vazyme，南京）。菌落PCR所用Taq DNA聚合酶购自Vazyme（南京）。无缝克隆试剂盒和DNA寡核苷酸退火缓冲液购自碧云天生物技术（上海）。寡核苷酸由天霖公司（无锡）合成。除非另有说明，本研究所用化学品均购自生工生物（上海）。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨；培养温度：37°C；转速：220 rpm；IPTG浓度：0.2 mM；发酵罐体积：3-L；装液量：1.5 L；接种量：10%（v/v）；转速：1000 rpm；通气量：1.8 vvm；发酵时间：72 h；补料速率：20 mL/h；pH：7.0 ± 0.2；诱导OD₆₀₀：27.65
2.3 EcN的基因组编辑与重组工程
所有基因敲入操作均使用质粒pEcCpf1和pceEG。软骨素合酶基因簇kfoCAB从大肠杆菌K4基因组扩增并克隆至pceEG质粒中，该质粒含有同源重组序列和多重编辑元件。
【数据】基因组编辑工具：pEcCpf1和pceEG质粒系统；基因簇来源：大肠杆菌K4基因组
研究结果
3.1 重塑益生菌大肠杆菌Nissle 1917细胞工厂用于异源软骨素生产
EcN作为一种遗传背景清晰、安全性优良的益生菌株，含有内源代谢前体UDP-GlcA和UDP-N-GlcNAc。因此，仅需异源表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶（kfoA）和双功能软骨素聚合酶（kfoC）即可实现软骨素生物合成（图1b）。
为消除内源类肝素合成机制的干扰，并为评估工程化软骨素合成和输出模块提供干净的背景，首先将负责类肝素生物合成的内源kfiABC基因簇替换为来自大肠杆菌K4的kfoCA软骨素合酶基因簇，构建重组菌株EcN ΔkfiABC::kfoCA（CH1）（图2a）。该菌株中检测到痕量软骨素（0.05 g/L），并通过定量分析确认了胞内积累（图2b）。
为进一步提高软骨素产量，在EcN ΔkfiABC中上调kfoCA表达，使胞内软骨素效价明显增加，菌株EcN ΔkfiABC/kfoCA（CH2）达到0.13 g/L（图2b）。上述结果表明，在适当改造后，EcN可作为安全有效的异源软骨素生物合成平台。
基于前期工作——共表达bsgalU-eckfiD-ecglmM同时优化UDP-糖途径可显著提高类肝素效价——将相同的代谢增强模块导入EcN ΔkfiABC/kfoCA以增加前体供给。尽管胞内软骨素效价达到0.21 g/L，但所得菌株EcN ΔkfiABC/kfoCA/bsgalU-eckfiD-ecglmM（CH3）生长严重受损（OD₆₀₀ = 8.04）（图2b）。
具体而言，通过HPLC-MS/MS分析所合成软骨素的同一性（图S3），其特征谱图与二糖[Δ4,5-GlcA-O-GalNAc]⁻的谱图一致，与前期研究报道相符。为进一步区分软骨素与类肝素，以EcN ΔkfiABC/kfoCA产生的软骨素和野生型EcN产生的类肝素为底物，在相同条件下进行软骨素硫酸基转移酶催化的硫酸化测定（图2c）。与类肝素不同，软骨素样品成功被硫酸化，基于二糖组成分析硫酸化程度达78.4%（表S4），证实了工程化软骨素产物的结构和功能特异性。
同时，相差（PH）显微镜和透射电子显微镜（TEM）成像显示，CH2和CH3中软骨素在胞内和荚膜区域大量积累，远超EcN（图2d）。CH3表现出严重的细胞变形，表明分泌不足导致胞内过度积累，损害了膜完整性并扰乱细胞稳态，最终削弱菌株稳健性。综上所述，在高度工程化的EcN底盘中，流向软骨素生物合成的代谢通量可能超过细胞内在耐受能力，导致产物积累与细胞活力之间的权衡。
【数据】CH1胞内软骨素：0.05 g/L；CH2胞内软骨素：0.13 g/L；CH3胞内软骨素：0.21 g/L；CH3 OD₆₀₀：8.04；硫酸化程度：78.4%；CH2/CH3胞内积累：TEM证实大量积累
3.2 重建荚膜多糖输出机制实现工程EcN中β-Kdo依赖的软骨素分泌
EcN拥有功能性β-Kdo生物合成途径和天然多糖转运系统，能够合成并分泌类肝素，但无法分泌软骨素（图2）。相比之下，大肠杆菌K4尽管具有与EcN同源的荚膜簇基因元件，却能天然合成并分泌软骨素。
为揭示这一差异背后的遗传决定因素，对大肠杆菌K4进行了全基因组测序。与EcN的比较基因组分析显示，大肠杆菌K4缺乏kpsF、kpsE和kpsD基因（图3a），这些基因被认为是经典ABC转运子介导的荚膜多糖输出系统的必需组分，但对软骨素输出显然并非必需（图S4）。
基于这一观察，在工程菌株CH2中系统性地重建输出机制，分别将kpsU、kpsC、kpsS、kpsM和kpsT替换为来自大肠杆菌K4的同源基因。值得注意的是，在菌株EcN ΔkfiABCΔkpsC/kfoCA-kpsC K4（CH5，胞外软骨素0.08 g/L）和EcN ΔkfiABCΔkpsS/kfoCA-kpsS K4（CH6，胞外软骨素0.06 g/L）中同时检测到胞外和胞内软骨素，而EcN ΔkfiABCΔkpsU/kfoCA-kpsU K4（CH4）、EcN ΔkfiABCΔkpsM/kfoCA-kpsM K4（CH7）和EcN ΔkfiABCΔkpsT/kfoCA-kpsT K4（CH8）中未观察到胞外软骨素（图3b）。
PH显微镜观察显示，CH4、CH7和CH8细胞中部出现边界清晰的亮区，而CH5细胞仅在一侧出现（图3c）。分泌型软骨素二糖的同一性通过FTIR（图3d）和HPLC-MS/MS分析（图3e）确认，检测到HN-C=O（1608.52 cm⁻¹）、H-C-H（2427.82 cm⁻¹）、OH（3430.72 cm⁻¹）基团的特征峰，以及m/z 378.11的[M-H]⁻离子。
上述结果表明kpsC和kpsS是高效软骨素输出的关键决定因素。KpsC和KpsS均为保留型3-脱氧-D-甘露-辛-2-ulosonic acid（Kdo）转移酶，在荚膜多糖生物合成过程中催化末端脂质载体上Kdo连接子的合成。这些酶介导β-Kdo残基的转移，其数量和结构变异在不同细菌物种间差异显著（图3f）。
为研究EcN来源的KpsC和KpsS无法介导软骨素输出是否归因于β-Kdo依赖的多糖特异性，分别构建菌株CH9和CH10以表达来自大肠杆菌K1（O18:K1:H7）的KpsC和KpsS。两菌株中均仅积累胞内软骨素（图3g），证实β-Kdo残基是多种荚膜多糖共有的保守决定因素。
在成功单独表达kpsC K4和kpsS K4后，进一步评估其共表达以增加β-Kdo连接子的可用性。在三种不同表达组合的工程菌株（CH11~CH13）中，双表达菌株CH13（EcN ΔkfiABCΔkpsCkpsS/kfoCA-kpsC K4 S K4）获得最高软骨素效价，产生0.12 g/L胞外软骨素和0.09 g/L胞内软骨素，分泌率为57.14%（图3g）。相比之下，CH11和CH12分别仅分泌0.07 g/L和0.09 g/L，突显kpsC和kpsS的协调表达对高效分泌至关重要。因此推测KpsC和KpsS聚合的β-Kdo残基数量在不同荚膜多糖中可能是保守的。
尽管β-Kdo连接子形成有所改善，但分泌失衡表明可能还需要其他因素来完全耦联聚合与输出。KfiB被鉴定为协调聚合与输出的关键因子。KfoB与KfiB具有38%的序列同一性和结构相似性，推测其在E. coli K4的软骨素生物合成和分泌中发挥类似作用。为验证这一假设，将kfoB导入CH13构建CH14。该修饰适度提高了软骨素产量，效价从0.21 g/L增至0.23 g/L（图3g），表明聚合-输出协调得到部分增强。然而，持续存在的失衡凸显了软骨素输出是当前菌株配置中的主要瓶颈。
【数据】CH5胞外软骨素：0.08 g/L；CH6胞外软骨素：0.06 g/L；FTIR特征峰：1608.52 cm⁻¹（HN-C=O）、2427.82 cm⁻¹（H-C-H）、3430.72 cm⁻¹（OH）；MS/MS：[M-H]⁻ m/z 378.11；CH13胞外软骨素：0.12 g/L；CH13胞内软骨素：0.09 g/L；CH13分泌率：57.14%；CH11分泌量：0.07 g/L；CH12分泌量：0.09 g/L；CH14总效价：0.23 g/L
3.3 β-Kdo聚合与转运模块的协调优化增强软骨素分泌
在CH14基础上，进一步对β-Kdo聚合和转运模块进行系统优化。考虑到ABC转运蛋白各组分间的协同作用，将来自不同菌株来源的kpsE和kpsD基因与kpsT K4 M K4组合表达，筛选最佳转运模块组合。结果显示，来自EcN的kpsE和kpsD与kpsT K4 M K4的组合（CH15系列）在胞外软骨素分泌方面表现最优。
通过共表达来自大肠杆菌K4的kpsT和kpsM（ABC转运蛋白的ATP结合域和跨膜域），并组合来自EcN的kpsE和kpsD（周质空间至胞外的输出组件），构建了完整的软骨素输出途径。与此同时，将前体供给模块bsgalU-eckfiD-ecglmM整合至该转运模块中，获得菌株CH20。该菌株在摇瓶培养中实现了软骨素分泌的显著提升。
进一步通过引入glmS突变体（glmS E14KD386VS449PE524G）解除氨基糖生物合成的反馈抑制，构建菌株CH26。该菌株在摇瓶培养中软骨素产量进一步提升。
【数据】CH20摇瓶产量：原文未详述；CH26摇瓶产量：原文未详述
3.4 KfoC的理性设计与定向进化增强聚合效率
为提升软骨素聚合酶的催化效率，对KfoC进行了结构分析和突变设计。通过表面展示分析确定了KfoC中潜在的突变位点（图6a），并构建了一系列KfoC突变体。在摇瓶培养中评估不同突变体对软骨素合成的影响（图6b），其中Y475S和H482Y双突变体（KfoC T475S/H482Y）表现出最佳的聚合效率提升效果。
将KfoC T475S/H482Y突变体整合至CH26菌株中，构建菌株CH42。该菌株在摇瓶培养中软骨素产量达0.43 g/L。分子动力学模拟分析（RMSF和RMSD）揭示了突变体结构动态性的变化，为理解突变增强聚合效率的分子机制提供了结构基础。
【数据】CH42摇瓶产量：0.43 g/L；KfoC突变体：Y475S/H482Y
3.5 5-L发酵罐补料分批发酵生产软骨素
将优化后的工程菌株CH42（EcN ΔkfiABCΔkpsCkpsS/kfoC Y475S/H482Y AB-kpsC K4 S K4/kpsT K4 M K4 E Ec/bsgalU-eckfiD-ecglmM）在5-L发酵罐中进行补料分批发酵。通过协调优化软骨素生物合成、β-Kdo聚合途径和ABC转运蛋白系统，CH42在5-L补料分批发酵中产生了5.58 g/L软骨素，其中92.3%分泌至培养基中。
【数据】CH42总产量：5.58 g/L；分泌比例：92.3%；发酵规模：5-L补料分批
讨论与解读
本研究将生物安全益生菌株EcN系统性地工程化为软骨素生物合成和分泌的稳健底盘。通过增加拷贝数调控软骨素合酶的表达显著增强了软骨素生物合成。在EcN ΔkfiABC中表达软骨素合酶基因簇kfoCA实现了软骨素的胞内积累，但合成与输出机制之间明显失衡。KpsC和KpsS是CPS组装系统中负责在末端脂质锚上合成β-Kdo连接子的两个保守组分，不同产CPS菌株中β-Kdo残基数量存在差异，反映了脂化结构的多样性。引入E. coli K4来源的KpsC K4和KpsS K4后，在CH2菌株中恢复了β-Kdo连接子的生物合成，显著改善了软骨素分泌，强调了β-Kdo部分在介导多糖转运中的保守且必需的功能。这种变异表明β-Kdo连接子长度可能适应特定的多糖骨架。最终通过系统协调β-Kdo聚合与转运模块、前体供给和聚合酶活性，实现了软骨素的高效分泌生产。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将"合成-聚合-转运"视为一个完整系统而非孤立模块——从全基因组比较分析定位β-Kdo和ABC转运蛋白为瓶颈，到逐步重建输出途径，逻辑链条清晰完整。KfoC的理性设计与定向进化结合分子动力学模拟，展示了计算辅助酶工程在多糖合成中的应用潜力。然而，5.58 g/L的产量距工业化仍有距离，且92.3%的分泌率虽高但绝对产量仍受限于菌株耐受性。该策略框架对透明质酸、肝素等其他荚膜多糖的分泌型生产具有直接迁移价值。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.175481
DOI: 10.1016/j.cej.2026.175481