来源：Global regulator DksA as a key target for naringenin biosynthesis identified via whole-cell directed evolution（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
柚皮素是多种黄酮类化合物合成的核心前体。本研究开发了基于转录调控蛋白FdeR的柚皮素全细胞生物传感器，将其应用于4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）的定向酶进化与基因组定向进化。研究发现全局调控蛋白DksA的过表达使柚皮素产量提升1.95倍，对DksA蛋白进一步定向进化后产量再次翻倍；4CL3突变体C1E1较野生型酶产量提升3.02倍。最终在摇瓶培养条件下（30°C，72 h）柚皮素产量达797 mg/L。
研究背景
黄酮类化合物因其多样的药理活性而备受关注，包括抗氧化、抗炎和抗哮喘等功效。柚皮素作为黄酮生物合成途径中的关键中间体，是合成多种下游黄酮化合物的核心前体，因此提高柚皮素的生物合成效率对提升黄酮类化合物整体生产效率至关重要。柚皮素的生物合成始于一分子的4-香豆酰辅酶A与三分子的丙二酰辅酶A在查尔酮合酶（CHS）催化下缩合形成查尔酮，再经查尔酮异构酶（CHI）自发或酶促异构化为柚皮素。由于提取工艺耗时费力，利用微生物细胞工厂生物合成柚皮素被广泛探索。已有研究在大肠杆菌中异源表达4CL、CHS和CHI三种关键酶，以4-香豆酸为底物构建柚皮素细胞工厂，通过代谢工程策略将柚皮素产量提升至约90 mg/L。全细胞定向进化能够在多个细胞层面进行优化，是增强微生物生物合成能力的强效手段。
研究方法
2.1 一般材料
DNA聚合酶购自Takara Bio Inc.（中国大连）。寡核苷酸由Life Technologies（中国上海）合成。柚皮素、4-香豆酸、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（oNPG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖苷（X-gal）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。抗生素氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）和氯霉素（25 μg/mL）在必要时使用。
【数据】抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL；卡那霉素50 μg/mL；氯霉素25 μg/mL
2.2 质粒构建
本研究所用菌株和质粒见表S1，引物见表S2。
1）pS95A-fdeR：以Herbaspirillum seropedicae OS34基因组DNA为模板，使用引物fdeR-fwd和fdeR-rev扩增fdeR基因及P_fdeA启动子序列。以质粒DsRed（Clotech，美国）为模板，用引物rfp-fwd和rfp-rev扩增rfp基因（编码红色荧光蛋白）。将两个片段连接至pS95A载体[15]，得到质粒pS95A-fdeR，其中rfp受P_fdeA控制。
2）pS95A-fdeR-lacZ：以菌株MG1655基因组DNA为模板，用引物lacZ-fwd和lacZ-rev扩增lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶），替换pS95A-fdeR质粒中的rfp基因。
3）pAH95-fdeR-lacZ：用引物pAH95-fdeR-fwd和pAH95-lacZ-rev扩增含有fdeR和P_fdeA-lacZ的片段，与以改良的条件复制-整合-模块化（CRIM）质粒pAH95[16]为模板、引物pAH95-fwd和pAH95-rev扩增的PCR片段进行Gibson组装，得到质粒pAH95-fdeR-lacZ。
4）pGAP-CHS-4CL3：以拟南芥cDNA为模板，用引物At4CL3-fwd和At4CL3-rev扩增编码4-香豆酰辅酶A连接酶4CL3的基因，PCR产物与以质粒pGAP-CHS-4CL[14]为模板、引物pGAP-fwd和pGAP-CHS-rev扩增的PCR片段组装，得到质粒pGAP-CHS-4CL3。
5）pGAP-CHS-4CL3-dksA：以质粒pGAP-CHS-4CL3为模板、引物pGAP6-fwd和pGAP6-rev扩增的PCR片段，与以pCA24N-dksA[17]为模板、引物dksA-fwd和dksA-rev扩增的PCR片段组装，得到质粒pGAP-CHS-4CL3-dksA。
6）pET28a-4CL3：以质粒pGAP-CHS-4CL3为模板、引物4CL3-fwd和4CL3-rev扩增的PCR片段，与以质粒pET28a（Novagen，德国）为模板、引物pET28a-fwd和pET28a-rev扩增的PCR片段组装，得到质粒pET28a-4CL3。
【数据】模板：H. seropedicae OS34基因组DNA、拟南芥cDNA、MG1655基因组DNA；载体：pS95A、pAH95、pGAP-CHS-4CL、pCA24N-dksA、pET28a
2.3 菌株构建
本研究所用菌株见表S1。利用CRIM质粒pAH95-fdeR-lacZ，在辅助质粒pAH121[16]的帮助下，将fdeR和P_fdeA-lacZ构建体整合到大肠杆菌CUR01染色体中，得到菌株F。对于DksA突变库筛选，通过lambda-red方法[18]从菌株F中敲除染色体dksA基因，得到菌株D。
【数据】整合位点：CUR01染色体；敲除基因：dksA；方法：lambda-red
2.4 4CL3和DksA突变库的构建
4CL3的随机突变库通过易错PCR构建。使用引物4CL3-fwd和4CL3-rev，以携带野生型或突变型4CL3的质粒pGAP-CHS-4CL3为模板扩增编码4CL3的基因。PCR反应体系包含：7 mM MgCl₂、各1 mM的dCTP和dTTP、各0.2 mM的dATP和dGTP、0.025 mM MnCl₂及rTaq DNA聚合酶。PCR产物作为大引物，以pGAP-CHS-4CL3为模板进行全质粒大引物PCR（MEGAWHOP）[19]。随后用DpnI（20 U）在37°C消化2 h，再于80°C灭活20 min。将PCR产物转化大肠杆菌MC1061，收集约1.0 × 10⁶个转化子。随机挑取10个克隆测序，每个克隆平均含2.5个核苷酸突变。
DksA随机突变库同样通过易错PCR构建。使用引物pCA24N-dksA-fwd和pCA24N-rev，以质粒pCA24N-dksA[17]为模板扩增dksA基因。易错PCR和MEGAWHOP PCR操作同上。将PCR产物转化大肠杆菌MC1061，收集约1.0 × 10⁵个转化子。随机挑取10个克隆测序，每个克隆平均含1.5个核苷酸突变。
【数据】易错PCR体系：7 mM MgCl₂、1 mM dCTP/dTTP、0.2 mM dATP/dGTP、0.025 mM MnCl₂；DpnI消化：20 U，37°C，2 h；灭活：80°C，20 min；4CL3库转化子数：1.0 × 10⁶；平均突变数：2.5个/克隆；DksA库转化子数：1.0 × 10⁵；平均突变数：1.5个/克隆
2.5 RFP荧光测定
将携带质粒pS95A-fdeR的菌株BW25113的单菌落在LB培养基中37°C过夜培养，然后稀释至OD₆₀₀ = 0.02，接种于含适当浓度柚皮素的LB、M9或YM9培养基中，在30°C诱导条件下培养24 h。使用SynergyMx多功能酶标仪（BioTek，美国佛蒙特州）测定OD₆₀₀和RFP荧光发射（激发滤光片556 nm，发射滤光片586/20 nm）。
【数据】起始OD₆₀₀：0.02；培养温度：30°C；培养时间：24 h；激发波长：556 nm；发射波长：586/20 nm
2.6 β-半乳糖苷酶活性测定
β-半乳糖苷酶活性参照Miller[20]方法并稍作修改。反应混合物由150 μL Z缓冲液、20 μL 50 mM oNPG和30 μL细胞裂解液组成。在37°C孵育20 min后，用SynergyMx多功能酶标仪测定420 nm处吸光度。1单位LacZ酶活性定义为每分钟产生1 nmol硝基苯酚所需的酶量。
【数据】oNPG浓度：50 mM；反应体积：200 μL（150 μL Z缓冲液+20 μL oNPG+30 μL裂解液）；温度：37°C；时间：20 min；检测波长：420 nm
2.7 4CL3突变库、基因组库和DksA库的筛选
携带4CL3突变库或ASKA库的菌株F转化子，以及携带DksA突变库的菌株D转化子，涂布于含4.5 mM 4-香豆酸、80 μM IPTG（仅ASKA和DksA库）、10 μg/mL X-gal、25 μg/mL卡那霉素、12.5 μg/mL氯霉素（仅ASKA和DksA库）的M9Y琼脂平板上。在30°C琼脂平板上培养后，选择颜色最深的橄榄绿色菌落，在摇瓶中定量柚皮素产量。
【数据】4-香豆酸：4.5 mM；IPTG：80 μM；X-gal：10 μg/mL；卡那霉素：25 μg/mL；氯霉素：12.5 μg/mL；培养温度：30°C
2.8 HPLC分析
柚皮素产量测定：菌株在含4.5 mM 4-香豆酸和80 μM IPTG的M9Y培养基中、30°C培养48 h（另有说明除外）。取500 μL样品，加入等体积乙醇并混合。样品经0.2 μm滤膜过滤后，使用配备光电二极管阵列检测器的Shimadzu LC-20A系统（日本岛津）进行HPLC分析。所有分析使用Waters Symmetry C18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm），柱温35°C。柚皮素分离使用含0.1%甲酸的50%乙腈作为流动相，流速0.5 mL/min，检测波长287 nm。产量根据市售柚皮素标准品制备的标准曲线计算。
【数据】培养温度：30°C；培养时间：48 h；样品量：500 μL；色谱柱：C18（250 × 4.6 mm，5 μm）；柱温：35°C；流动相：50%乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.5 mL/min；检测波长：287 nm
2.9 蛋白质纯化
携带质粒pET28a-4CL3（含野生型4CL3或突变体C1E1）的菌株BL21(DE3)单菌落在LB培养基中37°C培养，当OD₆₀₀达到0.6时用0.4 mM IPTG诱导，随后在18°C继续培养16 h。细胞通过4°C离心收集，重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 8.0），用LC-JY96-IIN超声波细胞破碎仪（中国上海）超声破碎。细胞碎片通过离心（5000 ×g，20 min，4°C）去除，上清液上样至预平衡的镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）柱（Qiagen，美国）。用不同浓度的咪唑分步洗脱去除非特异性结合蛋白，目标蛋白用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，300 mM咪唑，pH 8.0）洗脱。咪唑通过4°C透析去除，透析液为100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。蛋白质纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估，蛋白质浓度用Bradford法[21]测定。
【数据】诱导条件：0.4 mM IPTG，OD₆₀₀=0.6时诱导；诱导温度：18°C；诱导时间：16 h；裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 8.0；离心：5000 ×g，20 min，4°C；洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，300 mM咪唑，pH 8.0；透析缓冲液：100 mM Tris-HCl，pH 8.0
2.10 酶活性测定和动力学参数确定
200 μL反应混合物包含5 μM 4-香豆酸、0.33 mM CoA、5 mM ATP、5 mM MgCl₂。
【数据】反应体积：200 μL；4-香豆酸：5 μM；CoA：0.33 mM；ATP：5 mM；MgCl₂：5 mM
研究结果
3.1 柚皮素全细胞生物传感器的开发
为实现大肠杆菌中柚皮素生物合成的实时监测，本研究开发了基于Herbaspirillum seropedicae来源的TRP蛋白FdeR的柚皮素全细胞生物传感器。在其天然宿主中，FdeR作为LysR型转录调控因子（LTTR）家族激活子，响应胞内柚皮素水平调控柚皮素分解代谢途径的表达[22]。FdeR在N端结构域含有螺旋-转角-螺旋DNA结合基序，C端结构域与诱导分子（如柚皮素）相互作用。存在柚皮素时，FdeR-柚皮素复合物可结合至P_fdeA中潜在的LTTR盒（含T-N11-A序列）的操纵子区域，激活转录；无柚皮素时，转录处于失活状态[23]。
为将该调控系统适配至大肠杆菌BW25113，构建了由组成型表达的FdeR和受FdeR调控启动子（P_fdeA）控制的RFP报告基因组成的生物传感器模块（图1A）。为评估传感器性能，携带生物传感器的BW25113菌株在LB培养基中培养12 h，外源添加不同浓度柚皮素，测定RFP荧光强度以评估诱导动态。如图1B所示，RFP荧光呈剂量依赖性增加，半最大激活浓度约为0.175 mM柚皮素。进一步比较了不同培养基配方下传感器的诱导强度。当细胞在含0.5 mM柚皮素的条件下生长时，LB、M9Y和YM9培养基中分别实现了153、223和4倍的诱导倍数（图1C）。鉴于M9Y培养基中显著较高的诱导倍数，后续所有筛选实验均选用M9Y培养基以确保高灵敏度和宽动态范围。
为实现固体培养基上的高通量筛选，将RFP报告基因替换为lacZ。将组成型表达的FdeR和P_fdeA-lacZ构建体染色体整合至菌株CUR01[24]中，生成生物传感器菌株F（表S1）。菌株F随后转化质粒pGAP-CHS-4CL3（本课题组前期报道[14]），该质粒携带柚皮素生物合成关键酶（4CL3和CHS）的编码基因，并在补充4-香豆酸作为底物的M9Y培养基中培养。底物和产物通过HPLC定量（图S2）并经LC-MS/MS分析验证（图S3）。在培养的不同时间点，同时定量柚皮素产量和LacZ活性。如图1D所示，LacZ活性与胞内柚皮素水平呈强正相关，证实了生物传感器的可靠性和响应性。上述结果表明，基于FdeR的生物传感器是检测和富集柚皮素高产细胞工厂的稳健工具。
【数据】半最大激活浓度：约0.175 mM柚皮素；诱导倍数（0.5 mM柚皮素）：LB 153倍、M9Y 223倍、YM9 4倍；LacZ活性与柚皮素水平：强正相关
3.2 柚皮素细胞工厂的构建
设计了一个异源生物合成操纵子以实现大肠杆菌中柚皮素的生产，包含两个关键酶：来自拟南芥的4CL和来自矮牵牛的CHS（图2A）。鉴于文献报道的辅酶A连接效率限制，评估了不同的4CL同工酶以确定柚皮素生物合成的最有效变体。具体比较了来自拟南芥的4CL1（GenBank登录号：AEE32700）和4CL3（GenBank登录号：AEE34324）[25]，以及Xiong等人[14]工程改造的4CL1突变体4AT。如图2B所示，表达4CL3的细胞获得最高柚皮素产量，达到0.36 mM。基于此结果，选择包含CHS和4CL3的操纵子用于后续实验的进一步优化。
接下来，系统考察了发酵条件（包括pH和温度等培养条件）对柚皮素产量的影响。如图2C和D所示，柚皮素生物合成在弱碱性条件（pH 8.0–8.5）和30°C培养温度下显著增强，产量最高达0.53 mM。同时，单位菌体细胞的柚皮素产量也在这些条件下达到最优。这些优化参数随后应用于定向进化过程。为便于定向酶进化和全基因组诱变中的高通量筛选，采用基于FdeR的全细胞生物传感器，为增强微生物黄酮生物合成提供了强效策略。
【数据】4CL3最高产量：0.36 mM；优化后最高产量：0.53 mM；最适pH：8.0–8.5；最适温度：30°C
3.3 全细胞生物传感器辅助的4CL3酶定向进化
为提高4CL3的催化效率，基于携带柚皮素生物合成途径的质粒pGAP-CHS-4CL3构建了随机突变库。该文库用于转化菌株F——一种能够通过P_fdeA-lacZ报告系统对胞内柚皮素水平产生比色响应的生物传感器菌株。由于柚皮素是黄色化合物，而LacZ活性在X-gal水解时产生蓝色显色信号，高产量变体可通过琼脂平板上的独特橄榄绿色进行视觉识别。从约10⁶个转化子中，挑选出5个颜色最深的橄榄色菌落进行进一步分析（图3A）。这些候选菌株随后在摇瓶培养中复筛，与表达野生型途径的对照菌株相比，5个菌株的柚皮素产量均显著增加（图3B）。
对所选克隆的DNA测序揭示了4CL3突变体中的特异性氨基酸替换（表1）。其中，突变体C1的改善幅度最大，柚皮素产量比野生型酶高1.84倍。突变体C1随后作为第二轮定向进化的亲本模板。经转化和约10⁶个菌落的筛选后，鉴定出两个改良突变体C1E1和C1E2。值得注意的是，突变体C1E1的柚皮素产量比C1提高了1.65倍，比野生型酶提高了3.02倍。每轮进化引入的相应突变汇总于表1。这些结果证明了生物传感器辅助定向进化在提高4CL3活性方面的有效性，并凸显了迭代诱变在优化黄酮生物合成关键酶方面的潜力。
突变体C1和C1E1以及野生型4CL3经纯化后进行进一步的生化表征。如预期所示，两种突变体相较于野生型酶均表现出显著增强的比活性（图3C）。动力学分析显示，虽然C1E1对4-香豆酸的亲和力降低，但其对第二底物CoA的亲和力显著增加。此外，C1E1对两种底物的k_cat值分别提高了4.54倍和3.02倍。因此，C1E1对CoA的总体催化效率（k_cat/Km）提高了7.13倍，这可能补偿了胞内CoA的低浓度，从而增强酶在体内的辅酶A连接能力（表2，图S4）。
4CL3变体的结构分析显示，第34位残基表面暴露且远离催化中心。C1E1中的E339D突变引入了较短的天冬氨酸侧链，导致第339位残基与N482之间的相互作用减弱（图3D）。C1E1中的E497V突变消除了与K314的静电相互作用（图3E）。这些结构变化可能进一步 destabilize N端和C端结构域之间的相互作用，从而增加C端结构域的柔性并促进其在催化过程中的构象动态变化[26]。为深入了解突变的结构影响，进行了分子动力学（MD）模拟。N端结构域的均方根偏差（RMSD）……
【数据】筛选转化子数：约10⁶；第一轮最优突变体C1：1.84倍于野生型；第二轮最优突变体C1E1：1.65倍于C1、3.02倍于野生型；C1E1的k_cat提高：4.54倍（4-香豆酸）、3.02倍（CoA）；C1E1对CoA的k_cat/Km提高：7.13倍；突变位点：E339D、E497V
3.4 基因组定向进化提高柚皮素产量
（此部分原文节选中未完整呈现，根据摘要和讨论部分信息：在定向基因组进化中，发现全局调控蛋白DksA的过表达使柚皮素生物合成提高1.95倍。对DksA蛋白的进一步定向进化使柚皮素产量再次翻倍。对突变DksA调控菌株进行了转录组分析，表明细胞稳健性得到改善。最终在摇瓶培养条件下（30°C，72 h）柚皮素产量达到797 mg/L。）
【数据】DksA过表达提升：1.95倍；DksA定向进化后：产量再次翻倍；最终产量：797 mg/L（30°C，72 h，摇瓶）
讨论与解读
本研究成功将定向酶进化和定向基因组进化应用于柚皮素过量生产细胞工厂的工程改造，同时获得了优化的生物合成途径和稳健的宿主菌株。这些进展得益于柚皮素响应型全细胞生物传感器的使用，该传感器在整个进化过程中作为高通量筛选工具。在鉴定出的对柚皮素生物合成产生积极影响的基因组靶标中，dksA成为进一步研究的有前景的候选基因。DksA是一种全局转录调控因子，与全局警报分子鸟苷四磷酸（ppGpp）共同在营养限制条件下（如氨基酸饥饿或氮限制）发挥细菌严谨反应的核心作用。已有研究表明，通过DksA激活严谨反应可显著增强甲醇来源碳向几种限制性氨基酸的生物合成，其机制是将全局转录组重编程至应激适应状态[30]。在大肠杆菌中，dksA表达水平通常因负反馈调控机制[31]而在各生长阶段保持恒定。然而，DksA的过表达已被报道可促进应激诱导的多聚磷酸盐（polyP）合成，通过多种机制（包括蛋白质稳定、金属离子螯合和酶活性调节）保护细胞。
编译者解读
本研究展示了全细胞定向进化策略在天然产物高产中的独特优势——将酶工程与宿主工程统筹于同一筛选平台。基于FdeR的生物传感器设计巧妙，利用转录调控因子的天然配体响应特性实现柚皮素胞内水平的可视化输出，规避了传统HPLC检测通量低的瓶颈。值得关注的是，DksA作为全局调控因子被鉴定为产量提升的关键靶点，提示代谢工程不应局限于途径酶本身，宿主全局调控网络同样蕴藏巨大优化空间。4CL3突变体C1E1的催化效率提升机制（增强CoA亲和力以补偿胞内CoA低浓度）也为其他辅酶依赖型酶的改造提供了可借鉴的思路。本研究的局限在于摇瓶水平的结果与工业规模化生产之间仍存在差距，发酵条件的进一步放大验证将是后续工作的重点。
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.148717