来源：Structure-guided directed evolution of deacetylase leads to increased specificity of chloroacetamides and effective production of chloroamines（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
氯胺（O-3-氯-2-丙烯基羟胺）是合成烯酮类除草剂的关键中间体，传统化学合成路线污染严重。本研究提出一种生物酶法合成策略：以易合成的氯乙酰胺为底物，利用斑马鱼组蛋白脱乙酰酶10（zHDAC10）催化脱乙酰反应生成氯胺。通过结构引导的定点突变与迭代饱和突变，获得双突变体zHDAC10-M2（A24R/E274K），活性较野生型提高约8倍，催化效率达40 mM，100 mL制备规模24小时转化率超过94%。
研究背景
烯草酮（Clethodim）是一种高选择性环己烯酮类除草剂，由Kincade等人于1987年在英国作物保护会议上首次报道，美国Chevron化学公司随后将其商业化，年消耗量已超过10万吨。该除草剂是乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的高效、安全、高选择性抑制剂，对多种一年生和多年生杂草具有强杀伤效果，对双子叶植物和莎草几乎无影响。目前烯草酮的合成涉及两步：先形成环己烯二酮结构，再与氯胺进行肟醚化反应，其中氯胺对整体合成反应影响最大，是至关重要的中间体。当前氯胺的工业化生产采用繁琐的化学合成路线，以乙酸乙酯和硫酸羟胺或盐酸羟胺为原料，经过酰化、缩合、水解、碱化四步反应获得氯胺水溶液，再经二氯甲烷萃取分配得到二氯甲烷溶液。该工艺存在污染严重等问题，亟需开发绿色替代路线。
研究方法
2.1 材料
选用美国Madison的E.coli BL21 (DE3)作为DNA操作和基因表达的宿主菌株，克隆、表达和DNA测序所用载体为Novagen（美国Madison）的pET-28a(+)。合成引物由杭州擎科生物技术有限公司提供，PCR分析所用PfuUltra高保真DNA聚合酶由Agilent Technologies提供。上海桑戈生物科技有限公司提供卡那霉素和异丙基硫代-β-半乳糖苷诱导剂。其他必需试剂和溶剂购自国药集团化学试剂有限公司和上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
【数据】宿主菌株：E.coli BL21 (DE3)；载体：pET-28a(+)；抗生素：卡那霉素；诱导剂：IPTG
2.2 基因表达与蛋白纯化
南京金斯瑞生物科技有限公司对基因进行密码子优化并合成，随后插入表达质粒pET-28a(+)的EcoRI和XhoI限制性内切酶位点之间。为提高zHDAC10原核表达的可溶性，将表S1所列标签插入pET28a/zHDAC10载体，并将NcoI和NdeI酶切位点之间的序列替换为序列肽标签的氨基酸序列，该肽将在pET28a/zHDAC10载体中表达的靶蛋白N端融合。质粒转化至E.coli BL21 (DE3)后，重组大肠杆菌细胞在含50 mg/L卡那霉素的Luria-Bertani (LB)培养基中于37°C培养。当600 nm光密度（OD600）在0.6至0.8之间时，加入0.1 M IPTG和0.5 M ZnCl₂诱导表达，细胞培养物随后在28°C继续生长12小时。诱导菌株以8000 rpm离心10分钟，用0.85% NaCl洗涤两次。随后悬浮于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）中，在4°C下超声破碎（150 W，工作1秒、休息1秒）10分钟。8000 r/min离心20分钟后收集上清液，上样至Ni-NTA柱。将结合缓冲液（100 mM KH₂PO₄、300 mM NaCl、pH 7.5）与洗脱缓冲液（100 mM KH₂PO₄、300 mM NaCl、500 mM咪唑、pH 7.5）以10至500 mM咪唑梯度混合，目标蛋白被洗脱并收集。随后用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH=8.5）透析。采用SDS-PAGE评估纯化酶，使用BCA试剂盒（KeyGEN，南京，中国）测定浓度。
【数据】诱导条件：0.1 M IPTG + 0.5 M ZnCl₂，28°C，12h；离心：8000 rpm，10 min；超声破碎：150 W，4°C，10 min；Ni-NTA纯化：咪唑梯度10-500 mM；透析缓冲液：50 mM Tris-HCl，pH=8.5
2.3 酶活测定与分析方法
将酶或细胞与底物的混合物稀释于10 mL Tris-HCl测定缓冲液中，pH为8.5，浓度50 mM。反应后煮沸10分钟淬灭，离心提取上清液，随后测定浓度。使用Agilent® C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 µm），通过高效液相色谱（HPLC）测定氯胺和氯乙酰胺的浓度。流动相由甲醇、超纯水和6 M NaOH以3:6.5:0.5的比例配制，用磷酸调节pH至2。流速为0.8 mL/min，荧光发射波长设为210 nm，柱温维持在40°C。zHDAC10的一个酶活单位（U）定义为标准条件下每分钟催化产生1 μmol氯乙酰胺所需的酶量。
【数据】测定缓冲液：50 mM Tris-HCl，pH 8.5；HPLC柱：Agilent C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 µm)；流动相：甲醇:超纯水:6 M NaOH = 3:6.5:0.5，pH 2；流速：0.8 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：40°C
2.4 zHDAC10突变文库构建
使用AxyPrep质粒小提试剂盒提取pET28a/zHDAC10质粒。以pET28a/zHDAC10质粒为模板，采用全质粒PCR进行定点突变。PCR反应以95°C初始变性5分钟开始，随后进行32个循环的95°C 30秒、65°C 30秒、72°C 10分钟。所用引物列于表S3。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，随后用DpnI限制酶在37°C消化模板DNA 2小时以上。转化后的E.coli BL21 (DE3)涂布于100 μg/mL卡那霉素琼脂平板表面，37°C过夜培养。所得载体由杭州擎科生物科技有限公司测序。
【数据】PCR条件：95°C 5 min；32循环（95°C 30 s，65°C 30 s，72°C 10 min）；DpnI消化：37°C，≥2h；筛选平板：100 μg/mL卡那霉素，37°C过夜
2.5 酶学性质与动力学参数
为考察温度对zHDAC10-WT、zHDAC10-M1和zHDAC10-M2性能的影响，在30–70°C范围内评估其活性，所有酶均表现出最大活性100%。采用四种不同缓冲液——柠檬酸钠缓冲液（pH 5–6）、磷酸钠缓冲液（pH 6–8）、Tris-HCl缓冲液（pH 8–9）和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 9–10）——确定每种酶的最适pH。随后进行酶活测定以确定各酶最大活性，将其设为100%。为考察酶的pH稳定性，采用标准分析方法评估相对活性。酶在4°C预孵育12小时以上，孵育前的酶活设为100%。为评估酶的热稳定性，在指定温度和pH 7.0条件下预热6小时，随后采用标准分析技术测定相对活性，加热前活性作为100%基线。在最适条件下，通过测定氯乙酰胺浓度在1至2 mM范围内的反应速率确定野生型酶和突变体的动力学参数。数据用Origin 8.0分析，采用Michaelis-Menten方程估算结果。
【数据】温度范围：30–70°C；pH缓冲液：柠檬酸钠(pH 5-6)、磷酸钠(pH 6-8)、Tris-HCl(pH 8-9)、甘氨酸-NaOH(pH 9-10)；pH稳定性：4°C，12h；热稳定性：设定温度，pH 7.0，6h；底物浓度范围：1-2 mM
2.6 多序列比对与分子对接
查询UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取蛋白质序列及其注释。利用CUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行多序列比对分析，ESPrint 3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）进行进一步分析，相同残基以红色标记，相似残基以方框表示。zHDAC10三维结构模型从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取，SWISS-MODEL软件（http://www.expasy.org/swissmod/）用于创建zHDAC10的3D同源模型，模板晶体结构PDB ID为6ufn。配体用ChemBioOffice软件制备。分子对接计算和分析使用Autodock Vina进行，网格框的大小和位置参数由金属离子结合位点位置决定。Autodock Vina的系统参数保持默认设置。Pymol用于可视化结果。
【数据】模板结构：PDB ID 6ufn；对接软件：Autodock Vina（默认参数）；比对工具：CUSTALW + ESPrint 3.0
2.7 分子动力学模拟
使用搭载Amber19力场的YASARA软件在303 K下模拟zHDAC10-WT、zHDAC10-M1和zHDAC10-M2。能量最小化后，采用NPT和NVT系综平衡系统。随后对每个系统进行100 ps的MD模拟，总模拟时间50,000 ps。系统浸入TIP3P水立方盒中，蛋白质与盒子边缘的最小距离为0.8 nm。据此确定骨架原子的均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）值。
【数据】模拟温度：303 K；力场：Amber19；总模拟时间：50,000 ps；水模型：TIP3P；蛋白-盒边缘最小距离：0.8 nm
研究结果
3.1 以氯乙酰胺为底物筛选脱乙酰酶
本研究最初以氯乙酰胺为底物进行了大规模筛选工作，检测了实验室现有的50多种酰化酶和酰胺酶。然而，这些酶要么无活性，要么活性极低，不适合进行分子改造。因此，通过文献调研寻找能催化与氯乙酰胺类似底物的脱乙酰酶，发现了来自斑马鱼（Danio rerio）的组蛋白脱乙酰酶10（zHDAC10）（GenBank: NM_199775.1）[37]，该脱乙酰酶被称为"乙酰多胺脱乙酰酶"[37]。随后，以"乙酰多胺脱乙酰酶"和"组蛋白脱乙酰酶10"为关键词搜索Uniprot数据库，发现了来自分枝杆菌（Mycoplana ramose）的乙酰多胺酰胺水解酶（APAH）（GenBank: D10463.1）[38]和来自水稻（Oryza sativa subsp. japonica）的组蛋白脱乙酰酶10（osHDAC10）（GenBank: AK072557.1）[39]。它们催化各自底物的反应方程式列于表1。对三种氨基酸的序列比对分析如图1所示，同源性低于30%。
随后，基于E. coli密码子偏好性化学合成编码这些蛋白的基因，并在宿主E.coli BL21 (DE3)中表达。候选酶的蛋白质分子量如图S1A所示，与理论值一致，但可溶性蛋白表达水平低且存在大量包涵体。在初步实验中，通过高效液相色谱（HPLC）检测了三种脱乙酰酶对底物氯乙酰胺的活性。图2A和B显示，zHDAC10具有更好的转化氯乙酰胺的能力，且其晶体结构已有报道[37]。
因此，我们选择在zHDAC10的N端添加五种肽标签（如表S1所示）以提高其可溶性上清表达[40–44]。这些肽标签通常长度较短，不超过15个氨基酸；常由一个或两个氨基酸重复组成，可带正电或负电，因此不易形成有序三维构象，通常不会在蛋白质晶体结构中发现其解离状态[45,46]。它们可以在不破坏目标蛋白结构或降低其活性的情况下提供增溶效果[47]。此外，与蛋白融合标签不同，在生产/纯化后无需额外步骤去除肽标签，且与较大的融合标签相比，短肽标签可减轻宿主蛋白表达负担[48]。结果表明，在zHDAC10 N端融合TAT标签显著提高了可溶性表达，可溶性表达量从0.19 mg/mL增加至3.48 mg/mL，约提高18倍。其N端融合TAT标签的酶在相同浓度细胞粗酶液中的酶活比野生型高6倍（图S1B和S2）。最终，后续实验以N端带TAT标签的zHDAC10为原始模板，通过结构引导的定向进化开发高产氯胺酶。
【数据】筛选酶数：>50种；同源性：<30%；TAT标签可溶性表达：0.19→3.48 mg/mL（约18倍提高）；粗酶液活性：TAT标签酶活为野生型6倍
3.2 zHDAC10的整体晶体结构与催化机制
2017年，Hai及其同事对zHDAC10（PDB ID: 5TD7）进行了X射线晶体结构分析，揭示其呈"蝴蝶"状整体结构。催化活性脱乙酰酶结构域（PDAC）与具有相同拓扑结构但催化功能未知的结构域（ΨDAC）配对（图3A）[37]。同时，该研究团队证明斑马鱼zHDAC10是一种高活性的锌依赖性多胺脱乙酰酶，而其赖氨酸脱乙酰酶活性较低[37]。zHDAC10底物特异性由两个因素决定。其一，带负电的谷氨酸274的存在建立了对阳离子多胺底物中特定NH₂的特异性。尽管原子间距对于氢键相互作用而言过长，但足以产生有利的静电相互作用（图3B）。其二，zHDAC10中存在独特且灵活的310螺旋（P23ACE），限制了活性位点并使活性隧道窄而长（图3A、C）[37,49]。简言之，zHDAC10的结构特性更有利于在特定位置带有阳离子的多胺化合物，如N8-乙酰亚精胺和N-乙酰腐胺（图S3）。图3D总结了zHDAC10水解N8-乙酰亚精胺的催化机制：锌离子通过蛋白残基D174、H176和D267结合到底物羰基上，Y307辅助极化底物羰基以进行亲核攻击，从而实现脱乙酰化。此外，N8-乙酰亚精胺的NH部分与G145骨架羰基形成的氢键使底物酰胺基团被识别并促进亲核攻击。串联组氨酸（H136、H137）作为广义碱-广义酸，在稳定四面体中间体的同时辅助亲和攻击。如前所述，zHDAC10活性位点中的其他残基（P23ACE、E274）决定了多胺底物结合的特异性[37,49–54]。
【数据】晶体结构：PDB ID 5TD7；催化残基：D174、H176、D267、Y307、G145、H136、H137；底物特异性残基：P23ACE、E274
3.3 基于底物比较的分子对接与突变位点选择
使用zHDAC10晶体结构（PDB: 6ufn）将氯乙酰胺与锌离子定位，并用AutoDock Vina软件将其连接到活性位点（图4A）。观察到氯乙酰胺和N8-乙酰亚精胺都是长而窄的链状底物，符合zHDAC10的底物特异性特征之一（图S2）。然而，E274——建立阳离子底物特异性的守门残基（与N8-乙酰亚精胺的仲铵阳离子形成静电相互作用）——无法与底物氯乙酰胺中的Cl相互作用。这种相互作用的缺失可能解释了该酶对氯乙酰胺活性低的原因（图4B）。
鉴于此，我们将274位谷氨酸突变为赖氨酸、精氨酸和组氨酸——均为带正电荷的氨基酸残基——以改变zHDAC10的阳离子底物特异性并提高其对氯乙酰胺的催化活性。实验结果显示，突变体E274K（命名为zHDAC10-M1）的相对酶活比野生型高约4倍（图5）。此外，在274位氨基酸位点进行饱和突变实验后，未发现活性高于zHDAC10-M1的其他突变体（图S4）。尽管zHDAC10-M1对氯乙酰胺的活性较zHDAC10-WT有所提高，但与乙酰多胺相比活性仍然较低。对接结果显示，与底物中Cl相互作用的氨基酸很少（图4B）。因此，选择zHDAC10中位于底物Cl原子6 Å范围内的氨基酸A24、C25、I27、D94、G145、F146、H176和W205作为突变文库（图4C）。随后，以zHDAC10-M1为模板进行迭代饱和突变，以寻找酶活性提高的正向突变体（图4C）。在这些突变体中，A24R的酶活较zHDAC10-M1提高2.4倍，远高于其他突变体，命名为zHDAC10-M2（图5）。为评估274位点在改变催化性能中的重要性，我们基于zHDAC10-WT创建了单位点突变体（原文此处截断）。
【数据】E274K（M1）：相对活性为野生型约4倍；A24R（M2）：相对活性为M1的2.4倍；突变文库范围：底物Cl原子6 Å内8个氨基酸位点
讨论与解读
本研究建立了以氯乙酰胺为底物、利用脱乙酰酶生物合成氯胺的新路线。通过筛选三种脱乙酰酶，选定转化率相对最高的斑马鱼zHDAC10作为改造模板。针对真核基因zHDAC10在大肠杆菌中表达形成大量包涵体的问题，在N端添加五种肽标签，其中TAT标签效果最佳，使可溶性表达提高约18倍，相对酶活提高6倍。通过半理性设计获得两个突变体zHDAC10-M1和zHDAC10-M2，相对酶活分别比野生型高4倍和9.6倍。动力学测试结果显示，zHDAC10-M1和zHDAC10-M2的Km低于zHDAC10-WT，kcat高于zHDAC10-WT，表明对氯乙酰胺的催化效率（kcat/Km）和特异性均有提高。此外，两个突变体还表现出增强的热稳定性。相互作用分析和分子动力学模拟揭示了提高酶活和热稳定性的潜在机制——将24和274位点突变为带正电荷的氨基酸，使其与氯胺末端Cl形成氢键，从而稳定底物在活性口袋中的状态，提高催化效率。
【数据】M1相对活性：野生型的4倍；M2相对活性：野生型的9.6倍；100 mL制备规模：24h转化率>94%
编译者解读
本研究展示了结构引导的酶工程在绿色合成中的典型范式——从底物结构差异出发，精准锁定关键位点，以最小突变代价实现8倍活性提升。将E274和A24改造为带正电残基以适配底物末端氯原子的策略，体现了"酶-底物电荷互补"的设计智慧。值得注意的是，TAT短肽标签解决真核酶原核表达难题的思路，对同类工作具有直接借鉴价值。但本研究仍停留在实验室制备规模，工业级放大中的底物溶解度、产物分离等问题尚待验证。未来若能与化学合成路线做全生命周期评估，将更具说服力。
参考来源
Hu Z-C. Structure-guided directed evolution of deacetylase leads to increased specificity of chloroacetamides and effective production of chloroamines. Biochemical Engineering Journal, 2024. DOI: 10.1016/j.bej.2024.109214
DOI: 10.1016/j.bej.2024.109214