来源：Expediting genome synthesis of Corynebacterium glutamicum with an artificial chromosome vector（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
基因组合成是探索生命奥秘与赋予微生物新功能的有力工具，但此前相关技术主要局限于大肠杆菌和酵母。本研究为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）设计了一种人工染色体（CAC）载体，可高效递送并稳定维持长达56 kb的DNA片段。基于该载体开发的CACEXER策略实现了基因组迭代替换，成功将361 kb（占基因组11%）的合成DNA整合入基因组，构建出半合成菌株semi-synCG-A。这项工作使谷氨酸棒状杆菌有望成为继大肠杆菌和酿酒酵母之后第三个经历大规模基因组合成的工业微生物。
研究背景
基因组合成是扩展基因组学知识和新功能的有力技术。过去15年间，科学家已成功合成完整的丝状支原体基因组，完成了大肠杆菌基因组全长的同义密码子重编码（Syn61），酵母合成基因组计划（Sc2.0）已组装出全部合成染色体。这些方法在大肠杆菌和酵母中取得了快速进展，但往往不适用于其他微生物。谷氨酸棒状杆菌是工业氨基酸生产的重要菌株，其基因组合成研究尚属空白。本研究旨在开发一种适用于谷氨酸棒状杆菌的人工染色体载体，并建立高效的基因组替换策略。
研究方法
菌株与培养条件
大肠杆菌DH5α用作克隆宿主，大肠杆菌NEB 10-beta用于CAC质粒扩增。谷氨酸棒状杆菌菌株semi-synCG-A1用作基因组修饰的起始菌株。本研究所用菌株列于补充信息在线表S1。大肠杆菌菌株在37°C的LB（溶菌肉汤）培养基中培养。谷氨酸棒状杆菌菌株在30°C的BHIS培养基中进行基因组替换培养，在Neural复合培养基（NCM）中制备电转感受态细胞[28]。抗生素和化学试剂浓度如下：大肠杆菌使用34 μg/ml氯霉素、50 μg/ml卡那霉素、50 μg/ml壮观霉素和5 μg/ml四环素；谷氨酸棒状杆菌使用10 μg/ml氯霉素、20 μg/ml链霉素、20 μg/ml卡那霉素、150 μg/ml壮观霉素、1.5 μg/ml四环素、10-20%（w/v）蔗糖和1.25 mM 4-氯-DL-苯丙氨酸。酵母组装在酿酒酵母菌株VL6-48（ATCC编号MYA3666）中进行。酵母细胞在30°C下培养于YPD培养基（10 g/l酵母提取物、20 g/l蛋白胨和20 g/l葡萄糖）或SD-His培养基（缺乏组氨酸的合成缺陷培养基，添加20 g/l葡萄糖；FunGenome，中国）。
分子克隆方法
PCR扩增反应使用Q5高保真DNA聚合酶（New England Biolabs）或KOD One Mix DNA聚合酶（Toyobo，日本）。限制性内切酶和Gibson组装试剂购自New England Biolabs。DNA产物使用HiPure凝胶纯化DNA微量试剂盒（Magen Biotech，中国）或Nucleospin凝胶和PCR清洁试剂盒（Macherey-Nagel，德国）进行纯化。除非另有说明，质粒使用TIANprep小量质粒试剂盒（Tiangen，中国）按制造商说明从过夜培养物中提取。寡核苷酸合成和Sanger测序外包给Sangon Biotech（上海，中国）、RuiBiotech（北京，中国）或Tianyi Huiyuan（武汉，中国）。
穿梭载体的构建
质粒pRSII313购自Addgene（目录号35449）。质粒pBeloBAC11和pK18mobsacB [72]购自Miaoling Biology（武汉，中国）。RK2 oriV和trfA基因来源于pCas12a-λRed [73]。来自pCXC100（GenBank编号AY380839.1，碱基1-4992）的5-kb复制序列和含有来自pBL90（GenBank编号KU306397.1，碱基53509-57768）的第二复制序列的质粒pOK12BL90分别由Generay Biotech（上海，中国）合成。pOK12CXC100和pCGBACYT90分别通过Gibson组装构建。YAC复制起点和HIS3标记从pRSII313扩增。BAC复制起点和cat标记从pBeloBAC11扩增。RP4 oriT片段从pK18mobsacB扩增。pBL90复制子II片段从pBL90扩增。这四个片段用于通过Gibson组装构建pCGBACYT90。pCGBAC1通过将来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组的parS位点（5'-tgtttcacgtgaaaca-3'）插入原始pCGBACYT90中，替换parA II和parB的DNA序列而生成。引物序列列于补充信息在线表S2。本研究所用质粒列于补充信息在线表S3。
辅助质粒的构建
来自酿酒酵母的线粒体内含子编码核酸内切酶I-SceI基因（UniProt条目P03882）经密码子优化后由Sangon Biotech（上海，中国）合成。PBAD启动子从pCas [74]扩增，该质粒为盛阳博士惠赠。为构建pXMJ19-RecET-ISceI，将PBAD-ISceI片段通过Gibson组装克隆入质粒pXMJ19-recET [28]。引物序列列于表S2。
酵母中CAC质粒的组装
CAC质粒使用酵母转化相关重组（TAR）[33]进行组装。具体而言，对于pCGBAC1-A1的构建，我们将55.1 kb重新设计的合成序列[28]标记为chunk A1。CAC质粒由从模板质粒扩增的七个PCR产物，加上以pCGBAC1为模板扩增的两个CAC骨架片段组装而成。酵母转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒（Zymo Research）按制造商说明进行。将200 ng每个片段加入100 μl感受态细胞中，置于1.5 ml微量离心管内，混合物在30°C孵育2小时，然后涂布于SD-His培养基。挑取菌落，在新的SD-His平板上重新划线，在30°C生长1-2天。通过跨所有连接点的菌落PCR验证组装。单菌落在40 μl 0.1%（w/v）NaOH中、95°C裂解30分钟，上清液用于KOD FX聚合酶（Toyobo，日本）PCR。PCR条件为：94°C 3分钟；30个循环的98°C 10秒、60°C 30秒、68°C每kb 1分钟；最后68°C延伸5分钟。验证过的菌落用于CAC质粒提取。用于CACEXER的CAC质粒构建细节见“CAC质粒中chunk A4-A10的组装”部分。
CAC质粒中chunk A4-A10的组装
包括chunk A1在内的整个基因组经计算重新设计[28]，将设计的合成序列分为六个巨型片段（megachunk A-F，每个495-525 kb）。在本研究中，megachunk A被分为九个chunk（A2-A10），每个大小为52-56 kb。Chunk A3-A10进一步细分为90个4-5 kb的微型片段（minichunk），每个重叠60-66 bp。Chunk A2被细分为97个约600 bp的片段，每个重叠35-40 bp。Chunk A2的97个片段和chunk A3-A10的90个微型片段的合成外包给BGI。每个含有约25或50 kb合成DNA的CAC质粒组装如下。使用以下正选择和负选择标记：rpsL（-1，链霉素敏感性）、kanR（+1，卡那霉素抗性）、sacB（-2，赋予蔗糖敏感性）和speR（+2，壮观霉素抗性）。rpsL、kanR和speR基因此前已使用[28]。sacB基因从质粒pK18mobsacB扩增。密码子优化的sacB基因和pheS（pheS T262A_A309G；-4，赋予4-氯-DL-苯丙氨酸敏感性）基因由RuiBiotech（北京，中国）合成（补充注释S1）。双选择盒P tuf-pheS-P tuf-sacB Cg-SpeR通过重叠PCR获得。合成DNA侧翼序列的设计如下。在5'端，合成DNA侧翼为500-1000 bp上游同源臂（UHA），用于在谷氨酸棒状杆菌中进行替换，以及一个I-SceI切除位点。在3'端，合成DNA侧翼为双选择盒rpsL-KanR、sacB-SpeR或P tuf-pheS*-P tuf-sacB Cg-SpeR、500-1000 bp下游同源臂（DHA）和另一个I-SceI切除位点。此外，在CAC质粒骨架上插入一个不同的负选择标记以增强载体消除。为组装一个完整chunk或两个亚chunk，通过PCR扩增或酶切产生5-12个微型片段合成DNA片段和一个预构建的含双选择标记和DHA的片段。每个片段与其相邻片段具有60-80 bp同源性。CAC质粒骨架从pCGBAC1扩增为两个片段。这些片段按“酵母中CAC质粒的组装”部分所述通过TAR组装。具体而言，chunk A4、A5、A6和A9作为完整chunk或两个亚chunk组装，而chunk A7、A8和A10作为完整chunk组装。
CAC质粒在大肠杆菌中的繁殖和验证
CAC质粒在大肠杆菌NEB 10-beta [33]中繁殖。使用TIANamp酵母DNA试剂盒（Tiangen，中国）从10 mL酿酒酵母培养物中提取总DNA，按制造商说明进行。
研究结果
谷氨酸棒状杆菌人工染色体的设计与测试
在初步实验中，我们发现现有的BAC载体（无论是否添加广宿主范围RK2复制子）无法在谷氨酸棒状杆菌中维持（补充信息在线图S1A、表S1-S3和注释S1）。这符合预期，因为BAC和RK2复制子通常在革兰氏阳性菌中无功能[34-37]。这一结果强调了开发CAC载体的必要性。为此，我们遵循BAC/YAC载体的原理，其具有三个关键功能：（i）容纳大DNA片段的能力；（ii）这些片段的复制；（iii）质粒正确分配到子细胞中[3,38-40]。我们从与谷氨酸棒状杆菌密切相关的物种大质粒中发现的两种天然复制子获得灵感。一种复制子来自革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp. Cynodontis的51-kb质粒pCXC100 [41,42]，含有复制基因repA（尽管缺乏复制起点的明确注释）、分配基因parA和parB以及一个直接重复parS位点。另一种复制子来自Brevibacterium Lactofermentum DSM 1412的67.8-kb质粒pBL90 [43,44]，含有复制基因repA II、复制起点（nic）和一个与复制起始点同源的22-bp盒基序。此外，该复制子携带分配基因parA II和parB，尽管缺乏分配位点的明确注释[44]（图S1和注释S1）。我们通过分别将大肠杆菌复制子和这两种复制子整合到pOK12 [45]中验证了它们的功能。这产生了两个推定的E. coli–C. glutamicum穿梭载体，命名为pOK12CXC100和pOK12BL90（图S1B）。电转化进入谷氨酸棒状杆菌后，pOK12BL90产生了可存活转化子，通过针对pBL90复制子上质粒携带的repA II的菌落PCR确认。相比之下，pOK12CXC100未能产生可存活转化子，表明pCXC100的复制子在谷氨酸棒状杆菌中无效。然后我们通过将YAC复制子整合到pOK12BL90骨架中，组装了推定的S. cerevisiae–E. coli–C. glutamicum穿梭载体pCGBACYT90。将该载体电转化进入谷氨酸棒状杆菌后，通过菌落PCR验证转化子（图S1B）。接下来，我们将先前研究[28]中使用的55.1-kb合成序列（chunk A1）整合到pCGBACYT90中以评估其携带大DNA片段的能力，产生pCGBACYT90-A1（图S1C）。在酿酒酵母中组装质粒并在中间宿主大肠杆菌[33]中繁殖后，pCGBACYT90-A1通过电穿孔导入谷氨酸棒状杆菌，并通过PCR验证确认。然而，重新划线显示pCGBACYT90-A1的所有连接点条带缺失（图S1D），表明在传代过程中携带大DNA片段时载体不稳定。
细菌分配系统（parABS）广泛存在于低拷贝数质粒和染色体上[46]。我们假设从pCGBACYT90克隆的复制子可能缺乏着丝粒样parS位点，导致DNA分离过程中载体不稳定[47]。鉴于谷氨酸棒状杆菌染色体（3.2 Mb）的分离由其内在的parABS系统驱动，该系统包括靠近复制起点（oriC）的十个parS位点[48]，我们利用这一内源parABS系统来分离和分配人工染色体载体。为此，pCGBACYT90-A1质粒上的parA II和parB DNA序列被替换为16-bp基因组分配位点parS（5'-tgtttcacgtgaaaca-3'），从而产生pCGBAC1-A1（图1A、S1E和注释S1）。组装并提取pCGBAC1-A1质粒（图S1F）后，我们将其电穿孔进入谷氨酸棒状杆菌。通过菌落PCR验证转化子中pCGBAC1-A1质粒上的合成PCRTag，获得了预期结果（图S1G）。对转化子的单个菌落重新划线后，pCGBAC1-A1上合成PCRTag的存在得到再次确认（图1B），表明携带55.1-kb chunk A1的pCGBAC1-A1质粒在谷氨酸棒状杆菌中成功递送和维持。携带pCGBAC1-A1的菌株还进行了约130代的传代培养，质粒稳定性通过PCRTag分析和下一代测序（NGS）评估。从传代培养中选取8个单菌落进行检查，结果显示这些菌株携带所有合成片段，在20个loxPsym位点之间未检测到重复或重组事件（图1C、S1G和补充信息在线表S4）。这些结果共同证实了CAC载体在携带超过50 kb的大合成DNA片段方面的忠实稳定性，且不损害基因组稳定性。
通过CACEXER进行基因组替换
然后我们构建了辅助质粒pXMJ19-RecET-ISceI，携带I-SceI和RecET，赋予氯霉素抗性（+3，cat），以补充CAC载体（图S2A、表S1-S3和注释S1）。我们选择I-SceI大范围核酸酶而非CRISPR/Cas9来简化从CAC中切除双链（ds）DNA片段[3,4]（图2A）。使用I-SceI还最小化了细胞负担并规避了Cas9细胞毒性[49-51]。如先前研究[28]所述，RecET用于促进基因组替换。我们使用双选择标记来增强重组，一组在合成序列下游使用-1（rpsL）和+1（kanR）[28]，骨架上使用-2（sacB，赋予蔗糖敏感性）；另一组在合成序列下游使用-2（sacB）和+2（speR），骨架上使用-1（rpsL）[4,28,52]。这使得可以同时选择合成片段从CAC质粒替换到基因组中，以及从目标基因组位点去除负选择标记。我们将该系统命名为CACEXER。
接下来，我们使用CACEXER将53.4-kb合成DNA（chunk A4）整合到携带辅助质粒pXMJ19-RecET-ISceI的菌株semi-synCG-A3中。菌株semi-synCG-A3是通过将6-10-kb DNA片段依次替换到semi-synCG-A1基因组中构建的[28]，在chunk A3的3'端携带rpsL-kanR盒（图2A和补充信息在线注释S1和S2）。Chunk A4涵盖从NCgl0032到NCgl0077的区域（图2A）。它经过计算设计，分为11个4-5 kb的微型片段，由BGI（中国常州）合成[28]。我们在酵母中组装了CAC质粒pCGBAC1-A4（图S2B），在大肠杆菌中扩增，并电穿孔进入semi-synCG-A3。随后我们用阿拉伯糖和IPTG诱导I-SceI大范围核酸酶和RecET重组组分的表达（图2A和S2C）。重组菌株在添加氯霉素、壮观霉素和链霉素的琼脂平板上筛选。我们使用基因分型确认了双选择标记（rpsL-kanR）从基因组的丢失、负选择标记rpsL从载体骨架的丢失，以及新双选择标记（sacB-speR）插入基因组（图2A）。我们进一步对CACEXER整合的DNA片段与基因组其余部分之间的连接点进行了测序（图S2D），确认了I-SceI从CAC质粒切除产生的不匹配序列已被去除，替换是无疤痕的（图S2E）。我们通过western blotting分析了RecE、RecT和I-SceI的表达，使用RecE和RecT在N端和C端带有HA标签、I-SceI在C端带有FLAG标签的改良构建体（图S2F和注释S1）。三种蛋白在诱导后4小时均成功表达（图S2G,H）。RecT和I-SceI的表达水平相对较低。
讨论与解读
本研究开发了CACEXER这一高效方法，可在谷氨酸棒状杆菌中实现每步高达56 kb的迭代基因组替换。该方法利用新开发的CAC载体，与BAC和YAC一起构成第三个用于微生物大DNA操作的多功能平台。CAC设计原理适用于为其他生物创建新穿梭载体和加速基因组合成。此外，该CAC载体在将外源基因作为染色体外功能模块[62-64]或表达高GC含量的大生物合成基因簇（BGC）[65]方面显示出显著潜力，可实现复杂功能获取并促进代谢工程。鉴于大肠杆菌和酵母基因组合成中使用的合成DNA片段范围为30至136 kb [2,4,10,25]，本研究针对约50 kb的适中片段大小，这比我们先前工作中使用的10-kb片段[28]高出五倍。片段大小的增加显著加速了谷氨酸棒状杆菌的整体基因组合成过程。此外，我们初步评估了CAC载体（pCGBAC1）的上限容量，证明其能够携带80-kb合成DNA片段（补充信息在线图S11和注释S3）。尽管该更大构建体的完全替换能力尚未测试，但将在下一阶段基因组合成中评估这一潜力。
【编译者解读】本研究巧妙利用谷氨酸棒状杆菌内源的parABS分配系统解决了人工染色体不稳定的问题，这一设计思路具有普适性——其他缺乏高效BAC载体的工业微生物也可借鉴。选择I-SceI而非CRISPR/Cas9进行DNA切除，降低了细胞毒性，体现了对工业菌株实用性的考量。将片段从10 kb提升至50 kb是基因组合成效率的质变。未来若能验证80 kb片段的完整替换能力，将进一步加速谷氨酸棒状杆菌的基因组合成进程。局限在于当前仅完成了megachunk A的整合，其余五个巨型片段的合成与组装仍需大量工作。
参考来源
Zhang Z. Expediting genome synthesis of Corynebacterium glutamicum with an artificial chromosome vector. Trends in Biotechnology, 2025. DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.02.019
DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.02.019