来源：Systematic engineering of Escherichia coli for high-yield production of L-cysteine（Chinese Journal of Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-半胱氨酸是重要的含硫氨基酸，在食品、饲料、化妆品和制药行业应用广泛，但微生物高效生产仍受前体供应不足、还原力缺乏、产物毒性及碳源利用不充分等因素制约。本研究在大肠杆菌中系统整合了蛋白质工程、辅因子循环、代谢拉力强化和产物外排工程四大策略，最终工程菌株在摇瓶发酵中产量达9.04 g·L⁻¹，在5 L生物反应器补料分批发酵中产量达33.66 g·L⁻¹。研究亮点在于半理性改造PGDH实现NADH/NADPH双辅因子特异性，以及揭示“平衡的NADPH再生优于过度强化”这一关键规律。
研究背景
硫在元素丰度上虽低于碳和氮，却是生命活动不可或缺的元素，在细胞代谢中处于核心地位。L-半胱氨酸不仅是蛋白质的组成构件，还是一种高反应活性代谢物，参与蛋白质折叠、氧化还原调控和酶催化等过程。此外，它还是辅酶A、生物素、铁硫簇和硫胺素等必需辅因子生物合成的主要硫供体。目前工业上L-半胱氨酸的生产主要依赖人发或动物羽毛的角蛋白水解法，以及石油衍生前体的酶转化法，但这些工艺会排放大量有毒气体和废水，引发严重的环境和可持续性问题。近年来，多种代谢工程策略被用于提升微生物法生产L-半胱氨酸的效率，但前体供应受限、还原力不足、胞内产物毒性以及碳源利用效率低下等问题仍待解决。
研究方法
2.1 引物、质粒与菌株
本研究所用寡核苷酸由上海赛恒生物科技有限公司合成，列于表S1。所用质粒和菌株汇总于表S2，启动子序列列于表S3。L-半胱氨酸生产底盘菌株来源于本实验室前期通过高通量筛选平台获得的菌株[26]。大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)分别用于质粒构建和蛋白表达。必要时，LB培养基中添加100 mg·L⁻¹安普霉素硫酸盐或50 mg·L⁻¹卡那霉素，培养温度为37 °C。
【数据】抗生素：100 mg·L⁻¹安普霉素硫酸盐/50 mg·L⁻¹卡那霉素；温度：37°C
2.2 DNA操作
底盘菌株中的基因缺失和基因组整合采用基于CRISPR/Cas9的双质粒编辑系统（pGRB和pRedCas9）完成，操作方法同前[27]。向导RNA序列通过引物对pGRB-gene F/pGRB-gene R引入pGRB。pACYC184、pET20b和pTrc99a用于PGDH的基因表达和蛋白纯化。重组质粒采用Golden Gate方法组装，操作流程参照已报道方法[28]。所有构建的质粒和供体DNA均由上海赛恒生物科技有限公司进行DNA测序验证。
构建PGDH表达质粒时，编码PGDH的天然serA基因以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，使用引物对20b serA F/20b serA R扩增；pET20b载体骨架以引物对Vec PET 20b F/Vec PET 20b R扩增。扩增的serA片段组装至pET20b骨架，获得质粒pET20b-S。PGDH变体随后以pET20b-S为模板，配合相应的定点突变引物通过PCR生成。
构建L-半胱氨酸外排蛋白质粒时，外膜外排蛋白基因tolC及内膜外排蛋白基因ydeD、yfiK、bcr和cydDC分别从大肠杆菌BW25113基因组DNA扩增。pLH骨架以本实验室前期构建的质粒为模板，使用引物对PLHT F/PLHT R扩增[26]。扩增的tolC片段先组装至pLH骨架生成质粒pLHT。随后，ydeD、yfiK、bcr和cydCD分别插入pLHT，生成质粒pLHTD、pLHTK、pLHTB和pLHTC。
【数据】宿主菌：E. coli BW25113（模板）；载体：pET20b、pLH；组装方法：Golden Gate；验证：DNA测序
2.3 PGDH变体的表达与纯化
培养条件和蛋白纯化流程参照本实验室前期研究[29]。携带PGDH变体表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)先在含100 μg·ml⁻¹氨苄青霉素的LB培养基中培养8 h。随后，1 ml种子培养液转接至100 ml新鲜LB培养基。当培养物OD600达到0.6–0.8时，加入IPTG至终浓度0.1 mmol·L⁻¹诱导蛋白表达，随后在18 °C下过夜培养进行蛋白表达。细胞在6500 r·min⁻¹、4 °C条件下离心8 min收集，洗涤后重悬于含10 mmol·L⁻¹咪唑的20 mmol·L⁻¹ Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中。细胞破碎采用高压匀浆机（上海力途机械设备工程有限公司，中国）[30]。裂解液在8000 r·min⁻¹、4 °C离心30 min，收集上清液作为粗酶液。PGDH变体经Ni-螯合亲和层析纯化。非特异性结合蛋白用含60、80和100 mmol·L⁻¹咪唑的20 mmol·L⁻¹ Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗除，目标蛋白用含150 mmol·L⁻¹咪唑的相同缓冲液洗脱。洗脱组分用10 kDa截留分子量的蛋白浓缩超滤管脱盐和浓缩。蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒（天根，中国）测定。
【数据】诱导剂：IPTG 0.1 mmol·L⁻¹；诱导温度：18°C（过夜）；离心：6500 r·min⁻¹/4°C/8 min（收菌），8000 r·min⁻¹/4°C/30 min（裂解液）；缓冲液：20 mmol·L⁻¹ Tris-HCl pH 8.0；咪唑梯度：10/60/80/100/150 mmol·L⁻¹；超滤截留：10 kDa
2.4 PGDH变体构建与酶活测定
PGDH的定点突变在PCR扩增过程中通过携带目标突变的引物引入。携带不同PGDH变体的质粒分别通过氯化钙法转化至大肠杆菌BL21(DE3)，突变蛋白的表达和纯化按2.3节所述方法进行。PGDH活性通过监测30 °C反应30 min后NADH荧光（激发340 nm/发射460 nm）的变化来测定[31]。为避免PGDH的产物抑制，反应体系中加入PSAT。1 ml反应混合物含Tris-HCl缓冲液（50 mmol·L⁻¹ Tris，pH 8.5，1 mmol·L⁻¹ EDTA）、240 μmol·L⁻¹ 3-PG、30 mmol·L⁻¹谷氨酸、100 ng·μl⁻¹ PSAT和6 ng·μl⁻¹ PGDH。PGDH以NAD⁺为辅因子的动力学分析中，NAD⁺浓度从0.01 mmol·L⁻¹变化至7 mmol·L⁻¹。PGDH以NADP⁺为辅因子的动力学分析中，NADP⁺浓度从0.01 mmol·L⁻¹变化至7 mmol·L⁻¹。
【数据】反应温度：30°C；反应时间：30 min；荧光检测：Ex 340 nm/Em 460 nm；3-PG：240 μmol·L⁻¹；谷氨酸：30 mmol·L⁻¹；PSAT：100 ng·μl⁻¹；PGDH：6 ng·μl⁻¹；NAD⁺/NADP⁺浓度范围：0.01–7 mmol·L⁻¹
2.5 结构建模与分子对接
野生型PGDH及其变体的结构使用AlphaFold Server预测[32]。每个蛋白的氨基酸序列单独提交，随后进行结构可靠性验证（https://saves.mbi.ucla.edu/）。预测模型在PyMOL 2.4中进一步处理和可视化。为研究辅因子结合，使用AutoDock Vina进行分子对接[33]。对接前，预测的蛋白结构通过去除溶剂分子和添加极性氢进行准备。辅因子分子（包括NAD⁺、NADP⁺）分别制备并进行能量最小化。对接盒子以PGDH的预测辅因子结合口袋为中心。随后使用AutoDock Vina进行对接模拟，选择亲和能最低的结合构象作为代表性构象。PGDH变体与辅因子之间的相互作用使用PyMOL 2.4分析。
【数据】建模工具：AlphaFold Server；对接工具：AutoDock Vina；可视化：PyMOL 2.4
2.6 摇瓶及5 L生物反应器分批发酵
L-半胱氨酸生产的发酵条件在本实验室前期研究基础上进行了修改。为评估工程菌株的L-半胱氨酸生产能力，工程菌株接种至SM1培养基，在220 r·min⁻¹、30 °C条件下培养72 h。SM1培养基含7.5 g·L⁻¹ Na₂HPO₄、3 g·L⁻¹ KH₂PO₄、8 g·L⁻¹葡萄糖、36 g·L⁻¹甘油、5 g·L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、8 g·L⁻¹ (NH₄)₂S₂O₃、1 g·L⁻¹ Na₃柠檬酸、0.3 g·L⁻¹ MgSO₄、0.015 g·L⁻¹ CaCl₂、2 mg·L⁻¹ FeSO₄、5 mg·L⁻¹ VB1、100 mg·L⁻¹安普霉素硫酸盐、50 mg·L⁻¹卡那霉素和1 ml TE铁溶液（表S4）。
摇瓶发酵时，工程菌株接种至25 ml LB培养基，30 °C培养12 h。种子培养液随后以2%接种量转接至25 ml SM1培养基，在220 r·min⁻¹、30 °C条件下培养72 h。发酵实验设三次重复。
5 L生物反应器分批发酵时，工程菌株接种至100 ml LB培养基，30 °C培养12 h。种子培养液随后以10%接种量转接至含2 L发酵培养基的5 L生物反应器中进行补料分批培养。发酵温度维持在30 °C，pH控制在7.0。初始碳源耗尽后，采用DO-stat策略补加葡萄糖或甘油，维持溶氧（DO）水平在10%–50%之间，同时保持残余碳源浓度低于1 g·L⁻¹。与此同时，硫代硫酸铵以15 ml·h⁻¹的恒定流速持续补加至发酵结束。定期收集发酵液样品，分析产物浓度、碳源含量和600 nm处光密度（OD600）。
【数据】摇瓶：SM1培养基、220 r·min⁻¹、30°C、72 h、接种量2%；5 L反应器：装液量2 L、接种量10%、温度30°C、pH 7.0、DO 10%–50%、残余碳源<1 g·L⁻¹、硫代硫酸铵流速15 ml·h⁻¹
2.7 分析方法
细胞生长通过监测600 nm处光密度（OD600）进行测定。
【数据】检测波长：600 nm
研究结果
3.1 葡萄糖/甘油组合对L-半胱氨酸生产的影响
甘油能量密度相对较低，作为唯一碳源时常导致碳利用效率低下，从而限制细胞生长和发酵性能。葡萄糖和甘油的共利用已被广泛用于提升多种高价值产品的生物合成，如丙酸、1,3-丙二醇和N-乙酰氨基葡萄糖[35]。为评估甘油基条件下添加葡萄糖对L-半胱氨酸生产的影响，使用最优生产菌株（由本实验室前期建立的高通量筛选平台鉴定，用于表达L-半胱氨酸生物合成途径关键基因）在不同葡萄糖浓度（0、4、8、12、16和20 g·L⁻¹）的培养基中进行摇瓶发酵。结果如图2所示。
如图2所示，葡萄糖添加显著影响生物量积累和L-半胱氨酸产量。随着葡萄糖浓度增加，细胞生长和L-半胱氨酸滴度均呈钟形趋势，先升后降。8 g·L⁻¹葡萄糖时获得最高生物量和L-半胱氨酸滴度，48 h时OD600达19.49±0.10，L-半胱氨酸达1.28±0.07 g·L⁻¹（图2(a)）。葡萄糖浓度增至12 g·L⁻¹时，生物量和L-半胱氨酸产量略有下降，分别为17.17±0.06和1.20±0.11 g·L⁻¹。进一步增至16 g·L⁻¹葡萄糖时下降更为明显，生物量和L-半胱氨酸滴度分别降至16.58±0.06和0.95±0.02 g·L⁻¹。在20 g·L⁻¹葡萄糖条件下，菌株BWcys0的生物量和L-半胱氨酸产量最低，OD600仅为11.76±0.21，滴度为0.87±0.11 g·L⁻¹（图2(b)）。此外，24 h后OD600几乎保持不变，表明该条件下细胞生长已被严重抑制。
高葡萄糖浓度下性能下降可能与过度溢流代谢有关。虽然培养pH用NaOH调节，但整个培养过程中发酵液仍维持在相对较低的pH值（图S1）。这一观察表明，过量葡萄糖加速了碳分解代谢并促进乙酸积累，从而损害细胞生长和L-半胱氨酸生物合成。低葡萄糖条件下，发酵早期生物量积累缓慢，24 h时OD600仅达10.92±0.20，36 h时仅小幅增至11.65±0.15。相比之下，最优条件下同一时间点OD600已达到15.70±0.12（图2(a)）。这一结果可能归因于甘油能量密度低，其碳同化速率较慢，不利于快速生物量形成。
上述结果表明，在葡萄糖/甘油共发酵过程中，需要适当的葡萄糖供应来平衡生物量形成和产物合成。补充8 g·L⁻¹葡萄糖既为快速细胞生长提供了充足能量，又避免了过量葡萄糖分解代谢的不利影响，从而将更多代谢通量导向L-半胱氨酸生物合成。因此，后续实验选择8 g·L⁻¹葡萄糖。
【数据】最佳葡萄糖浓度：8 g·L⁻¹；OD600：19.49±0.10（48 h）；L-半胱氨酸滴度：1.28±0.07 g·L⁻¹（48 h）；12 g·L⁻¹时：OD600 17.17±0.06、滴度1.20±0.11 g·L⁻¹；16 g·L⁻¹时：OD600 16.58±0.06、滴度0.95±0.02 g·L⁻¹；20 g·L⁻¹时：OD600 11.76±0.21、滴度0.87±0.11 g·L⁻¹；低糖组24 h OD600：10.92±0.20；低糖组36 h OD600：11.65±0.15；最优组同时间点OD600：15.70±0.12
3.2 工程改造PGDH实现NADH/NADPH双辅因子特异性
在大肠杆菌中，L-半胱氨酸生物合成途径以3-磷酸甘油酸（3-PG）为前体，涉及6步连续反应[5]。该合成途径中，PGDH的酶活受L-丝氨酸反馈抑制，SAT的酶活受终产物L-半胱氨酸反馈抑制[10]。因此，它们被鉴定为该合成途径中的两个限速步骤。L-半胱氨酸作为含硫氨基酸，其在大肠杆菌中的合成需要从环境中摄取和利用无机硫源。无机硫源的摄取和利用可通过CysPUWA和CysUWA/Sbp膜转运蛋白分别从环境中摄取S₂O₃²⁻和SO₄²⁻来实现[36]。当SO₄²⁻作为硫供体时，每产生1 mol·L⁻¹ L-半胱氨酸消耗4 mol·L⁻¹ NADPH；而当S₂O₃²⁻作为硫供体时，每产生1 mol·L⁻¹ L-半胱氨酸消耗1 mol·L⁻¹ NADPH，同时产生1 mol·L⁻¹ SO₃²⁻，利用该SO₃²⁻生产L-半胱氨酸还需消耗3 mol·L⁻¹ NADPH。
PGDH是L-半胱氨酸合成途径中的第一个限速酶，在催化过程中产生NADH（图3(a)）。因此，如果能够将抗丝氨酸反馈抑制的变体改造成具有增强活性和双辅因子特异性，不仅能解决途径酶活性低的问题，还能解决L-半胱氨酸合成过程中辅因子缺乏的问题。要获得对NAD⁺和NADP⁺均具有双辅因子特异性的PGDH变体，需要解决两个问题，即空间位阻和静电有利条件。基于PGDH表面结构分析发现，I182和E183可能参与形成靠近2'-磷酸的辅因子结合口袋，可能是NADP⁺激活的候选位点。为缓解NADP⁺2'-磷酸基团的空间位阻，在抗L-丝氨酸反馈抑制的变体PGDH^H344A/N346A（定义为野生型）基础上，将182位I突变为S，获得变体PGDH^I182S（图3(b)）。酶活测定结果显示，所得变体具有生成NADPH的能力。然而，其对NADP⁺的特异性常数（k_cat·Km⁻¹）仅为3.519（表1）。值得注意的是，该变体在NAD⁺条件下的酶活比野生型提高了6.54倍。
为进一步获得有利于2'-磷酸结合的静电条件，将183E分别突变为带正电荷的K、H和R，获得变体PGDH^I182S/E183K、PGDH^I182S/E183H和PGDH^I182S/E183R。结果表明，所有获得的变体均检测到生成NADPH的能力，其中PGDH^I182S/E183K对NADP⁺的酶活和k_cat·Km⁻¹值分别比PGDH^I182S提高了10.14倍和47.22倍。相比之下，变体PGDH^I182S/E183H和PGDH^I182S/E183R对NADP⁺的酶活仅比PGDH^I182S提高了2.81倍和2.46倍，k_cat·Km⁻¹值提高了4.60倍和9.53倍（表1）。然而，所得变体PGDH^I182S/E183H和PGDH^I182S/E183R对NAD⁺的酶活低于PGDH^I182S，只有PGDH^I182S/E183K变体对NAD⁺的酶活高于PGDH^I182S变体（图S2）。总之，正电荷条件对于NADP⁺结合是必要的，特别是对于2'-磷酸的稳定和空间位点的抵抗。
为阐明变体PGDH^I182S/E183K与NADPH的结合模式，使用AutoDockVina对变体PGDH^I182S/E183K进行同源建模并将NADPH分子对接至变体PGDH^I182S/E183K中。对接结果显示，NADPH中的2'-磷酸基团可与残基183K和185K形成离子相互作用（图3(c)、(d)），与残基238A形成氢键，与残基240R形成离子相互作用；此外，NADPH中的吡啶环与残基292H中的咪唑环形成π-π相互作用力，这些相互作用有助于蛋白局部结构与NADPH之间的结合和稳定（图S3）。在表面模型中，变体PGDH^I182S/E183K的结合口袋能更好地容纳NADH或NADPH分子，残基182S减少了配体NAD⁺或NADP⁺分子进入蛋白结合口袋的空间位阻（图S4）。NADH或NADPH与变体PGDH^I182S/E183K的结合能低于与野生型PGDH的结合能。
【数据】PGDH^I182S对NADP⁺的k_cat·Km⁻¹：3.519；PGDH^I182S在NAD⁺条件下酶活：比野生型提高6.54倍；PGDH^I182S/E183K对NADP⁺酶活：比PGDH^I182S提高10.14倍；PGDH^I182S/E183K对NADP⁺的k_cat·Km⁻¹：比PGDH^I182S提高47.22倍；PGDH^I182S/E183H对NADP⁺酶活：提高2.81倍；PGDH^I182S/E183R对NADP⁺酶活：提高2.46倍；PGDH^I182S/E183H的k_cat·Km⁻¹：提高4.60倍；PGDH^I182S/E183R的k_cat·Km⁻¹：提高9.53倍
3.3 菌株工程策略与摇瓶发酵性能
（图4展示了菌株工程策略示意及摇瓶发酵时间曲线。）
【数据】原文未详述
3.4 辅因子循环工程强化L-半胱氨酸生产
（图5展示了辅因子工程策略示意，红色标记的基因表示基因组过表达，蓝色标记的基因表示基因缺失，以及不同辅因子工程菌株的L-半胱氨酸滴度。）
【数据】原文未详述
3.5 不同强度启动子基因组过表达PSAT
（图6展示了分别用PJ23119、PJ23118和PJ23104替换serB天然启动子以过表达PSAT的菌株构建策略。）
【数据】原文未详述
3.6 组合表达不同外排蛋白对工程改造L-半胱氨酸外排
（图7展示了不同外排蛋白组合YdeD-TolC、Bcr-TolC、YfiK-TolC和CydDC-TolC的菌株构建及L-半胱氨酸产量。）
【数据】原文未详述
3.7 5 L生物反应器补料分批发酵生产L-半胱氨酸
（图8展示了5 L生物反应器中以葡萄糖为碳源的细胞生长和L-半胱氨酸产量，以及以甘油为补料底物的细胞生长和L-半胱氨酸产量。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究建立了一套整合的代谢工程策略以提升大肠杆菌的L-半胱氨酸产量。在甘油基条件下优化葡萄糖补充量改善了碳源利用效率并支持了高效产物形成。PGDH的半理性工程改造获得了具有增强催化性能的NADH/NADPH双特异性变体，从而改善了前体供应和氧化还原灵活性。辅因子循环的重新布线进一步表明，平衡的NADPH再生（而非过度的辅因子强化）对高效L-半胱氨酸生物合成至关重要。通过PSAT启动子替换强化代谢拉力提高了产量，但过度强化会导致通量向竞争途径转移。此外，适当的外排蛋白工程有效缓解了胞内产物相关胁迫，其中YdeD-TolC组合表现最佳。在5 L生物反应器补料分批发酵中，最终工程菌株实现了33.66 g·L⁻¹的L-半胱氨酸产量，产率为0.25 g·g⁻¹葡萄糖。
编译者解读
该研究提供了一个值得借鉴的系统工程范式——不是单一靶点的“点突变式”改造，而是将辅因子偏好性设计、氧化还原平衡和产物外排协同优化整合在同一底盘菌株中。PGDH双辅因子特异性的半理性改造尤其巧妙：通过空间位阻和静电环境双重设计，使同一酶同时兼容NADH和NADPH，显著增强了代谢网络的辅因子灵活性。值得注意的是，作者明确指出“平衡的NADPH再生优于过度强化”，这一结论对含硫氨基酸及其他还原力需求型产物的菌株设计具有普遍参考价值。5 L反应器中33.66 g·L⁻¹的产量已达到工业应用潜力水平，但甘油为补料底物时的性能表现原文未详述，未来若能补充该条件下的完整数据，将更全面地支撑该策略的适用性评估。
参考来源
Zhou Z. Systematic engineering of Escherichia coli for high-yield production of L-cysteine. Chinese Journal of Chemical Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.cjche.2026.05.008
DOI: 10.1016/j.cjche.2026.05.008