来源：In situ directed evolution of γ-glutamyl kinase in Corynebacterium glutamicum S9114 by innovative EvolvR-mediated mutagenesis and rare codon-based selection to increase L-proline production（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-脯氨酸在农业、饲料、食品和医药行业应用广泛，全球市场规模预计2026年将达24亿元人民币。本研究针对工业谷氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌S9114，开发了适配的EvolvR介导诱变系统，将融合蛋白enCas9-PolI5M整合入基因组实现靶基因原位多样化；同时构建了基于稀有密码子CCC的LacZ-CmR融合蛋白筛选系统，二者联用对编码γ-谷氨酰激酶（GK）的proB基因进行定向进化，获得三突变体GKE74K/G149K/V150M，最终菌株Pro-7在5-L发酵罐中L-脯氨酸产量达94.2 g/L，产率0.316 g/g。
研究背景
L-脯氨酸虽属生物体非必需氨基酸，却在农业、饲料、食品及制药领域用途广泛。据中国报告大厅数据，2022年全球L-脯氨酸市场价值约15亿元人民币，预计2026年将达24亿元，复合年增长率5.2%。生物体内L-脯氨酸合成有四条途径，细菌中典型途径是由L-谷氨酸经三步酶促反应（γ-谷氨酰激酶GK/proB、谷氨酸-5-半醛脱氢酶GSADH/proA、吡咯啉-5-羧酸还原酶P5CR/proC）加一步自发反应完成。谷氨酸棒杆菌是微生物发酵生产L-脯氨酸的主力菌株，其基因组中含有proBAC及ocd等L-脯氨酸合成相关基因，但内源途径以L-谷氨酸为起点。为提高L-脯氨酸产量，研究者已尝试多种策略，但关键酶GK受L-脯氨酸反馈抑制是核心瓶颈之一。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究所用菌株列于补充数据1。亲本菌株谷氨酸棒杆菌S9114是中国工业L-谷氨酸超高产菌株，保藏于本实验室。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别培养于Luria-Bertani（LB）肉汤和LBG肉汤（LB补充5 g/L葡萄糖）。谷氨酸棒杆菌感受态细胞制备及重组菌株再生参照van der Rest等方法。摇瓶分批培养在500-mL摇瓶中进行，每瓶含30 mL培养基A，30°C、100 rpm（往复摇床）。培养基A组成（每升）：120 g葡萄糖、20 g豆粕水解液（玉宝生物科技有限公司）、10 g玉米浆粉（安琪酵母股份有限公司）、35 g (NH4)2SO4、1.0 g KH2SO4、0.5 g MgSO4∙7H2O、0.01 g FeSO4、0.01 g MnSO4、0.01 g ZnSO4、300 μg硫胺素-HCl、100 μg生物素和40 g CaCO3，pH 7.2–7.5。
补料分批发酵在5-L发酵罐（BLBio-5GJ-2-H，上海百仑生物科技有限公司）中进行，装液量1 L培养基B，接种量10%（v/v），种子液培养至∆OD562 = 0.45–0.50（25倍稀释后测定）。种子培养基C组成（每升）：30 g葡萄糖、20 g玉米浆粉、10 g豆粕水解液、5 g (NH4)2SO4、1 g KH2SO4、0.5 g MgSO4∙7H2O、0.01 g FeSO4、0.01 g ZnSO4、100 μg硫胺素-HCl、100 μg生物素和10 g CaCO3。培养基B组成（每升）：60 g葡萄糖、20 g豆粕水解液、15 g玉米浆粉、25 g (NH4)2SO4、1.0 g KH2SO4、0.5 g MgSO4∙7H2O、0.01 g FeSO4、0.01 g MnSO4、0.01 g ZnSO4、300 μg硫胺素-HCl、100 μg生物素和0.1 g消泡剂。发酵方法参照Zhang等。通过补加氨水维持pH 7.0，夹套冷却维持温度30°C。通过自动补加无菌600 g/L葡萄糖维持残糖浓度5–10 g/L。
【数据】培养基A：120 g/L葡萄糖、35 g/L (NH4)2SO4、pH 7.2–7.5；培养基B：60 g/L葡萄糖、25 g/L (NH4)2SO4；培养条件：30°C、100 rpm；发酵罐：5-L，装液1 L，接种量10%；pH 7.0；残糖：5–10 g/L；种子OD562：0.45–0.50
2.2 质粒构建与谷氨酸棒杆菌重组菌株构建
本研究所用质粒和引物分别列于补充数据2。使用Ezup细菌基因组DNA提取试剂盒（Vazyme，南京）从谷氨酸棒杆菌S9114提取染色体DNA。目的基因片段使用2×Phanta Master Mix（Vazyme，南京）从相应DNA模板扩增。质粒构建和转化参照Xu等，详细过程见补充数据2。基因整合至谷氨酸棒杆菌染色体参照Xu等报道的方法。本研究使用更新版EvolvR系统对谷氨酸棒杆菌S9114基因组中编码GK的proB基因进行多样化。融合蛋白enCas9-PolI5M作为EvolvR系统的关键元件，被整合至谷氨酸棒杆菌S9114基因组，获得谷氨酸棒杆菌QE-7。同时，抗生素抗性蛋白（AmpR、KanR、SpecR和CmR）及融合蛋白LacZ-CmR及其含稀有密码子的突变型作为筛选标记蛋白，分别整合至谷氨酸棒杆菌QE-7基因组。随后，该更新版EvolvR系统用于对谷氨酸棒杆菌S9114基因组中proB进行多样化，操作参照此前报道。
【数据】EvolvR系统元件：enCas9-PolI5M融合蛋白；整合位点：谷氨酸棒杆菌S9114基因组；标记蛋白：AmpR、KanR、SpecR、CmR、LacZ-CmR；菌株：QE-7
2.3 稀有密码子引入
基于Refseq数据库的蛋白质编码序列，计算了大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌基因组中L-脯氨酸的密码子使用频率。选用稀有密码子CCC用于筛选谷氨酸棒杆菌L-脯氨酸高产菌株。所有被CCC替换的筛选标记蛋白编码基因由GENEWIZ公司（苏州）合成。
【数据】稀有密码子：CCC；基因合成：GENEWIZ，Inc.（苏州）
2.4 基于稀有密码子筛选系统筛选GK突变体
筛选标记蛋白编码基因整合至谷氨酸棒杆菌QE-7。经更新版EvolvR系统定向进化后，随机挑取菌落，接种于10 mL 0.3×CGIII培养基或含25 mg/L氯霉素的培养基A中，30°C、100 rpm摇床培养。每隔2或4小时监测OD562。为检测稀有密码子筛选系统效率，携带不同标记蛋白的重组菌株分别接种于10 mL含不同浓度L-脯氨酸（0 g/L至2.0 g/L）的0.3×CGIII培养基中培养。具体操作模式参照Zheng等此前的描述。
【数据】筛选培养基：0.3×CGIII或含25 mg/L氯霉素的培养基A；L-脯氨酸浓度梯度：0–2.0 g/L；培养条件：30°C、100 rpm；检测：OD562每2或4小时
2.5 蛋白表达与纯化
携带目标proB基因及其变体的pET28a介导重组大肠杆菌细胞接种于10 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C、100 rpm培养12小时。过表达操作参照此前报道。培养物经4500 ×g离心收集菌体，超声破碎（Sonics & Materials, Inc.，康涅狄格州，美国），上清液纯化参照Long等此前描述。SDS-PAGE用于分析GK的表达及纯度。
【数据】表达宿主：大肠杆菌/pET28a；卡那霉素：50 µg/mL；培养：37°C、100 rpm、12 h；离心：4500 ×g；破碎：超声
2.6 酶活测定
GK活性测定参照Sekine等报道的方法。一个GK活性单位定义为每分钟产生1 μmol γ-谷氨酰羟肟酸所需的酶量。蛋白浓度使用Bradford蛋白定量试剂盒（Vazyme，南京）测定，以牛血清白蛋白为标准。GK及其变体对L-脯氨酸的敏感性通过将L-脯氨酸浓度从0变化至500 mmol/L进行分析。
【数据】酶活单位：1 μmol γ-谷氨酰羟肟酸/min；L-脯氨酸浓度：0–500 mmol/L；蛋白定量：Bradford法
2.7 结构与分子动力学分析
GK及其突变体的晶体结构以大肠杆菌GK晶体结构（PDB ID: 2J5T）为模板，使用Discovery Studio 2018软件构建，其中大肠杆菌GK与谷氨酸棒杆菌GK的覆盖率为93%，同一性为38.11%。L-谷氨酸和L-脯氨酸的对接使用Discovery Studio 2018软件完成。GK复合物的分子动力学模拟使用AMBER18分析。体系用抗衡离子（Na+和Cl−）中和，并以TIP3P水分子溶剂化于周期十二面体盒中，缓冲距离12 Å。每个体系使用最速下降法进行能量最小化以消除不合理的原子接触。随后，体系温度从0 K缓慢升至330 K，在330 K下经NVT系综处理500 ps，随后NPT系综处理500 ps。然后进行50 ns分子动力学模拟用于数据收集，步长2 fs。从MD轨迹中每5 ps间隔提取数据。RMSD和RMSF使用AMBER18中的CPPTRAJ模块分析，POVME 3.0用于计算酶中的口袋。结合自由能使用分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）方法计算。
【数据】模板：PDB ID 2J5T；覆盖率：93%；同一性：38.11%；溶剂：TIP3P水；缓冲距离：12 Å；温度：0→330 K；NVT：500 ps；NPT：500 ps；MD：50 ns、2 fs步长；数据间隔：5 ps；结合自由能：MM-PBSA
2.8 统计分析
本研究中所有实验均独立进行至少三次。数据以平均值±标准差（±SD）表示，使用Microsoft Excel中的STDEV函数计算。学生t检验用于比较实验数据组间的统计差异，显著性水平设为P < 0.05。
【数据】重复次数：≥3；显著性阈值：P < 0.05
研究结果
3.1 基于EvolvR系统的创新定向进化策略在谷氨酸棒杆菌中的开发
Halperin等报道的EvolvR系统可利用两个质粒在可调窗口内持续多样化靶基因，其中一个质粒（pEvolvR）携带切口变体Cas9（nCas9/enCas9）与易错DNA聚合酶I（PolI3M/PolI5M）的融合蛋白及单链引导RNA（sgRNA），另一个质粒（pTarget）携带靶基因。该系统已被证明在大肠杆菌、酿酒酵母和植物中多样化用户定义基因组位点最为有效。为验证EvolvR系统在谷氨酸棒杆菌中的有效性，本研究开发了适配谷氨酸棒杆菌的EvolvR系统。为此，实验以两种模型进行：融合蛋白enCas9-PolI5M由质粒表达（即质粒介导模型，所得菌株为谷氨酸棒杆菌S9114/pCgEvolvR），以及融合蛋白enCas9-PolI5M整合至谷氨酸棒杆菌putA基因位点（即整合介导模型，所得菌株为谷氨酸棒杆菌QE-7）（图2a）。上述模型用于测试使用质粒pgRNA1（即带有靶向crtEb的gRNA的pgRNA1）在24小时培养中对谷氨酸棒杆菌S9114内源基因（即crtEb）的突变能力。高通量靶向扩增子测序表明，靶基因crtEb在切口位点3'端<20个核苷酸窗口内积累了替换（图2b），这与Halperin等此前报道的结果一致，原因在于内源3'-至-5'核酸外切酶和DNA聚合酶I（PolI）的酶学特性。值得注意的是，这两种模型在诱变窗口长度和替换频率方面表现出相似的模式（图2b）。然而，整合介导模型中替换核苷酸的分布比质粒介导模型更均匀（图2c）。转化子的表型也表明上述模型能够突变谷氨酸棒杆菌中的靶基因，其中转化子表现出不同的菌落颜色（图S1）。
为灵敏定量该更新版EvolvR系统在谷氨酸棒杆菌中的突变率，使用四环素抗性筛选系统进行了波动分析。将tetA基因整合至谷氨酸棒杆菌QE-7和谷氨酸棒杆菌S9114的crtYe基因位点，获得菌株谷氨酸棒杆菌QE-7 ΔcrtYe::tetA和谷氨酸棒杆菌S9114 ΔcrtYe::tetA。tetA是带有无义突变的四环素抗性基因。随后，将质粒pgRNA2（即带有靶向tetA的gRNA的pgRNA2）分别转化至谷氨酸棒杆菌QE-7 ΔcrtYe::tetA或携带pCgEvolvR的谷氨酸棒杆菌S9114 ΔcrtYe::tetA（即谷氨酸棒杆菌S9114D）（图2d）。作为对照，将无效gRNA1转化至谷氨酸棒杆菌QE-7 ΔcrtYe::tetA和谷氨酸棒杆菌S9114D，其中基因crtEb编码谷氨酸棒杆菌中的番茄红素延伸酶。突变率（包括全局突变率和靶向突变率）按照Halperin等此前的描述测定。从图2e可以看出，携带质粒介导或非质粒介导EvolvR系统的细胞均表现出高于原始菌株的突变率。这些结果表明，表达enCas9-PolI5M显著提高了靶位点的突变率（较野生型菌株≥930,000倍）和全局突变率（较野生型菌株约200倍）（图2e）。这些结果与先前在大肠杆菌和酿酒酵母中报道的值一致。值得注意的是，非质粒介导的enCas9-PolI5M表达比质粒介导的enCas9-PolI5M表达表现出更高的突变率，尤其是靶向突变率（8.6×10⁻⁴对2.7×10⁻⁴每核苷酸每代突变）（图2e），这可能归因于Cas9的毒性。此外，非质粒介导的EvolvR系统与质粒介导的EvolvR系统相比，表现出更多的转化子和更低的脱靶突变（数据未显示），表明非质粒介导的EvolvR系统更有利于构建突变文库。相比之下，仅表达PolI5M、nCas9或enCas9的靶向突变率显著较低。这些结果与先前结果相似，因为PolI5M和enCas9是EvolvR介导诱变的必需元件。有趣的是，表达融合蛋白enCas9-PolI5M的菌株的靶向突变率明显高于表达融合蛋白nCas9-PolI5M的菌株（图2e）。nCas9是来自酿脓链球菌的Cas9，带有D10A突变，切割与gRNA互补的链，而enCas9除D10A外还带有三个额外突变（即K810A、R1003A和R1060A），可增加Cas9的特异性DNA亲和力。这些可以解释为何表达融合蛋白enCas9-PolI5M表现出更高的靶向突变率。总之，整合介导的EvolvR系统（即将融合蛋白enCas9-PolI5M整合至谷氨酸棒杆菌基因组）在谷氨酸棒杆菌中有功能且表现出更高的靶向突变率，可作为多样化谷氨酸棒杆菌基因组靶基因的有效策略。
【数据】诱变窗口：切口位点3'端<20 nt；靶向突变率提升：≥930,000倍（vs野生型）；全局突变率提升：~200倍；整合介导靶向突变率：8.6×10⁻⁴/nt/代；质粒介导靶向突变率：2.7×10⁻⁴/nt/代；培养时间：24 h
3.2 基于稀有密码子的高效筛选系统在谷氨酸棒杆菌S9114中的构建
众所周知，由于tRNA丰度和GC含量的差异，生物体在编码同义密码子中的同一氨基酸时倾向于优先使用某些密码子。利用富含稀有密码子的标记从随机突变文库中筛选氨基酸高产菌株已有报道，其中缺乏带电稀有tRNA导致的稀有密码子翻译中断可部分通过增加细胞内相应氨基酸水平来恢复。受此启发，本研究采用基于稀有密码子的筛选系统来开发L-脯氨酸高产菌株。编码L-脯氨酸的密码子有四种，即CCA、CCC、CCG和CCT。然而，与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌表现出更均衡的密码子使用（图3a）。在谷氨酸棒杆菌中，CCC的使用频率最低，为9.7‰，被用于替换原有的L-脯氨酸密码子。基于稀有密码子富集的抗生素抗性基因筛选系统已被证明可有效开发大肠杆菌、粘质沙雷氏菌和谷氨酸棒杆菌的L-脯氨酸高产菌株。然而，抗生素抗性基因（即ampR、kanR、cmR和tetAR）长度不超过1300 bp，根据DNA序列推断编码不超过十六个L-脯氨酸残基（图3b）。当抗生素抗性基因原有的L-脯氨酸密码子完全被L-脯氨酸稀有密码子（即CCC）替换时，与野生型抗生素抗性基因相比，细胞密度并未明显下降（图3b和图S2）。这些结果表明，现有的抗生素抗性基因因L-脯氨酸稀有密码子数量少而难以用于构建L-脯氨酸筛选系统。
为解决上述问题，应在筛选标记基因中引入更多L-脯氨酸稀有密码子。为此，本研究构建了融合蛋白LacZ-CmR，其中LacZ-CmR编码基因lacZ-cmR中有六十九个L-脯氨酸密码子（图3c）。为研究融合基因lacZ-cmR是否基于L-脯氨酸稀有密码子有效，由GENEWIZ公司（苏州）合成了一系列具有梯度稀有密码子替换频率的lacZ-cmR基因，所得基因……
【数据】CCC使用频率：9.7‰（谷氨酸棒杆菌）；抗生素抗性基因长度：≤1300 bp；L-脯氨酸残基数：≤16个；LacZ-CmR中L-脯氨酸密码子数：69个
3.3 通过proB基因组多样化进化与筛选定制菌株文库
（注：原文该部分后续内容未在节选中完整呈现，以下为可获取内容的忠实翻译）
通过将靶向proB不同位置（约10⁶）的一系列gRNA质粒文库共转化至谷氨酸棒杆菌QE-8菌株中，对定制菌株文库进行进化与筛选。工作流程如图4a所示。经EvolvR介导诱变后，使用基于稀有密码子的筛选系统富集L-脯氨酸高产菌株。通过该策略，获得了携带最优GK变体的L-脯氨酸高产菌株。
【数据】gRNA文库规模：~10⁶；靶基因：proB；宿主菌株：谷氨酸棒杆菌QE-8
3.4 5-L发酵罐发酵性能
5-L发酵罐中谷氨酸棒杆菌S9114和谷氨酸棒杆菌Pro-7的发酵性能如图5所示。对于谷氨酸棒杆菌S9114，无菌葡萄糖在12小时开始补加以维持葡萄糖浓度约5 g/L（图5a）。对于谷氨酸棒杆菌Pro-7，无菌葡萄糖在10小时开始补加以维持葡萄糖浓度约5 g/L（图5b）。数据显示为平均值±标准差。
【数据】补糖时间：S9114为12 h，Pro-7为10 h；维持葡萄糖：~5 g/L
3.5 谷氨酸棒杆菌GK的表达与生化表征
谷氨酸棒杆菌GK野生型（WT）及突变体的SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）分析如图6a所示。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：对照；泳道2：WT；泳道3：GKE74K；泳道4：GKG149K；泳道5：GKV150N；泳道6：GKV150M。三突变体GKE74K/G149K/V150M被鉴定具有高底物亲和力和催化效率，可用于L-脯氨酸生产。
【数据】SDS-PAGE：10%聚丙烯酰胺；突变体：E74K、G149K、V150N、V150M
3.6 GKWT与GKE74K/G149K/V150M的分子动力学模拟
GKWT（a）和GKE74K/G149K/V150M（b）在反应前状态的L-谷氨酸结合口袋如图7所示。GKWT和GKE74K/G149K/V150M以表面模型显示。底物L-谷氨酸以绿色棍状显示。GKWT与底物间的相互作用分析如图7所示。
【数据】模拟体系：GKWT与GKE74K/G149K/V150M；底物：L-谷氨酸；状态：反应前
3.7 菌株Pro-7 L-脯氨酸产量提高的分子机制
菌株S9114、S9114-1和Pro-7之间的细胞密度差异（a）和氨基酸积累差异（b）如图8所示。这些菌株在含30 mL培养基A的500-mL摇瓶中培养。OD562、L-脯氨酸和L-谷氨酸浓度均被测定。结果表明，除GK外，ATP和NADPH供应也是L-脯氨酸生物合成的关键因素。
【数据】培养体系：500-mL摇瓶、30 mL培养基A；检测指标：OD562、L-脯氨酸、L-谷氨酸
讨论与解读
本研究聚焦于优化并联合使用EvolvR介导诱变与稀有密码子筛选系统，对L-谷氨酸超高产菌株谷氨酸棒杆菌S9114中编码GK的proB基因进行原位定向进化以提高L-脯氨酸产量。首先开发了适配谷氨酸棒杆菌的EvolvR系统，将融合蛋白enCas9-PolI5M整合至基因组，该系统在谷氨酸棒杆菌中有功能且表现出更高的靶向突变率。随后构建了含69个L-脯氨酸密码子的融合蛋白LacZ-CmR高效稀有密码子筛选系统，因LacZ-CmR-RCs整合入基因组，其将受L-脯氨酸稀有密码子频率的严格控制。最终通过上述EvolvR介导诱变和稀有密码子筛选系统获得L-脯氨酸高产菌株Pro-7，在5-L发酵罐中48小时产量达94.2 ± 5.6 g/L，生产强度1.96 g/(L·h)，产率0.316 g/g。虽然本研究L-脯氨酸产率略高于此前报道，但最终滴度和生产强度低于Liu等最新数据。因此，后续工作将着力增强葡萄糖消耗和呼吸速率，减少L-脯氨酸的分解代谢，例如敲除L-脯氨酸输入蛋白（ProP等）。
【编译者解读】该研究的技术亮点在于将EvolvR系统从质粒介导升级为基因组整合介导，不仅消除了Cas9毒性带来的突变偏好，还使靶向突变率提升至8.6×10⁻⁴/nt/代，较野生型提高约六个数量级。稀有密码子筛选策略巧妙地将"目标产物浓度"与"细胞存活"耦联，避免了高通量孔板筛选的繁琐。但需注意，Pro-7的产率（0.316 g/g）虽略优，总滴度仍低于同期最优报道，提示GK去反馈抑制并非L-脯氨酸合成的唯一瓶颈——ATP与NADPH供应同样关键，这为后续多靶点协同进化指明了方向。该策略对谷氨酸棒杆菌中其他氨基酸产物的菌株改造具有直接借鉴价值。
DOI: 10.1016/j.bej.2025.109982