来源：Metabolic engineering Corynebacterium glutamicum for production of γ-aminobutyric acid by glutamate decarboxylase active at near-neutral pH and displaying at cell surface（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
γ-氨基丁酸（GABA）在医药、食品和饲料领域应用广泛。谷氨酸棒杆菌可利用自产L-谷氨酸表达外源谷氨酸脱羧酶（GAD）合成GABA，但细胞生长最适pH（7.0–7.5）与GAD最适pH（4.0–5.0）之间的矛盾严重制约了产量。本研究筛选了近中性pH活性的LsGAD，通过表面展示技术将GAD锚定于细胞表面，结合染色体整合多拷贝gad基因及代谢途径改造，最终在2.4-L生物反应器中实现42.3 g/L GABA产量。
研究背景
GABA是一种非蛋白氨基酸，广泛存在于植物、动物和微生物中。在植物中，GABA能有效调节植物对高温、盐胁迫和活性氧等非生物胁迫的耐受性；在哺乳动物中，GABA是主要抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇静、利尿和镇痛等生理功能；在微生物中，GABA参与酸耐受机制，并可作为碳源和/或氮源。凭借丰富的功能，GABA在畜牧业中可改善畜禽生产性能、调节激素分泌、增强免疫系统和缓解热应激；在人类健康领域可作为药物成分缓解压力、焦虑和抑郁，改善睡眠，治疗运动障碍和降低血压。此外，GABA还可用于合成可生物降解的聚酰胺4。为满足GABA需求，已有植物富集、化学合成等多种合成方法的研究报道。
谷氨酸棒杆菌表达外源gad基因可从葡萄糖利用自产L-谷氨酸合成GABA，然而细胞生长最适pH（7.0–7.5）与GAD最适pH（4.0–5.0）之间的不匹配严重制约了GABA的生产。本研究旨在通过筛选近中性pH活性的GAD、表面展示技术及代谢途径改造，解决这一矛盾并提高GABA产量。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株和质粒见表1。E. coli JM109作为质粒构建宿主。谷氨酸棒杆菌ATCC13032及其pknG敲除菌株GSL-3（本实验室前期构建）作为GABA生产的初始菌株。E. coli在LB培养基（5 g/L NaCl、5 g/L胰蛋白胨和2.5 g/L酵母提取物）中37°C培养。谷氨酸棒杆菌在LBB培养基（5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl和18.5 g/L脑心浸液）中30°C培养。根据需要添加适当抗生素。
【数据】培养基：LB（5 g/L NaCl、5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物）、LBB（5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、18.5 g/L脑心浸液）；温度：E. coli 37°C，C. glutamicum 30°C
2.2 gad表达质粒和菌株的构建
本研究所用菌株和质粒见表1，构建质粒所用引物见补充表1。为缓解细胞生长所需pH与GABA生产所需pH之间的冲突，合成了几种近中性pH活性的GAD基因，即L. senmaizukei gad（Lsgad）、L. lactis CICC20209 gad（Llgad）、B. megaterium gad（Bmgad）和E. coli gad E89Q/Δ452–466突变体（Ecgadm），经扩增后通过一步克隆插入经酶切的pJYW-5载体，分别获得质粒p5-Lsgad、p5-Llgad、p5-Bmgad和p5-Ecgadm。将质粒p5-gadB2 [35]和上述四个质粒分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032，生成五株菌GSL-1A–GSL-1E。
为使GAD在更有利的酸性胞外环境中发挥作用，从谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中扩增了五种不同的锚定基序NCgl1337S、NCgl1221ΔC、porH、NCgl1307和NCgl2775，分别与Lsgad融合并插入经酶切的pJYW-5载体，构建了五种不同的表面展示质粒p5-37S-gad、p5-21ΔC-gad、p5-porHL-gad、p5-07L-gad和p5-75-gad。将这五种表面展示质粒分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032，生成五株菌GSL-2A–GSL-2E。
谷氨酸棒杆菌的基因组编辑基于pBluescript II SK (+)/pDTW109系统 [36]或pCS(1)辅助的pK18mobsacB系统 [37]进行。为阻断GABA的摄取，将gabP缺失质粒pSYN2 [28]转化至菌株GSL-3，经同源重组、Cre-loxP位点特异性重组和cre质粒消除后，获得gabP缺失菌株GSL-4。
为减弱丙酮酸衍生物副产物的合成并促进GABA生产、阻断GABA降解，随后在GSL-4的染色体中整合了多个gad基因并替换了靶基因。首先，为敲除ldhA-pyk2基因并在ldhA-pyk2位点敲入gadB2-gadB1 mut，从质粒pJYW-5-R4a-gadB2-R4a-gadB1 mut [35]中扩增gadB2-gadB1 mut，并与ldhA-pyk2基因的上下游同源片段（ldhAU和pyk2D）重叠。将重叠片段插入经酶切的pK18mobsacB中获得pK18-ΔldhA-pyk2::B2-B1 m。将该编辑质粒转化至GSL-4，经单交换、CRISPR-Cpf1质粒pCS(1)辅助的双交换和pCS(1)消除后，获得菌株GSL-5。随后，按上述类似方法构建质粒pK18-ΔgabTD::Lsgad和pK18-ΔpoxB::Bmgad，分别转化至菌株GSL-5，编辑后获得ΔgabTD::Lsgad菌株GSL-6和ΔpoxB::Bmgad菌株GSL-7。最后，将质粒p5-Lsgad转化至菌株GSL-4，获得菌株GSL-4A。
为研究胞内和胞外GAD协同作用对GABA生产的效率，将质粒p5-Lsgad、p5-porHL-gad和p5-07L-gad分别转化至菌株GSL-6，获得菌株GSL-6A、GSL-6B和GSL-6C。
【数据】锚定基序：NCgl1337S、NCgl1221ΔC、porH、NCgl1307、NCgl2775；GAD基因：Lsgad、Llgad、Bmgad、Ecgadm、gadB2、gadB2-gadB1 mut；载体：pJYW-5、pK18mobsacB、pBluescript II SK (+)/pDTW109、pCS(1)
2.3 重组谷氨酸棒杆菌摇瓶和生物反应器中的GABA发酵
摇瓶GABA生产：谷氨酸棒杆菌细胞在种子培养基中30°C、200 rpm预培养8 h，以最终光密度（OD562）1.9接种至含30 mL发酵培养基的500-mL挡板摇瓶中，30°C、200 rpm振荡培养72 h [35,38]。发酵期间每12 h取1 mL发酵液测定OD562值、残余葡萄糖、pH水平以及L-Glu和GABA含量 [35]。
2.4-L生物反应器（T&J-Minibox，中国）补料分批GABA发酵 [24]：种子培养物以15%接种量接种至发酵培养基。0–24 h期间，通过添加氨水将pH控制在约7.2；24–72 h期间，将pH调节并维持在约5.5。整个发酵过程在32°C下进行，通过调节搅拌速度和通气量将溶解氧水平控制在20%–30%。初始葡萄糖浓度为100 g/L，发酵过程中通过添加葡萄糖将后期葡萄糖浓度控制在不低于15 g/L。发酵期间每4 h取适量发酵液测定OD562值、残余葡萄糖以及L-Glu和GABA含量。
【数据】摇瓶：30°C、200 rpm、8 h预培养、OD562=1.9接种、72 h发酵、每12 h取样；生物反应器：2.4-L、15%接种量、0–24 h pH 7.2、24–72 h pH 5.5、32°C、溶解氧20%–30%、初始葡萄糖100 g/L、维持≥15 g/L、每4 h取样
2.4 GAD活性测定
GAD酶活性按照已报道方法 [35]测定。对于表面展示菌株，直接使用细胞悬液作为酶液；对于非表面展示菌株，使用超声破碎细胞裂解液的上清液作为酶液。一个酶活力单位（U）定义为在37°C下1 min内生成1.0 μmol GABA所需的酶量。比酶活力表示为U/g细胞干重（DCW）。
【数据】酶活定义：37°C下1 min生成1.0 μmol GABA为1 U；比酶活单位：U/g DCW
研究结果
3.1 筛选具有更好GABA生产能力的GAD
通过调研近中性pH条件下具有活性的GAD相关研究，本研究选取了来自不同来源的几种具有宽活性pH范围和较好GABA生产能力的GAD，即Lsgad、Llgad [20]、Bmgad [19]和Ecgadm [18]，进行克隆和表达。将五种不同的gad表达质粒p5-gadB2 [35]、p5-Lsgad、p5-Llgad、p5-Bmgad和p5-Ecgadm分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032，生成五株菌GSL-1A、GSL-1B、GSL-1C、GSL-1D和GSL-1E。由于LsGAD、LlGAD、BmGAD和EcGADm在酸性和近中性pH下均具有活性，而来源于L. brevis Lb85的gadB2仅在酸性pH下具有活性，因此对这五株菌进行GABA发酵以筛选具有更好GABA生产能力的GAD。结果如图2所示。
四个gad表达菌株表现出相似的生长和葡萄糖消耗速率，但菌株GSL-1B除外——其生长较慢但葡萄糖消耗更快。发酵72 h后，表达Lsgad的GSL-1B和表达Bmgad的GSL-1D比其他菌株产生了更多的GABA（图2B）。GSL-1B的GABA滴度最高，达到10.9 g/L，显著高于表达gadB2的GSL-1A（4.4 g/L GABA）和GSL-1D（6.2 g/L GABA）（p < 0.05）。表达Llgad的GSL-1C和表达Ecgadm的GSL-1E仅产生极少量的GABA（图2B）。
前期研究表明，在pH 4.5–6.0范围内，LsGAD能维持至少125 U/mg的较高活性 [20]，且与其他几种GAD相比在pH 6.0下具有更好的稳定性。虽然其三维结构的详细描述尚未见报道，但其Km和Kcat值（分别为3.37 mM和34.63 s⁻¹）表明其具有较高的底物亲和力和转化效率 [20]。这些结果表明LsGAD活性更高，更适合在谷氨酸棒杆菌中生产GABA。此外，发酵0–12 h期间pH升至8.2–8.7，12–36 h期间迅速降至4.9–5.2，此后维持在约5.0–5.2（图2C）。这种显著的pH变化不仅影响GAD的活性，还影响其稳定性 [18,20]。LlGAD和EcGADm的GABA产量低可能是由于这些GAD在pH显著变化时稳定性较差。总之，与其他GAD相比，LsGAD即使在pH大幅变化的情况下也具有更好的GABA生产能力。
【数据】GABA产量：GSL-1B（Lsgad）10.9 g/L、GSL-1A（gadB2）4.4 g/L、GSL-1D（Bmgad）6.2 g/L、GSL-1C（Llgad）少量、GSL-1E（Ecgadm）少量；LsGAD动力学：Km=3.37 mM、Kcat=34.63 s⁻¹、pH 4.5–6.0活性≥125 U/mg；发酵pH：0–12 h为8.2–8.7、12–36 h降至4.9–5.2、此后维持5.0–5.2；p < 0.05
3.2 在谷氨酸棒杆菌细胞表面展示LsGAD
在谷氨酸棒杆菌中，由于胞内和胞外环境之间的pH差异以及前体L-Glu向胞内分泌，通过胞内酶系统生产GABA面临一些挑战。此外，谷氨酸棒杆菌中GABA的分泌机制仍不清楚。因此，本研究考虑将GAD展示在谷氨酸棒杆菌细胞表面。首先，表面展示的GAD可以在更有利的胞外酸性pH（发酵24 h后约pH 5.0–6.0，如图2C所示）下发挥作用；其次，GABA可以直接在细胞外由大量的胞外L-Glu合成。
为实现LsGAD在细胞表面的展示，选取了五种在前期研究中被报道具有较高表面展示效率且定位于分枝菌酸层或细胞膜的锚定基序，即NCgl1337S、NCgl1221ΔC、PorH、NCgl1307和NCgl2775，分别融合于LsGAD的N端，获得菌株GSL-2A、GSL-2B、GSL-2C、GSL-2D和GSL-2E。膜蛋白NCgl1221负责L-Glu分泌，利用NCgl1221ΔC锚定基序展示α-淀粉酶已被证明能促进L-Glu的积累 [34]。两种小尺寸锚定基序——截短的分枝菌酸层蛋白NCgl1337S和孔蛋白PorH已被证明能非常高效地实现目标蛋白的表面展示 [31,32]。最近，通过基因组规模挖掘筛选出几种新型锚定蛋白，其中胞外蛋白NCgl1307和膜蛋白NCgl2775表现出优于先前锚定基序的表面展示效率 [33]。
对五株表面展示菌株进行发酵并检测其GABA产量。表面展示菌株GSL-2C和GSL-2D的生长与胞内表达菌株GSL-1B相似，但GSL-2D的葡萄糖消耗慢于GSL-2C和GSL-1B（图3A）。虽然它们的GABA产量低于GSL-1B（10.9 g/L），但使用PorH锚定基序的GSL-2C（9.9 g/L GABA）和使用NCgl1307锚定基序的GSL-2D（1.3 g/L GABA）展示了表面展示LsGAD的潜力（图3B）。菌株GSL-2C的GABA滴度与菌株GSL-1B无显著差异，而菌株GSL-2D的GABA滴度表现出显著差异（p < 0.05）（图3B）。GSL-2C的GAD活性（6.053 U/g DCW）和GSL-2D的GAD活性（1.244 U/g DCW）显著低于GSL-1B（464.21 U/g DCW）（表2）。这可能是LsGAD表面展示后GABA滴度下降的原因。即使GAD活性大幅下降，GSL-2C的GABA滴度也没有下降太多。然而，在锚定基序NCgl1337S（菌株GSL-2A）和NCgl1221ΔC（菌株GSL-2B）下融合LsGAD严重影响了生长、葡萄糖消耗和L-Glu合成，这两株菌未产生GABA。在锚定基序NCgl2775（菌株GSL-2E）下融合LsGAD促进了细胞生长和L-Glu合成，但无法将L-Glu有效转化为GABA。因此，选择PorH和NCgl1307锚定基序展示LsGAD用于进一步研究。
在前期研究中，α-淀粉酶和木聚糖酶通过使用膜蛋白 [33,34]或分枝菌酸层蛋白 [31–33]或其他外源蛋白展示在谷氨酸棒杆菌细胞表面，将不可吸收的淀粉和木聚糖水解为可吸收的葡萄糖和木糖。通过NCgl1337S展示的海藻糖合酶可以在谷氨酸棒杆菌中直接将底物麦芽糖在胞外转化为海藻糖 [39]。这些研究旨在解决这些底物的摄取和利用问题。近期，来源于Pyrococcus horikoshii和Neurospora crassa的单体蛋白GadB在大肠杆菌细胞表面的展示已被研究，并分别成功生产了5.35 g/L和30.7 g/L GABA [40,41]。然而，尚未见GAD在谷氨酸棒杆菌（与大肠杆菌相比更安全的宿主）表面展示合成GABA的报道。本研究成功将GAD展示在谷氨酸棒杆菌细胞表面并生产了9.9 g/L GABA。虽然该GABA滴度未超过胞内表达GAD的产量（图3B），但为在谷氨酸棒杆菌中生产GABA提供了新思路。未来可通过筛选更合适的锚定基序和融合蛋白之间的连接肽序列以及改进发酵条件来进一步优化GAD的表面展示。
【数据】GABA产量：GSL-2C（PorH锚定）9.9 g/L、GSL-2D（NCgl1307锚定）1.3 g/L；GAD活性：GSL-2C为6.053 U/g DCW、GSL-2D为1.244 U/g DCW、GSL-1B为464.21 U/g DCW；p < 0.05；胞外pH：24 h后约5.0–6.0
3.3 在谷氨酸棒杆菌染色体中整合多个gad基因
在谷氨酸棒杆菌中，由于GABA通透酶、GABA转氨酶和SSADH的存在，胞外GABA可以被转运回细胞内并降解为琥珀酸，从而进入TCA循环（图1）。为减少GABA降解，本研究首先在pknG缺失菌株GSL-3中敲除gabP基因，获得菌株GSL-4。将质粒p5-Lsgad转化至GSL-4获得菌株GSL-4A。其次，为阻断丙酮酸衍生物副产物的产生并在染色体中表达gad，将gadB2-gadB1 mut表达盒整合至GSL-4的ldhA-pyk2基因位点，获得菌株GSL-5。ldhA-pyk2簇中的ldhA基因编码L-乳酸脱氢酶，负责L-乳酸的合成；pyk2基因编码丙酮酸激酶，负责将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸。
随后，将pK18-ΔgabTD::Lsgad和pK18-ΔpoxB::Bmgad分别转化至菌株GSL-5，经编辑后获得ΔgabTD::Lsgad菌株GSL-6和ΔpoxB::Bmgad菌株GSL-7。gabTD基因簇编码GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶，负责GABA的降解；poxB基因编码丙酮酸氧化酶，负责乙酸的产生。通过敲除这些基因并整合gad基因，既阻断了GABA的降解途径，又减少了副产物的积累，同时增加了GAD的表达拷贝数。
为研究胞内和胞外GAD协同作用对GABA生产的效率，将质粒p5-Lsgad、p5-porHL-gad和p5-07L-gad分别转化至菌株GSL-6，获得菌株GSL-6A、GSL-6B和GSL-6C。
摇瓶发酵结果显示，GSL-6及其衍生菌株的GABA产量进一步得到提升。其中，同时具有染色体整合gad基因和胞内表达质粒的菌株GSL-6A，以及同时具有染色体整合gad基因和表面展示质粒的菌株GSL-6B和GSL-6C，其GABA产量均高于仅通过染色体整合gad基因的菌株GSL-6。发酵过程中pH的变化如图5B所示。
【数据】基因敲除/整合：ΔgabP（GSL-4）、ΔldhA-pyk2::gadB2-gadB1 mut（GSL-5）、ΔgabTD::Lsgad（GSL-6）、ΔpoxB::Bmgad（GSL-7）；菌株：GSL-6A（p5-Lsgad）、GSL-6B（p5-porHL-gad）、GSL-6C（p5-07L-gad）
3.4 2.4-L生物反应器中的补料分批发酵
为评估最佳菌株的GABA生产能力，在2.4-L生物反应器中进行了补料分批发酵。选取菌株GSL-6、GSL-6B和GSL-6C进行放大发酵。发酵过程中，0–24 h pH控制在7.2，24–72 h pH控制在5.5。
发酵结果如图6所示。菌株GSL-6在72 h发酵后产生了25.3 g/L GABA，而菌株GSL-6B和GSL-6C通过胞内与胞外GAD的协同作用，分别产生了42.3 g/L和38.5 g/L GABA。GSL-6B的GABA产量最高，达到42.3 g/L，显著高于仅通过胞内表达GAD的菌株GSL-6。这表明表面展示GAD与胞内GAD的协同催化策略能有效提高GABA产量。
【数据】发酵时间：72 h；GABA产量：GSL-6为25.3 g/L、GSL-6B为42.3 g/L、GSL-6C为38.5 g/L；pH控制：0–24 h为7.2、24–72 h为5.5；温度：32°C；溶解氧：20%–30%
讨论与解读
本研究通过多种策略的组合成功提高了谷氨酸棒杆菌的GABA生产能力。使用近中性pH活性的GAD（特别是LsGAD）缓解了细胞生长与GABA生产之间因pH依赖性不同而产生的矛盾。表面展示技术使GAD能够在更有利的酸性环境中发挥作用，但表面展示菌株的GABA生产能力未达到非表面展示菌株的水平，未来需通过优化表面展示策略来改进。通过基因组修饰阻断丙酮酸衍生物副产物的合成和GABA降解途径，有效增加了GABA的积累。最终，胞内和表面展示GAD同时催化L-Glu脱羧，在2.4-L生物反应器中实现了42.3 g/L的GABA产量。本研究为在谷氨酸棒杆菌中展示GAD并生产GABA提供了一种新策略，该策略也可能有益于谷氨酸棒杆菌中其他产物的代谢工程改造。
编译者解读：本研究最值得关注的是将"近中性pH活性酶筛选—表面展示—染色体整合—代谢途径重塑"多策略系统整合，层层递进解决了谷氨酸棒杆菌生产GABA的pH矛盾与产物降解问题。42.3 g/L的产量在同类微生物发酵研究中具有竞争力。表面展示策略虽然酶活大幅下降（464.21降至6.053 U/g DCW），但与胞内催化协同后仍实现产量跃升，这一"双位点催化"思路对其它依赖胞外底物转化的产品具有借鉴价值。局限在于表面展示的酶活损失较大，锚定基序与连接肽的进一步优化仍有空间。
参考来源
期刊：Process Biochemistry, 2025
DOI: 10.1016/j.procbio.2025.07.002
DOI: 10.1016/j.procbio.2025.07.002