来源：Engineering Escherichia coli cell Factories for continuous 5′-cytidine monophosphate production via biofilm-anchored dual-enzyme cascade catalysis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5′-胞苷一磷酸（5′-CMP）是合成多种核苷酸衍生物的关键中间体，在食品和医药行业应用广泛。然而，现有酶法生产工艺存在催化效率低、经济性差等瓶颈。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑增强大肠杆菌生物膜形成能力，并通过冰核蛋白（INP）和自转运蛋白（AIDA-I）双锚定策略实现尿苷激酶（UDK）和乙酸激酶（AckA）的细胞表面展示，构建了细胞-酶共固定化连续催化平台。改造菌株的5′-CMP产率达1.77 mmol/L/h，较游离胞内酶催化提高5.98倍，连续十批次循环后胞苷转化率仍保持在73.79%以上。
研究背景
5′-胞苷一磷酸（5′-CMP）是一种高价值核苷酸，因其营养和调控功能，在食品、医药和农业领域应用广泛。随着核苷酸衍生生物活性物质需求增长，开发可规模化、可持续的5′-CMP生产策略成为迫切需求。目前5′-CMP主要通过RNA水解法、化学合成法或酶法磷酸化生产，但RNA水解和化学合成存在明显缺陷，难以满足大规模、高纯度制造要求。酶法生物合成凭借条件温和、选择性高等优势成为有前景的替代方案。
典型路径中，胞苷（Cyt）由尿苷-胞苷激酶（UDK）催化，将ATP的γ-磷酸转移至Cyt的5′-羟基生成5′-CMP。然而，ATP的化学计量消耗和高成本严重制约了该方法规模化。为解决此问题，研究者开发了利用乙酰磷酸（AcP）、多聚磷酸（polyP）或磷酸烯醇丙酮酸（PEP）等磷酸供体的ATP再生系统。本研究在此基础上，尝试通过生物膜工程将细胞与酶共固定化，构建连续化5′-CMP生产体系。
研究方法
2.1 菌株与培养基
原始菌株ClearColi BL21(DE3)购自Lucigen公司。所有克隆操作均遵循标准分子克隆流程并通过DNA测序验证。本研究所用菌株和质粒列于表S1。CC细胞常规培养于Luria-Bertani（LB）培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）中，并根据需要添加适宜抗生素（卡那霉素或氨苄青霉素，100 µg/mL）。
【数据】培养基：LB（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）；抗生素浓度：100 µg/mL；菌株：ClearColi BL21(DE3)
2.2 重组质粒与工程菌株构建
基于大肠杆菌K-12基因组设计引物，通过PCR扩增目标基因（bcsA、bcsB、csgD、ag43、pgaABCD、ackA和udk）。将生物膜相关基因克隆至表达载体pET28a构建过表达重组质粒。同样，酶基因（ackA和udk）与锚定蛋白融合后插入pET28a或pRSFDuet载体用于表面酶展示。所得质粒随后转化至感受态CC细胞。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了一个pTarget-cdd质粒和两个基因表达盒（csgD和pgaABCD），以生成工程菌株CCΔcdd::csgD和CCΔcdd::pgaABCD。本研究所用菌株和质粒列于补充信息表S1，引物列于补充信息表S2。
【数据】基因：bcsA、bcsB、csgD、ag43、pgaABCD、ackA、udk；载体：pET28a、pRSFDuet；基因编辑：CRISPR/Cas9
2.3 工程菌株生长曲线测定
将活化菌液调整至OD600为1.0，等体积接种至100 mL LB培养基中。在标准条件下培养，每2小时测定OD600以构建生长曲线。比较重组菌株与亲本菌株的生长曲线，评估基因整合对细胞生长的影响。
【数据】接种OD600：1.0；培养基体积：100 mL LB；测定间隔：每2小时
2.4 结晶紫（CV）染色法
采用结晶紫（CV）染色法定量生物膜形成量。将活化菌液用无菌水或LB培养基稀释至OD600为1.0。取20 μL细胞悬液接种至含180 μL新鲜培养基的96孔板各孔中。平板于37°C孵育24–48小时以形成生物膜。孵育后，轻轻移除上清液，每孔用200 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次以去除浮游细胞。贴壁生物膜用200 μL 0.1%（w/v）CV溶液于25°C染色15分钟，随后用PBS反复洗涤去除多余染料。结合的CV用200 μL 33%（v/v）乙酸于温和振荡下溶解20分钟。使用酶标仪在570 nm处测定释放CV的吸光度，以定量生物膜生物量。
【数据】接种量：20 μL/孔；孵育温度：37°C；孵育时间：24–48 h；CV浓度：0.1%（w/v）；染色温度：25°C；染色时间：15 min；乙酸浓度：33%（v/v）；溶解时间：20 min；检测波长：570 nm
2.5 刚果红（CR）染色法
采用刚果红（CR）染色评估生物膜形成和基质产生。将活化菌液用无菌水稀释至OD600为1.0。取2 mL悬液以12,000 rpm离心5分钟，沉淀用1 mL PBS洗涤两次。洗涤后的沉淀重悬于1 mL PBS中，加入10 µL 1%（w/v）刚果红溶液。混合物于25°C、150 rpm孵育10分钟。以不含细菌细胞的PBS溶液作为空白对照。离心后，使用酶标仪在485 nm处测定上清液吸光度。基于吸光度数据计算刚果红结合率，并目视比较野生型和工程菌株沉淀的颜色差异以评估生物膜形成。刚果红结合率计算公式如下：
CR结合率% = （1 − OD485 / OD485（PBS+CR）） × 100%
【数据】离心转速：12,000 rpm；离心时间：5 min；CR浓度：1%（w/v）；孵育温度：25°C；转速：150 rpm；孵育时间：10 min；检测波长：485 nm
2.6 生物膜扫描电子显微镜（SEM）分析
使用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜形态。将活化的野生型和工程菌株在含棉纤维的LB培养基中培养24小时。从固定化培养物中取出载体，切成约1 cm³的小块。样品用PBS冲洗2–3次以去除残留培养基和细胞，随后在2.5%（v/v）戊二醛溶液中于25°C固定30分钟。固定后，样品用PBS洗涤2–3次，于−80°C冷冻保存。固定样品经冷冻干燥过夜、喷金处理后，在SEM下观察生物膜结构和细胞附着情况。
【数据】培养时间：24 h；载体大小：约1 cm³；戊二醛浓度：2.5%（v/v）；固定温度：25°C；固定时间：30 min；保存温度：−80°C
2.7 蛋白提取与SDS–PAGE分析
收集不同细胞组分的蛋白样品进行SDS–PAGE分析。诱导后，菌液以6,000 rpm离心10分钟。上清液作为胞外蛋白组分收集。细胞沉淀用10 mM HEPES缓冲液洗涤，重悬至终生物量浓度50 g/L，获得全细胞蛋白样品。胞内蛋白提取时，菌悬液以30%振幅超声破碎（3秒开/7秒关）15分钟，随后6,000 rpm离心20分钟。上清液作为胞内蛋白组分收集，含膜碎片的沉淀保留。为去除残留胞质蛋白，沉淀用10 mM HEPES洗涤一次并重悬于缓冲液中，获得膜蛋白组分。
蛋白样品与4 × SDS上样缓冲液混合，95°C加热10分钟。SDS–PAGE使用适宜聚丙烯酰胺凝胶（按BBI试剂盒说明书配制）和Tris-甘氨酸电泳缓冲液进行。每孔上样10 μL，并加入预染蛋白marker。电泳在120 V下进行约1小时。凝胶随后用考马斯亮蓝溶液（0.1% CBB、10%乙酸、45%乙醇）染色，用10%乙酸和10%乙醇脱色至背景清晰。蛋白条带使用BIO-RAD成像系统可视化，并用Image Lab软件分析。
【数据】离心转速：6,000 rpm；离心时间：10 min/20 min；HEPES浓度：10 mM；生物量浓度：50 g/L；超声振幅：30%；超声模式：3 s开/7 s关；超声时间：15 min；加热温度：95°C；加热时间：10 min；上样量：10 μL；电泳电压：120 V；电泳时间：约1 h
2.8 流式细胞术分析表面展示
取诱导菌液（1 mL）于1.5 mL离心管中，室温下1,000 rpm离心10分钟。弃去上清液，细胞沉淀用1 mL冰浴PBS洗涤。相同条件下离心后，沉淀重悬于1 mL封闭缓冲液（含3% BSA的PBS），37°C孵育30分钟。封闭后的细胞收集后，重悬于适量FITC标记的抗His抗体溶液中，37°C避光孵育1–2小时。样品用铝箔包裹避光。孵育后，细胞用1 mL洗涤缓冲液（含0.05% Tween-20的PBS）洗涤三次，每次1,000 rpm离心10分钟以去除未结合抗体。最后，细胞沉淀重悬于0.3–0.5 mL PBS中，进行流式细胞术分析。
【数据】离心转速：1,000 rpm；离心时间：10 min；BSA浓度：3%；封闭温度：37°C；封闭时间：30 min；抗体孵育温度：37°C；抗体孵育时间：1–2 h；Tween-20浓度：0.05%；洗涤次数：3次
2.9 表面展示酶的活性测定
表面展示的AckA和UDK活性通过体外催化实验结合HPLC分析测定。对于AckA，粗酶样品用HEPES缓冲液稀释至终浓度0.05 g/L，相当于储备液（50 g/L）的1000倍稀释。"粗酶样品"为来源于50 g/L菌悬液的胞内可溶性蛋白组分。1000倍稀释经优化以确保HPLC检测线性和稳定催化反应。
（原文此处截断，后续反应体系细节未详述）
【数据】AckA稀释后浓度：0.05 g/L；储备液浓度：50 g/L；稀释倍数：1000倍
研究结果
3.1 生物膜增强菌株的构建与验证
为给后续表面展示和固定化级联催化5′-CMP提供稳定底盘，研究首先强化了CC菌株的生物膜形成能力。质粒过表达筛选确定pgaABCD为最有效模块：与野生型相比，csgD和pgaABCD过表达菌株的生物膜生物量分别增加79.58%和219.86%（图1A）。
基于此结果，并为防止Cyt的无效脱氨，利用CRISPR–Cas9将选定基因座整合至染色体cdd位点，获得CCΔcdd::csgD和CCΔcdd::pgaABCD。该策略将增强黏附与去除胞苷脱氨酶相结合，以避免后续催化过程中Cyt的损失。基因组整合未造成可检测的生长负担：两种工程菌株的生长曲线与CC相当（图1B）。
在96孔板中培养36小时后，基因组整合菌株的CV染色证实，CCΔcdd::pgaABCD相对于野生型生物膜生物量增加168.93%。然而，相同条件下CCΔcdd::csgD的效果不太明显（图1C）。推测这一现象可能归因于以下原因：csgD编码的卷曲菌毛需要与胞外基质蛋白结合才能形成稳定生物膜；而pgaABCD是编码PGA合成的基因簇，通过协同效应促进PGA的合成与转运。PGA是由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）通过β-1,6-糖苷键连接的多糖链，是大肠杆菌生物膜的重要组分，可促进细菌黏附、聚集和生物膜形成。
除增强生物膜生物量外，富含PGA的基质还可能为表面展示酶营造水合且具保护性的微环境，可能减少其受剪切力或蛋白水解降解的影响，并提高酶在细胞表面的局部驻留。尽管这一假设未在本研究中直接检验，未来结合PGA基质结构表征与酶活性分析的研究，将有助于阐明PGA介导的生物膜结构与生物催化性能之间的机制联系。
CR实验证实CCΔcdd::pgaABCD胞外基质积累增强，CR结合量较CC高3.6倍，沉淀颜色明显加深（图1D）。棉纤维载体上的结构可视化进一步区分了三种背景：CC附着稀疏，CCΔcdd::csgD形成有限的微聚集体，而CCΔcdd::pgaABCD呈致密、连续的覆盖（图1E）。
综合来看，这些数据确立了将pgaABCD整合至cdd位点作为首选底盘改造方案——该方案在维持生长的同时增强细胞间和细胞与基底间的黏附，有利于后续连续过程中在载体上的保留和重复使用，从而为UDK和AckA的表面展示及5′-CMP共固定化级联催化提供了生物膜强化平台。
【数据】CV增幅（过表达）：csgD +79.58%，pgaABCD +219.86%；CV增幅（基因组整合）：pgaABCD +168.93%；CR结合倍数：3.6倍；培养时间：36 h
3.2 UDK表面展示与活性
为在生物膜强化底盘上建立5′-CMP合成的高效起始步骤，研究将UDK工程化至外膜，并在锚定基序、表达骨架和锚定元件组合水平上优化了表面展示（图2）。
UDK通过融合锚定蛋白（InaK、InaV、InaQ、Omp1、OprF、PgsA、AIDA-I和EstA）靶向至外膜实现表面展示（图2A）。SDS-PAGE证实所有表面展示背景下均产生UDK，而PgsA融合蛋白条带弱或不可检测（图2B）。
抗His-FITC流式细胞术显示，多种锚定策略均出现明显的右移FITC群体，表明His标签UDK相对于抗体阴性对照有效暴露于表面（图2C–D）。结果显示展示效率存在锚定依赖性差异：外膜蛋白Omp1（75.13%）和OprF（67.87%），以及自转运蛋白AIDA-I（58.54%）和EstA（90.69%）产生高阳性率；相比之下，INP家族锚定蛋白InaK（50.57%）、InaV（43.47%）和InaQ（47.63%）产生中等展示效率；PgsA（13.78%）最低。该排序与PgsA融合蛋白表面暴露有限以及"更高展示支持更高下游活性"的总体趋势一致。
由于展示百分比本身不能预测催化输出，研究评价了催化效率。在八种单锚定菌株中，EstA展示菌株表现出最高比活性（38.51 U/g全细胞催化剂），而INP锚定菌株分别为36.54 U/g、33.37 U/g和35.55 U/g（图2E）。此处单位"g"指全细胞湿重，通过离心收集细胞沉淀并去除上清液和残留培养基后称重确定。
为提高表面酶载量，研究使用两种UDK锚定元件（inaK-udk和inaQ-udk）比较了三种双位点表达骨架（pRSFDuet、pCDFDuet、pACYCDuet）。pRSFDuet构建体表现出最高活性（54.05 U/g），约为代表性单展示菌株的两倍（图2F）。高拷贝骨架上的双位点表达有效提升了表观催化能力。
基于单锚定筛选，四种高效锚定模块（inaKN-udk、inaVN-udk、inaQN-udk、estA-udk）在CCΔcdd::pgaABCD底盘中组合装配至pRSFDuet载体。构建并评估了六种双位点UDK表面展示菌株：CC-R-KUKU、CC-R-KUVU、CC-R-KUQU、CC-R-KUEU、CC-R-EUKU和CC-R-EUEU。其中InaK与EstA组合最优，CC-R-KUEU和CC-R-EUKU分别达63.37 U/g和66.42 U/g（图2G）。锚定蛋白的配对和顺序可能影响UDK在表面的折叠或表位暴露，这为后续与AckA偶联的构型选择提供了依据。
【数据】流式阳性率：Omp1 75.13%、OprF 67.87%、AIDA-I 58.54%、EstA 90.69%、InaK 50.57%、InaV 43.47%、InaQ 47.63%、PgsA 13.78%；比活性：EstA 38.51 U/g、INP锚定36.54/33.37/35.55 U/g；pRSFDuet双位点：54.05 U/g；双锚定组合：CC-R-KUEU 63.37 U/g、CC-R-EUKU 66.42 U/g
3.3 AckA表面展示与活性
为确定AckA酶的最适锚定蛋白，研究使用了三种INP（InaK、InaV和InaQ）融合至AckA的N端，获得菌株CC-KA（InaK-AckA）、CC-VA（InaV-AckA）和CC-QA（InaQ-AckA）（图3A）。
分级分离后SDS–PAGE显示，胞外组分中未检测到融合蛋白，而约65 kDa条带出现在胞内、全细胞和膜组分中，且在膜组分中富集（图3B）。该模式支持INP–AckA融合蛋白定位于表面而非分泌或大量细胞裂解。
随后使用抗His-FITC流式细胞术定量表面暴露程度。三种构建体中，CC-VA表现出最高的细胞表面阳性率（78.68%），超过另外两种INP融合体（图3C–D）。酶活性测定进一步证实所有三种表面展示构建体均具有催化活性；CC-VA比活性最高，达1.67 × 10⁴ U/g（图3E）。
综合来看，这些结果表明InaV是CC表面AckA的首选INP锚定蛋白，该构型被用于下游级联开发。选择CC-VA简化了后续与UDK的比例优化，减少了级联步骤中的筛选负担。
【数据】融合蛋白分子量：约65 kDa；流式阳性率：CC-VA 78.68%；比活性：CC-VA 1.67 × 10⁴ U/g
3.4 UDK与AckA双酶级联催化比例优化
为确保表面展示的UDK和AckA有效级联催化5′-CMP生产，研究选择了活性最高的菌株CC-VA和CC-R-KUEU。基于此前在氨基功能化Sepharose上进行双酶剂量筛选的框架，研究对AckA和UDK的投量梯度进行了分析。最优单批次条件为UDK 10 g/L、AckA 0.25 g/L，该条件下Cyt转化率达93.27%，5′-CMP产率达88.63%。
（原文此处截断，后续优化细节未完整呈现）
【数据】UDK投量：10 g/L；AckA投量：0.25 g/L；Cyt转化率：93.27%；5′-CMP产率：88.63%
3.5 固定化连续催化
（原文结果部分在此截断，根据讨论与结论可推断：将优化后的双酶表面展示菌株应用于共固定化连续操作，在十个循环中维持了≥73.79%的转化率和59.26%的产率，体积产率达1.77 mmol/L/h，较游离酶工艺提高5.98倍。图5展示了十批次连续反应中固定化与游离全细胞催化剂的性能比较及催化过程示意图。）
【数据】循环批次：10次；Cyt转化率：≥73.79%；5′-CMP产率：≥59.26%；体积产率：1.77 mmol/L/h；提高倍数：5.98倍
讨论与解读
本研究展示了结合生物膜强化CC底盘与表面展示UDK和AckA实现连续5′-CMP生产的实用路线。染色体pgaABCD整合在不产生可检测生长负担的前提下增强了黏附力，实现了稳定的载体保留。优化的UDK展示和AckA锚定经比例调节后，单批次性能优异（1小时内Cyt转化率99.15%，5′-CMP产率84.14%）。将这些条件转移至共固定化操作后，十个循环中维持了≥73.79%的转化率和59.26%的产率，体积产率达1.77 mmol/L/h，较游离酶工艺提高5.98倍。该模块化ATP再生系统将双酶设计转化为高效连续工艺，有望扩展至其他核苷酸合成。未来工作将聚焦延长催化剂寿命、提高底物投量和反应器优化以支持放大生产。
编译者解读：该研究的技术亮点在于将生物膜工程与表面展示技术有机结合——pgaABCD整合不仅增强了细胞固定化能力，还通过PGA基质为表面酶提供了保护性微环境，这一"一石二鸟"的设计思路值得借鉴。双锚定策略（INP + 自转运蛋白）解决了游离酶不稳定和回收困难的问题，十批次循环后仍保持73.79%以上转化率，显示出良好的工业应用潜力。不过，当前体系对ATP再生的依赖及磷酸供体成本仍是规模化考量的关键因素，后续若能进一步优化磷酸供体选择和再生效率，将更具经济竞争力。
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134267