来源：Metabolic flux reprogramming drives the efficient biosynthesis of L-citrulline by Corynebacterium glutamicum ATCC13869（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-瓜氨酸在食品、医药和营养保健品领域具有显著市场价值。本研究以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为底盘，通过筛选16个基因组整合位点和22个启动子建立遗传工具包，结合途径重构、前体供给强化、代谢增强及转运工程，最终获得菌株Cgl-CIT12。在1500-L中试发酵中，该菌株无需添加L-精氨酸即实现87.34 g/L产量、0.47 g/g得率和1.82 g/L/h生产强度，为目前报道的最高L-瓜氨酸生产水平。
研究背景
L-瓜氨酸作为重要的非必需氨基酸，在促进肌肉合成、抗高血压、清除自由基及维持一氧化氮代谢等方面功能突出，广泛应用于食品、医药和保健品行业。目前酶催化与微生物发酵是主要生产方式，但酶催化受制于原料和酶纯化成本高，难以满足工业规模生产需求。微生物发酵兼具效率与成本优势。当前大肠杆菌经系统代谢工程改造已实现82.1 g/L的L-瓜氨酸产量，但生物安全问题及噬菌体易感性制约了其工业应用。谷氨酸棒杆菌作为GRAS菌株，在氨基酸和精细化学品生产中已有成功先例，是理想的替代宿主。然而，遗传元件有限、代谢机制复杂、多基因组合工程效率低及缺乏工业导向的发酵优化等因素，严重制约了基于谷氨酸棒杆菌的高性能L-瓜氨酸生产菌株开发。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
本研究所用菌株、质粒及引物列于表S1和S8。选择美国典型培养物保藏中心保存的谷氨酸棒杆菌ATCC13869作为L-瓜氨酸生产的底盘菌株。大肠杆菌DH5α作为质粒构建的克隆宿主。利用pK18mobsacB系统对工程谷氨酸棒杆菌进行高效基因组操作。pECXK99EM和pXMJ19质粒用于过表达异源及同源基因。大肠杆菌在DNA操作过程中使用Luria-Bertani（LB）培养基培养，并适量添加氯霉素（25 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）。
【数据】氯霉素：25 mg/L；卡那霉素：50 mg/L；宿主菌：E. coli DH5α；底盘菌：C. glutamicum ATCC13869
2.2 DNA操作
采用Gibson assembly和分子克隆技术进行质粒构建和基因组编辑。启动子序列见表S5–6，整合位点列于表S2。异源基因和遗传修饰靶点分别详见表S3–4。
【数据】组装方法：Gibson assembly；整合位点数：见表S2；启动子：见表S5–6
2.3 摇瓶发酵
摇瓶发酵种子制备：首先，从甘油管中取1 mL菌液接种至含30 mL BHI培养基（表S9）的100-mL摇瓶中，置于旋转摇床培养箱中培养。培养条件：30°C，250 rpm，12 h。当OD600达到4.0–5.0时视为菌株活化完成。随后，从一级活化培养物中取1 mL菌液接种至含30 mL BHI培养基的100-mL摇瓶中，在旋转摇床培养箱中于30°C、250 rpm培养12 h。当OD600达到4.0–5.0时视为菌株活化完成。最后，从二级活化培养物中取2 mL菌液接种至含50 mL发酵培养基的500-mL摇瓶中。
摇瓶发酵：待测菌株在旋转摇床培养箱中培养72 h，条件为30°C、250 rpm。过程控制：发酵期间每隔6 h添加100 μL NH₄OH维持pH约7.0。每6 h取样一次。
【数据】BHI培养基：30 mL/100-mL摇瓶；温度：30°C；转速：250 rpm；时间：12 h（活化）、72 h（发酵）；OD600：4.0–5.0（活化终点）；接种量：2 mL/50 mL；pH控制：~7.0（每6 h加100 μL NH₄OH）；取样间隔：6 h
2.4 7.5-L发酵罐补料分批发酵
7.5-L发酵罐补料分批发酵的种子培养：首先，从甘油管取1 mL菌液接种至含30 mL液体BHI培养基（表S9）的100-mL摇瓶中，在旋转摇床培养箱中培养。培养条件：30°C、250 rpm、12 h。OD600达到3.0–4.0时视为活化完成。随后，从液体BHI培养基中取1 mL菌液接种至含30 mL活化培养基I（表S10）的100-mL摇瓶中，在旋转摇床培养箱中于30°C、250 rpm培养6–8 h。OD600达到3.0–4.0时视为活化完成。接下来，用接种环将液体活化培养基I中的菌液转接至活化培养基II琼脂平板（表S11），在恒温培养箱中于30°C培养15–17 h。然后用10 mL生理盐水充分洗涤每个平板上的菌落，将洗涤液的OD600调至8.0–10.0。同时，取2 mL洗涤菌液接种至含50 mL液体种子培养基I（表S12）的500-mL摇瓶中，在旋转摇床培养箱中于30°C、250 rpm培养6 h。OD600达到4.0–5.0时种子培养完成。最后，从液体种子培养基I中取50 mL菌液接种至含2.5 L液体种子培养基II（表S13）的5-L发酵罐（上海迪必尔生物工程）中，于30°C、pH = 6.8培养15–17 h，直至OD562达到30–40。
7.5-L发酵罐补料分批发酵：接种量为20%。7.5-L发酵罐（上海迪必尔生物工程）中发酵培养基（表S14）初始液量为2.1 L。通过添加NH₄OH维持发酵pH为7.0，温度恒定在30°C。为维持溶解氧（DO）水平为30%，搅拌速度从400 rpm提升至1000 rpm，罐压控制在0.02–0.05 MPa，通气速率设为2–3 L/min。初始葡萄糖浓度控制在17 g/L。当初始葡萄糖浓度降至1 g/L以下时，开始补加葡萄糖（800 g/L），维持葡萄糖浓度在0.1–1 g/L。当NH₄⁺浓度低于3.0 g/L时开始补加(NH₄)₂SO₄，葡萄糖与(NH₄)₂SO₄按固定比例补加。如有必要，添加适量消泡剂（DF-103，陶氏化学）消除泡沫。
【数据】接种量：20%；初始发酵液：2.1 L/7.5-L罐；pH：7.0；温度：30°C；DO：30%；搅拌：400→1000 rpm；罐压：0.02–0.05 MPa；通气：2–3 L/min；初始葡萄糖：17 g/L；补糖浓度：800 g/L；葡萄糖维持：0.1–1 g/L；NH₄⁺补加阈值：<3.0 g/L；种子OD562：30–40
2.5 1500-L发酵罐补料分批发酵
一级种子培养：从甘油管取1 mL菌液接种至含30 mL液体BHI培养基（表S9）的100-mL摇瓶中，在旋转摇床培养箱中培养。培养条件：30°C、250 rpm、12 h。OD600达到3.0–4.0时视为活化完成。随后，从液体BHI培养基中取1 mL菌液接种至含30 mL活化培养基I（表S10）的100-mL摇瓶中，在旋转摇床培养箱中于30°C、250 rpm培养6–8 h。OD600达到3.0–4.0时视为活化完成。接下来，用接种环将液体活化培养基I中的菌液转接至活化培养基II琼脂平板（表S11），在恒温培养箱中于30°C培养15–17 h。然后用20 mL生理盐水充分洗涤每个平板上的菌落，将洗涤液OD600调至8.0–10.0。同时，取20 mL洗涤菌液接种至含500 mL液体种子培养基I（表S12）的5000-mL摇瓶中，在往复式摇床培养箱中于30°C、120 rpm培养6 h。OD600达到4.0–5.0时一级种子培养完成。
300-L发酵罐二级种子培养：接种量为2.0%。300-L发酵罐中种子培养基II（表S13）初始液量为180 L。通过添加液氨维持发酵pH为6.8，温度恒定在30°C。为维持溶解氧（DO）水平为30–35%，搅拌速度从250 rpm提升至600 rpm，罐压控制在0.05–0.1 MPa，通气速率设为0.5 m³/h。初始葡萄糖浓度控制在30 g/L。培养时长：8–10 h。OD600达到40–50时二级种子培养完成。
1500-L发酵罐补料分批发酵：接种量为20%。1500-L发酵罐中发酵培养基（表S14）初始液量为900 L。通过添加液氨维持发酵pH为7.0，温度恒定在30°C。为维持30–35%溶解氧（DO），搅拌速度从80 rpm提升至190 rpm，罐压控制在0.05–0.1 MPa，通气速率设为20 m³/h。初始葡萄糖浓度控制在17 g/L。当初始葡萄糖浓度降至1 g/L以下时开始补加葡萄糖（800 g/L），维持葡萄糖浓度在0.1–1 g/L。当NH₄⁺浓度低于4 g/L时开始补加(NH₄)₂SO₄，葡萄糖与(NH₄)₂SO₄按固定比例补加。如有必要，添加适量消泡剂（DF-103，陶氏化学）消除泡沫。
【数据】一级种子OD600：3.0–4.0；洗涤液OD600：8.0–10.0；一级种子培养：30°C、120 rpm、6 h；300-L罐接种量：2.0%；300-L罐初始液量：180 L；300-L罐pH：6.8；300-L罐DO：30–35%；300-L罐搅拌：250→600 rpm；300-L罐通气：0.5 m³/h；300-L罐初始葡萄糖：30 g/L；300-L罐培养时间：8–10 h；300-L罐种子终点OD600：40–50；1500-L罐接种量：20%；1500-L罐初始液量：900 L；1500-L罐pH：7.0；1500-L罐DO：30–35%；1500-L罐搅拌：80→190 rpm；1500-L罐通气：20 m³/h；1500-L罐初始葡萄糖：17 g/L；NH₄⁺补加阈值：<4 g/L
2.6 培养基
本研究所用培养基配方见表S9–14。培养前使用25%（v/v）NH₄OH调节培养基pH。葡萄糖补料液浓度为800 g/L，(NH₄)₂SO₄补料液浓度原文未详述。
【数据】pH调节：25%（v/v）NH₄OH；葡萄糖补料浓度：800 g/L
研究结果
3.1 谷氨酸棒杆菌ATCC13869遗传工具包的建立
为实现谷氨酸棒杆菌ATCC13869的代谢重编程需求，本研究建立了高效遗传修饰的遗传工具包（图1）。（1）采用pK18mobSacB系统和Gibson assembly技术进行基因组编辑和质粒构建（图1b-c）。（2）同时，选择高拷贝质粒pECXK99EM和低拷贝质粒pXMJ19用于目标基因的表征和测试（图1d）。在此基础上，通过考察各遗传元件在菌株中的实际表现，筛选适用于代谢工程的基因组整合位点和启动子。
基因组整合位点从基因组中注释为假定蛋白的基因中筛选。通过NCBI数据库GeneBank 2.0分析基因序列，共发现878条注释为假定蛋白的基因序列，其中1条长度超过4000 bp，7条长度为3000–4000 bp，20条长度为2000–3000 bp，165条长度为1000–2000 bp，685条长度小于1000 bp（补充文件）。基因组整合位点的筛选依据以下标准：（1）假定蛋白的基因序列长度为800–3000 bp；（2）假定蛋白的基因序列均匀分布在基因组不同位置；（3）报告基因表达盒在基因组整合位点的整合效率应>30%；（4）报告基因表达盒在基因组整合位点的表达应保持稳定。根据上述要求，共选择20个注释为假定蛋白的基因序列作为候选基因组整合位点：从BBD29_00005基因（编码染色体复制起始蛋白DnaA）开始，序列分布在基因组的7个不同位置（图1a），其中0–0.5 Mbp区域（区域1）6个位点，0.5–1.0 Mbp区域（区域2）2个位点，1.5–2.0 Mbp区域（区域4）2个位点，2.0–2.5 Mbp区域（区域5）2个位点，2.5–3.0 Mbp区域（区域6）3个位点，>3.0 Mbp区域（区域7）3个位点。
此外，从不同来源选择了22个组成型启动子，包括（表S5）：谷氨酸棒杆菌内源天然启动子（P_tuf、P_gapA、P_lysC、P_rpoC、P_sod和P_gabTD）、人工合成启动子（PH1、PH2、PH5、PH9、PM3、PM6、PM9和PL10）以及来源于大肠杆菌的异源启动子（PBJ23118、PBJ23116、PBJ23114、PBJ23110、PBJ23106、PBJ23102、PBJ23101和PBJ23100）。
为评估可用基因组整合位点，利用pK18mobSacB遗传修饰系统和报告基因mKate表达盒（含启动子P_tuf、报告基因mKate和终止子rrnB）（图1b）评价了基因组整合位点的整合效率和报告基因表达水平。（1）在20个候选基因组整合位点中，18个成功敲入报告基因表达盒，2个失败。18个成功整合位点的阳性率均高于35%，其中BBD29_00170位点整合效率最高，达56.7%（图S1）。（2）在18个成功整合位点中，BBD29_14940位点的比荧光强度最高，为3442.91，而BBD29_07735位点最低，为1209.75，相差2.85倍。值得注意的是，基因组整合位点的比荧光强度与其距dnaA基因的距离成反比，在替换P_gapA启动子或改变基因表达盒转录方向后观察到类似结果（图1e-h）。（3）添加新霉素和不同碳源（葡萄糖、蔗糖和含96%葡萄糖、其余为麦芽糖、蔗糖和异麦芽糖的工业级葡萄糖）后，18个基因组整合位点的比荧光强度总体保持稳定（图S2–3）。（4）引入两种不同拷贝数的质粒（高拷贝质粒pECXK99EM和低拷贝质粒pXMJ19）表明，不同的代谢压力显著影响基因组整合位点的荧光强度。在高拷贝质粒pECXK99EM存在下，BBD29_08755和BBD29_10725位点的比荧光强度分别为979.10和1208.83，较对照组（1369.38和1794.38）分别下降39.86%和48.44%。相比之下，低拷贝质粒pXMJ19存在时，18个基因组整合位点的比荧光强度保持稳定（图S4）。
为进一步鉴定适用于该菌株代谢网络调控的启动子，本研究利用质粒pECXK99EM和报告基因mKate对不同来源的启动子进行了评估。相对启动子强度比较呈现梯度分布：（1）PH9、P_tuf、P_lysC和P_gapA为强启动子，比荧光强度分别为9967.90、8048.37、6641.12和5766.49（图1j和表S6）。（2）PH1、PH5、PH2、PL10、PM6和PM9为中等强度启动子，比荧光强度分别为3403.93、3256.41、2765.25、2394.42和1497.79（图1j和表S6）。（3）PM9、PM3、PBJ23118、PBJ23102、PBJ23110、PBJ23106、PBJ23100、P_sod、PBJ23101、P_rpoC、PBJ23114、PBJ23116和P_gabTD为弱启动子，比荧光强度分别为537.66、390.77、267.60、192.11、157.24、133.19、124.68、87.24、81.17、70.96、55.26、32.17和25.96（图1k和表S6）。
上述结果表明：（1）在鉴定出可稳定基因表达的16个基因组整合位点中，5个为高表达位点，5个为中表达位点，6个为低表达位点（图1i）。（2）在筛选的22个组成型启动子中，4个为强启动子，5个为中等强度启动子，13个为弱启动子（图1j-k）。
【数据】假定蛋白基因序列总数：878条（>4000 bp：1条；3000–4000 bp：7条；2000–3000 bp：20条；1000–2000 bp：165条；<1000 bp：685条）；候选整合位点：20个；成功整合位点：18个；最高整合效率：56.7%（BBD29_00170）；最高比荧光强度：3442.91（BBD29_14940）；最低比荧光强度：1209.75（BBD29_07735）；倍差：2.85倍；高拷贝质粒下BBD29_08755比荧光强度：979.10（下降39.86%）；高拷贝质粒下BBD29_10725比荧光强度：1208.83（下降48.44%）；强启动子比荧光强度：PH9=9967.90、P_tuf=8048.37、P_lysC=6641.12、P_gapA=5766.49；中等启动子比荧光强度：PH1=3403.93、PH5=3256.41、PH2=2765.25、PL10=2394.42、PM6=1497.79；弱启动子比荧光强度：PM9=537.66、PM3=390.77、PBJ23118=267.60、PBJ23102=192.11、PBJ23110=157.24、PBJ23106=133.19、PBJ23100=124.68、P_sod=87.24、PBJ23101=81.17、P_rpoC=70.96、PBJ23114=55.26、PBJ23116=32.17、P_gabTD=25.96
3.2 L-瓜氨酸生物合成途径的重构
为构建非营养缺陷型L-瓜氨酸生产菌株，基于上述基因组整合位点和启动子，对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的L-瓜氨酸生物合成途径进行了代谢重编程（图2a）。（1）通过删除菌株Cgl-13,869中的BBD29_07555基因（编码转录调控因子ArgR），构建菌株Cgl-CIT0（图2b）。（2）以菌株Cgl-CIT0为基础，使用启动子PH1、PH2、PH5、PBJ23102、PBJ23106、PBJ23110、PBJ23114、PBJ23116、PBJ23118和P_rpoC调控argCJBDF和argGH操纵子的表达，构建菌株Cgl-CIT0–1–21（图2c和S5）。摇瓶发酵结果表明，菌株Cgl-CIT0–12（PH1-argCJBDF-PBJ23106-argGH）的L-瓜氨酸产量达到2.14 g/L，仅积累0.12 g/L L-精氨酸，且不影响细胞生长，因此更名为Cgl-CIT1（图2g和S5）。（3）发酵过程中的酶活测定显示，Cgl-CIT1中ArgG和ArgH的酶活分别为154.65和133.53 U/L，较Cgl-CIT0（206.75和177.76 U/L）分别下降33.69%和33.12%（图2e-f）。（4）以Cgl-CIT1为亲本菌株，将额外拷贝的大肠杆菌来源argAᴴ¹⁵ʸ突变基因、argD基因和argCB操纵子分别整合至BBD29_00170、BBD29_013840和BBD29_05455位点，随后进行启动子优化（PH9、PM9和P_gapA），构建菌株Cgl-CIT1–1–27（图2d和S6）。（5）摇瓶发酵显示，Cgl-CIT1–18（P_gapA-argAᴴ¹⁵ʸ-PM9-argD-PM9-argCB）产L-瓜氨酸4.59 g/L，较Cgl-CIT1（2.14 g/L）提高2.14倍，因此更名为Cgl-CIT2（图2h和S6）。
【数据】Cgl-CIT0–12 L-瓜氨酸产量：2.14 g/L；L-精氨酸积累：0.12 g/L；ArgG酶活：154.65 U/L（Cgl-CIT1）vs 206.75 U/L（Cgl-CIT0），下降33.69%；ArgH酶活：133.53 U/L（Cgl-CIT1）vs 177.76 U/L（Cgl-CIT0），下降33.12%；Cgl-CIT1–18 L-瓜氨酸产量：4.59 g/L；提高倍数：2.14倍
（后续研究方法与结果部分原文节选未提供完整内容，以下根据已有节选继续编译。原文后续结果涉及CIT2至CIT6的代谢工程改造、7.5-L发酵罐性能评估、转录组学分析、模块化工程及1500-L放大发酵，由于原文节选在3.2处截断，此处仅能呈现已提供的部分。讨论部分根据已有节选编译。）
讨论与解读
本研究针对谷氨酸棒杆菌ATCC13869缺乏足够遗传修饰元件、多基因靶点迭代组合及工业导向发酵工艺优化不足等问题，系统鉴定了该底盘菌株的最优基因组整合位点和启动子，有效扩展了遗传工具库。在此基础上，通过重构合成途径、减少L-谷氨酸前体分泌、强化氨甲酰磷酸合成、增加NADPH供给并促进L-瓜氨酸外排，菌株Cgl-CIT6在不添加L-精氨酸的条件下，产量、得率和生产强度分别提高3.02倍、2.70倍和3.0倍。随后，通过多尺度代谢谱分析（转录、代谢物和蛋白质水平）鉴定出11个关键基因靶点。经模块化代谢工程改造，菌株Cgl-CIT12的L-瓜氨酸产量、得率和生产强度进一步分别提升52.47%、40.74%和53.13%。最终，通过碳氮比优化、溶解氧调控和生理参数监测，菌株Cgl-CIT12成功放大至1500-L发酵罐，L-瓜氨酸产量、得率和生产强度分别达到87.34 g/L、0.47 g/g和1.82 g/L/h。
【编译者解读】该研究展示了从遗传元件挖掘到工业放大的完整合成生物学研发链条。亮点在于系统筛选整合位点并发现其表达强度与距dnaA距离呈反比这一规律，为谷氨酸棒杆菌的基因表达精细调控提供了可预测的设计原则。模块化启动子工程策略有效解决了多基因协同表达的难题。1500-L规模验证使该成果具备直接产业化的潜力。值得注意的是，87.34 g/L的产量已超越大肠杆菌体系，且规避了内毒素和噬菌体风险。局限在于多轮迭代改造耗时较长，部分机制（如整合位点位置效应的分子基础）仍有待深入解析。
参考来源
Wei A. Metabolic flux reprogramming drives the efficient biosynthesis of L-citrulline by Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.175482
DOI: 10.1016/j.cej.2026.175482