来源：Methanol enhances the transformation of antibiotics by Cyanobacteria (Synechocystis sp.) via a synergistic enzyme-photosynthetic machinery（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗生素作为新兴环境污染物，其在水生态系统中的持续残留已成为全球性挑战。本研究从八种蓝藻中筛选出聚球藻（Synechocystis sp.）作为高效降解菌株，系统比较了甲醇（ME）与二甲基亚砜（DMSO）两种载体溶剂对其去除诺氟沙星（NFX）、环丙沙星（CFX）和磺胺嘧啶（SDZ）能力的影响。研究发现，ME不仅能显著提高三种抗生素的去除效率（NFX: 88.9%；CFX: 97.5%；SDZ: 43.7%），还通过激活代谢酶与光合机制的协同网络加速生物转化过程。该工作为溶剂调控增强蓝藻修复抗生素污染提供了全新策略。
研究背景
抗生素在人类医疗、畜牧养殖、水产养殖和农业中的广泛使用，使其成为普遍存在的环境污染物。2000年至2015年间，全球抗生素消费量增长了65%，若无有效干预，预计到2030年将翻一番。中国每年消耗抗生素15万至20万吨，约占全球消耗量的50%。施用抗生素中30%–90%以未代谢形式排出，通过医疗、工业和养殖废水进入水生态系统。传统污水处理工艺对持久性抗生素（尤其氟喹诺酮类和磺胺类）去除效率有限，导致NFX、CFX和SDZ在地表水中频繁检出，浓度可达μg/L水平。这些抗生素的环境持久性与低效去除技术相结合，构成了严重的生态风险，包括生物累积驱动的营养级传递、水生群落破坏以及水安全和食品安全威胁。当前抗生素去除策略涵盖物理、化学和生物方法，但各有局限。载体溶剂在微藻抗生素修复中的作用长期被简单归结为助溶功能，其潜在生物学效应未获充分认识。
研究方法
2.1 化学试剂
诺氟沙星（NFX，纯度>99.5%）和环丙沙星（CFX，纯度>99.5%）购自TMstandard（中国）。磺胺嘧啶（SDZ，纯度>99.5%）购自Dr. Ehrenstorfer GmbH（德国）。乙腈和甲醇（ME，HPLC级）购自Merk（德国）。二甲基亚砜（DMSO，HPLC级）由Macklin Biochemical Technology（上海，中国）提供。抗生素储备液（50 mg/L）分别以甲醇（ME）或二甲基亚砜（DMSO）作为载体溶剂配制。在后续实验中，载体溶剂的最终浓度设定为1%（v/v），该浓度已被证明对微藻生长无不良影响。用于配制微藻生长培养基的无机盐（如NaNO₃、K₂HPO₄和MgSO₄，分析纯）购自天津大茂化学试剂厂。
【数据】NFX纯度：>99.5%；CFX纯度：>99.5%；SDZ纯度：>99.5%；抗生素储备液浓度：50 mg/L；载体溶剂终浓度：1%（v/v）
2.2 蓝藻培养
使用八种常见淡水蓝藻，即鱼腥藻（Anabaena sp. FACHB-418）、膜状眉藻（Calothrix membranacea FACHB-236）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa FACHB-905）、发菜（Nostoc flagelliforme FACHB-838）、念珠藻（Nostoc sp. FACHB-973）、细颤藻（Oscillatoria tenuis FACHB-1052）、聚球藻（Synechocystis sp. PCC 6803）和聚球藻（Synechococcus sp.）。所有藻种均购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库（中国武汉）。每个藻种在250 mL锥形瓶中培养，瓶内装有150 mL BG11培养基，接种1 mL蓝藻悬液（波长680 nm处的光密度（OD680）为1）。接种前，BG11培养基和锥形瓶均在120°C下高压灭菌20分钟。蓝藻培养条件如下：光照强度3000 lx，12:12小时光暗周期，温度25 ± 1°C，湿度60%。培养期间，锥形瓶定期摇动并重新放置以确保光照均匀。
【数据】培养体积：150 mL BG11培养基/250 mL锥形瓶；接种量：1 mL（OD680=1）；灭菌条件：120°C，20 min；光照强度：3000 lx；光暗周期：12:12 h；温度：25 ± 1°C；湿度：60%
2.3 批量实验
#### 2.3.1 蓝藻筛选与初始浓度优化
初步筛选实验评估了八种蓝藻对NFX（0.5 mg/L）、CFX（0.5 mg/L）和SDZ（0.5 mg/L）的去除能力。每个藻种单独培养于含150 mL无菌BG11培养基的250 mL锥形瓶中，初始OD680值为0.30。所有锥形瓶在2.2节所述条件下培养20天。每两天取样一次以测定培养基中残留抗生素浓度。对三种抗生素均表现出最高去除效率的藻种被选用于后续实验。随后，所选蓝藻的初始生物量在四个梯度（OD680 = 0.03、0.06、0.10和0.30）下进行优化，用于去除分别溶于ME或DMSO的三种目标抗生素（0.5 mg/L）。上限阈值（OD680 = 0.3）的设定策略性地用于预防水华风险，同时保持工艺效率。此外，更高浓度可能引起严重的自遮蔽效应并指数级增加采收成本，使其在环境可持续性和可扩展修复的可操作性方面不可行。所有锥形瓶在2.2节所述条件下的光照培养箱中保持20天。每两天取样一次以监测抗生素去除和蓝藻生长。产生最高抗生素去除效率的生物量水平被选用于后续实验。
【数据】抗生素浓度：0.5 mg/L；初始OD680梯度：0.03、0.06、0.10、0.30；培养时间：20天；取样间隔：每2天
#### 2.3.2 载体溶剂对抗生素去除的影响
使用2.3.1节确定的最佳蓝藻种类和生物量水平，研究了ME和DMSO作为载体溶剂对三种目标抗生素（0.5 mg/L）去除的各自影响。实验在500 mL锥形瓶中进行，瓶内装有400 mL无菌BG11培养基。无蓝藻的非生物对照在黑暗和光照条件下均保持，以评估抗生素通过水解和光解的非生物降解。所有锥形瓶在2.2节所述条件下的光照培养箱中保持20天。每两天取样一次用于抗生素降解动力学分析。实验结束时另取样品用于质量平衡分析、转化产物（TP）鉴定、胞外聚合物（EPS）表征和转录组分析。
【数据】实验体积：400 mL BG11培养基/500 mL锥形瓶；抗生素浓度：0.5 mg/L；培养时间：20天；取样间隔：每2天
2.4 分析方法
#### 2.4.1 蓝藻生长测定
蓝藻生物量使用分光光度计（AOELAB，中国）测定OD680值进行量化。OD680值与微藻细胞密度（10⁶ cells/mL）之间建立了线性相关性，如式(1)所示：
(1) 细胞密度 × 10⁶ cells/mL = 9.6 × OD680 + 1.622，R² = 0.997
微藻的比生长速率（μ，day⁻¹）使用式(2)计算：
(2) μ (day⁻¹) = (1/t) × (ln Nt − ln N0)
其中N0和Nt分别代表时间0和时间t时的细胞密度。
【数据】线性方程：细胞密度（×10⁶ cells/mL）= 9.6 × OD680 + 1.622；R² = 0.997
#### 2.4.2 抗生素去除动力学与机制
每次取样时，收集2 mL蓝藻悬液并以10,000 rpm离心10分钟以分离蓝藻细胞。随后，1 mL上清液通过0.22-μm针头过滤器（ANPEL Laboratory Technologies，中国）过滤，用于分析BG11培养基中残留抗生素浓度。暴露实验结束时，收集50 mL样品以评估蓝藻对抗生素的生物吸附和生物累积。为此，收集的蓝藻细胞沉淀重新悬浮于2 mL蒸馏水中，涡旋2分钟，然后再次以10,000 rpm离心10分钟。所得上清液用于分析抗生素在蓝藻细胞壁上的生物吸附。剩余沉淀用于测定胞内抗生素累积，在−20°C下冷冻以破碎细胞壁，随后用2 mL二氯甲烷：甲醇（1:2，v/v）提取三次，每次超声处理20分钟（40 kHz，2.2 kW）。最终以10,000 rpm离心5分钟后，收集上清液用于定量生物累积的抗生素。去除效率按如下公式计算：
(3) R (%) = (1/C0) × (C0 − Cr − Ca − Cb) × 100%
其中R为微藻的去除效率，C0为时间零时的初始抗生素浓度，Cr为BG11培养基中残留的抗生素浓度，Ca为吸附在蓝藻细胞壁上的抗生素浓度，Cb为蓝藻生物累积的抗生素浓度。基于先前大量关于蓝藻去除抗生素的研究，采用准一级动力学模型分析蓝藻对NFX、CFX和SDZ的去除动力学，使用以下方程：
(4) ln(C0/Ct) = k × t
其中k为准一级动力学速率常数，C0和Ct分别为时间零和t时的抗生素浓度，t为暴露时间。
【数据】离心条件：10,000 rpm，10 min；过滤孔径：0.22 μm；样品体积：2 mL（动力学）/50 mL（质量平衡）；提取溶剂：二氯甲烷:甲醇 = 1:2（v/v）；超声条件：40 kHz，2.2 kW，20 min，3次；最终离心：10,000 rpm，5 min
#### 2.4.3 抗生素及其转化产物的仪器分析
NFX、CFX和SDZ的浓度使用Agilent 1290 Infinity液相色谱系统联用Agilent 6495三重四极杆质谱仪（LC-QQQ-MS，Agilent Technologies，美国）进行定量。对于转化产物（TP）的鉴定，采用Agilent 1290 Infinity系统联用Agilent 6545四极杆飞行时间质谱仪（UPLC-QTOF-MS，Agilent Technologies，美国）。用于分析NFX、CFX、SDZ及其各自TP的色谱和质谱条件详见补充信息（SI；Texts S1和S2）。
【数据】LC-QQQ-MS：Agilent 1290 Infinity + Agilent 6495；UPLC-QTOF-MS：Agilent 1290 Infinity + Agilent 6545
#### 2.4.4 抗生素毒性预测
（原文此节内容在节选部分未完整呈现）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 蓝藻物种筛选
八种藻类对NFX、CFX和SDZ的去除能力如图S2所示。三种抗生素的去除效率存在显著差异，NFX范围为0%至73.40%，CFX范围为0%至72.61%，SDZ范围为0%至14.73%。这些去除效率取决于蓝藻物种和抗生素的具体性质。值得注意的是，发菜（Nostoc flagelliforme）对NFX和CFX均未表现出可检测的去除能力，而聚球藻（Synechocystis sp.）对NFX和CFX实现了最高去除效率，分别为73.40%和72.61%。相比之下，所有测试物种对SDZ的去除效率普遍较低，其中聚球藻（Synechocystis sp.）再次表现出最佳性能。先前研究已强调聚球藻（Synechocystis sp.）在降解多种有机污染物方面的潜力。例如，该藻在144小时内完全去除了初始浓度为492.8 mg/L的苯酚，突显了其处理苯酚污染废水的效力。关于聚球藻（Synechocystis sp.）去除药物化合物的研究表明，该属主要依赖生物吸附去除甲硝唑，效率为80%，而生物降解是去除瑞舒伐他汀和磷酸可待因的主要机制，效率接近100%。基于这些发现，本研究选择聚球藻（Synechocystis sp.）进行后续实验。
【数据】NFX去除效率范围：0%–73.40%；CFX去除效率范围：0%–72.61%；SDZ去除效率范围：0%–14.73%；聚球藻对NFX去除率：73.40%；聚球藻对CFX去除率：72.61%；苯酚初始浓度：492.8 mg/L，144 h完全去除；甲硝唑去除效率：80%（生物吸附）
3.2 初始蓝藻生物量优化
本实验旨在优化聚球藻（Synechocystis sp.）的初始生物量。设置了四个实验组，初始OD680分别为0.03、0.06、0.10和0.30。如图1所示，当使用ME或DMSO作为载体溶剂时，NFX、CFX和SDZ的去除效率与聚球藻（Synechocystis sp.）的初始生物量呈正相关。当使用ME作为载体溶剂时，NFX的去除效率保持在90%以上，CFX的范围为41.27%至97.48%，SDZ的范围为12.30%至43.67%。类似地，当使用DMSO作为载体溶剂时，去除效率随OD680增加而提高：NFX范围为67.50%至86.37%，CFX范围为47.32%至57.29%，SDZ范围为3.40%至11.50%。三种抗生素的最高去除率均在初始生物量OD680为0.30时观察到。这一发现不同于先前关于绿藻（C. vulgaris）去除左氧氟沙星的研究结果，表明这些差异可归因于不同微藻物种的组成和结构差异。此外，所有处理组的蓝藻细胞密度随时间逐渐增加，并与初始生物量呈正相关（图S3）。综合考虑去除效率和聚球藻（Synechocystis sp.）的可持续生长，选择OD680为0.30用于后续实验。
【数据】ME组NFX去除率：>90%；ME组CFX去除率：41.27%–97.48%；ME组SDZ去除率：12.30%–43.67%；DMSO组NFX去除率：67.50%–86.37%；DMSO组CFX去除率：47.32%–57.29%；DMSO组SDZ去除率：3.40%–11.50%；最优初始OD680：0.30
3.3 蓝藻生长变化
图2展示了以ME或DMSO作为载体溶剂时，聚球藻（Synechocystis sp.）在抗生素暴露下的细胞密度和比生长速率变化。在所有实验组中，细胞密度随暴露时间增加而增加。值得注意的是，在整个暴露期间，ME组的细胞密度始终高于DMSO组。到20天暴露期结束时，所有ME组的细胞密度均显著高于相应的DMSO组，增加幅度为1.13至1.33倍。类似地，ME处理组的比生长速率始终高于DMSO组。这些发现与先前研究一致。例如，Choi等人证明ME可作为碳源促进小球藻（Chlorella sp.）的生长，在添加0.1%（v/v）时使微藻生物量增加了2.3倍。Navakoudis等人也报道，ME在0.5%（v/v）浓度下显著增加了斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）的生物量。观察到的微藻生物量增加可能归因于ME代谢过程中产生甲酸盐作为中间产物，该物质可保护光合结构免受光抑制。
【数据】ME组细胞密度增加：DMSO组的1.13–1.33倍；文献参考：ME 0.1%（v/v）使小球藻生物量增加2.3倍；ME 0.5%（v/v）显著增加斜生栅藻生物量
3.4 抗生素去除动力学
由于SDZ的去除效率显著偏低，准一级动力学模型被认为不适用于该抗生素。因此，动力学分析仅对NFX和CFX处理组进行。如表1所示，所有实验组均对准一级动力学模型表现出满意的拟合，R²值超过0.9。与DMSO组相比，ME组中NFX和CFX的反应速率常数（k）分别增加了3.55倍和5.52倍。相应地，半衰期（t₁/₂）从NFX的6.84天缩短至1.92天，从CFX的10.97天缩短至1.99天。ME作为微藻共代谢的重要碳源，可能通过作为蓝藻的共代谢底物来增强抗生素去除。然而，ME和DMSO影响聚球藻（Synechocystis sp.）去除NFX、CFX和SDZ的具体机制仍需进一步研究。
为深入了解聚球藻（Synechocystis sp.）去除NFX、CFX和SDZ的机制，进行了质量平衡分析以量化生物吸附、生物累积、生物转化和非生物过程的贡献。如表2所示，ME组中NFX、CFX和SDZ的去除效率分别是DMSO组的4.26倍、2.52倍和3.76倍。在非生物过程、生物吸附和生物累积方面，ME组和DMSO组之间未观察到显著差异。在ME组和DMSO组中，非生物过程对三种抗生素去除的贡献极小，表明聚球藻（Synechocystis sp.）介导的生物过程主要负责抗生素去除。此外，在ME和DMSO组中，通过生物吸附和生物累积去除的NFX、CFX和SDZ比例均显著低于通过生物转化去除的比例，表明生物转化是主要机制。这些发现与先前研究一致，其中生物转化占聚球藻（Synechococcus sp.）去除CFX的62.41%和铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）去除四环素的71.6%。与DMSO相比，ME将聚球藻（Synechocystis sp.）对NFX、CFX和SDZ的生物转化分别显著增强了8.48倍、2.89倍和4.59倍。
【数据】NFX动力学：ME组k为DMSO组3.55倍，t₁/₂从6.84天降至1.92天；CFX动力学：ME组k为DMSO组5.52倍，t₁/₂从10.97天降至1.99天；R²均>0.9；ME组去除效率倍数：NFX 4.26倍，CFX 2.52倍，SDZ 3.76倍；生物转化增强倍数：NFX 8.48倍，CFX 2.89倍，SDZ 4.59倍；文献参考：CFX生物转化占62.41%，四环素生物转化占71.6%
3.5 EPS和CYP450酶的变化
本研究初步揭示了抗生素和载体溶剂对聚球藻（Synechocystis sp.）中EPS的影响（图3）。微藻通常在碳源代谢过程中分泌EPS——主要是蛋白质和多糖基质。如图3a和b所示，ME组的EPS产量显著高于DMSO组，胞外蛋白和多糖水平分别增加了1.86至2.50倍和1.08至2.54倍。这种增强的EPS产量可能作为应对环境胁迫的防御机制，其中胞外蛋白和多糖减轻细胞损伤，而碳源通常刺激EPS生物合成。与先前发现一致，Vo等人在3.5%盐度胁迫下观察到ME促进了小球藻（Chlorella sp.）的EPS分泌，与对照组相比EPS含量增加了2倍。值得注意的是，虽然ME未显著改变B-EPS，但大幅提升了S-EPS水平，表明S-EPS是促进EPS增强的主要组分。
【数据】胞外蛋白增加：1.86–2.50倍；胞外多糖增加：1.08–2.54倍；文献参考：ME在3.5%盐度胁迫下使小球藻EPS含量增加2倍
讨论与解读
本研究从八种蓝藻中鉴定出聚球藻（Synechocystis sp.）为去除NFX、CFX和SDZ的最佳生物催化剂。ME在提高去除效率、加快反应动力学（k）和缩短半衰期（t₁/₂）方面展现出对DMSO的明显优势。生物转化是主要去除机制，产生依赖于溶剂的转化产物谱，且在ME处理下显著放大且生态毒性可忽略。机制上，ME共代谢激活了协同的酶-光合网络，同时增强了抗生素跨膜内流、光捕获效率、催化酶表达和EPS分泌。这些发现为溶剂增强的蓝藻生物修复提供了坚实基础。在实际工程部署方面，研究提出将该技术应用于受控环境，如处理后的废水抛光塘或特定生物膜反应器，其中蓝藻可维持为优势物种。从实验室走向工程实际，还需研究：溶剂的组合效应（包括潜在协同或拮抗作用）；可变废水基质（特别是pH）对系统性能和稳定性的影响；溶剂残留的生态系统水平生态风险；以及技术经济可行性。
编译者解读：该研究巧妙地将载体溶剂从"惰性助溶剂"重新定义为"代谢调控因子"，发现了甲醇作为共代谢底物激活蓝藻酶-光合协同网络的独特机制。这一视角转换对合成生物学应用具有启发意义——在构建工程蓝藻降解系统时，溶剂选择不仅是溶解性问题，更可能成为调控代谢通路的低成本策略。不过，ME组SDZ去除率仅43.7%，且实验均在理想实验室条件下完成，距实际废水应用仍有距离。后续若能将溶剂调控与代谢工程改造相结合，有望进一步提升蓝藻修复系统的效率与稳定性。
参考来源
Xie, F. (2025). Methanol enhances the transformation of antibiotics by Cyanobacteria (Synechocystis sp.) via a synergistic enzyme-photosynthetic machinery. Chemical Engineering Journal. DOI: 10.1016/j.cej.2025.170802
DOI: 10.1016/j.cej.2025.170802