来源：High-efficiency production of lacto-N-triose II through combinatorial metabolic strategies in Saccharomyces cerevisiae（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人乳寡糖（HMOs）因多种生物学功能备受关注，乳酰-N-三糖II（LNT II）作为其核心三糖骨架，是合成LNT、LNnT等复杂寡糖的关键前体。本研究在酿酒酵母中通过模块化代谢工程，整合途径构建、酶定向进化、前体增强与竞争途径抑制四大策略，将LNT II摇瓶产量从0.134 g/L逐步提升至1.2 g/L，并在5 L生物反应器中达到18.1 g/L的产量，同时开发了三种乳糖响应型生物传感系统。
研究背景
人乳寡糖（HMOs）因多种生物学功能而备受关注。HMOs对胃肠道酶解具有显著抗性，可完整到达婴儿结肠，作为特定有益肠道菌群的优先生长底物；作为强效抗黏附剂和抗菌剂，能有效抑制病原体附着于婴儿黏膜表面；同时具备免疫调节特性，并可为大脑发育提供必需的唾液酸。目前已鉴定出超过200种不同结构的HMOs，由D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、L-岩藻糖和唾液酸五种单糖通过多种糖苷键连接而成。其中，乳酰-N-三糖II（LNT II）作为关键的三糖骨架（Glc-Gal-GlcNAc），是合成乳酰-N-四糖（LNT）和乳酰-N-新四糖（LNnT）等重要HMOs的核心前体。尽管LNT II已在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中实现生物合成，但在酿酒酵母中的研究极为有限。
研究方法
2.1 试剂、菌株与培养基
Primer STAR GXL DNA聚合酶和限制性内切酶购自Takara Bio（中国大连）。一步组装试剂盒购自ABclonal Biotech（中国武汉）。LNT II和UDP-GlcNAc标准品分别购自Carbosynth（中国苏州）和Glycogene（中国武汉）。所有引物和合成DNA片段由GENEWIZ（中国苏州）商业合成。用于质粒构建的大肠杆菌DH5α细胞在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中培养，并添加100 μg/mL氨苄青霉素。酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C作为基因修饰的亲本菌株，所有工程菌株列于表1。酿酒酵母的整合位点基于先前报道选择。重组酿酒酵母菌株的筛选使用合成限定（SD）培养基（6.7 g/L酵母氮碱、20 g/L葡萄糖），添加营养缺陷型氨基酸，于30°C培养。对于乳糖响应系统的开发和优化，分别使用基于SD培养基的葡萄糖充足培养基（含40 g/L葡萄糖）和乙醇培养基（含5 g/L乙醇作为唯一碳源）。摇瓶培养酿酒酵母使用YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）或添加乳糖的SD培养基。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae CEN.PK2-1C；培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、SD（6.7 g/L酵母氮碱、20 g/L葡萄糖）、YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；温度：37°C（E. coli）、30°C（S. cerevisiae）；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素；碳源：40 g/L葡萄糖、5 g/L乙醇、乳糖
2.2 重组质粒构建
pRS314、pRS315和pRS316用作基础质粒。构建的质粒和引导RNA序列分别详见于补充表S1和S2。酿酒酵母内源元件包括诱导型启动子（P_GAL1）、组成型启动子（P_TDH3、P_TEF1、P_PGK1、P_LEU2、P_PHO5、P_URA3和P_TRP1）、终止子（T_CYC1、T_PGK1、T_TDH3）以及编码序列（PGI1、GFA1、GNA1、PCM1、QRI1、GLN1、PDC1、PDC2、ACS1、ACS2、ALD6、ADH2、YNK1、URA6、YND1），均从CEN.PK2-1C基因组扩增获得，同时扩增1 kb同源臂用于同源重组。质粒pRS314-P_TEF1-Cas9和pRS316-P_SNR52-sgRNA构成基于Cas9的基因组编辑系统，用于高效操纵工程酵母基因组。密码子优化的异源基因由GENEWIZ合成。所有质粒通过15–25 bp重叠序列的同源重组进行组装。
【数据】质粒载体：pRS314、pRS315、pRS316；启动子：P_GAL1、P_TDH3、P_TEF1、P_PGK1、P_LEU2、P_PHO5、P_URA3、P_TRP1；终止子：T_CYC1、T_PGK1、T_TDH3；同源臂：1 kb；重叠序列：15–25 bp
2.3 Western blot分析
重组菌株接种于5 mL SD培养基中，30°C过夜培养。将培养物稀释至OD600值为0.1，接种于10 mL新鲜SD培养基（250 mL摇瓶）中，培养12小时。细胞在7000 ×g离心10分钟，用去离子水洗涤两次，重悬于8 M尿素缓冲液中，并使用低温研磨器裂解。裂解液在12,000 ×g离心15分钟，取100 μg上清蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。Western blot使用小鼠抗HA单克隆抗体（TransGen Biotech，中国；1:5000稀释）作为一抗，HRP偶联的山羊抗小鼠IgG（TransGen Biotech；1:5000）作为二抗。GAPDH抗体用作内参。蛋白信号使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad，中国上海）显色，并通过ImageQuant LAS4000成像系统（GE Healthcare Bio-Sciences，瑞典乌普萨拉）捕获。
【数据】离心：7000 ×g、10 min；裂解缓冲液：8 M尿素；离心：12,000 ×g、15 min；蛋白上样量：100 μg；一抗稀释度：1:5000；二抗稀释度：1:5000；培养时间：12 h；OD600初始值：0.1
2.4 荧光强度检测
荧光强度通过将重组菌株在0.5 mL SD培养基中30°C过夜培养后测定。对于葡萄糖基培养，将细胞悬液接种于0.5 mL新鲜葡萄糖充足培养基中，初始OD600（600 nm处吸光度值）为0.1，30°C孵育16小时。当使用乙醇作为碳源时，在乙醇培养基中培养时间延长至32小时，其他条件相同。取150 μL等分试样转移至96孔板，使用微板读取器（BioTek，美国）同时测定OD600和荧光。mCherry荧光检测的激发/发射波长设置为578/610 nm。对于相对荧光强度的校正，扣除培养基的背景OD（ODbg）和非荧光菌株的背景荧光（FPbg）。Fl/OD600值通过以下方程（1）计算：
（1）FP/OD校正 = (FP − FPbg)/(OD − ODbg)
乳糖感应系统对乳糖的剂量-响应曲线通过以下方程（2）计算：
（2）y = ymin + (ymax − ymin)Kn/(Kn + Xn)
该方程中，x表示乳糖浓度，y表示相对启动子活性，ymin和ymax分别为最小和最大活性，K对应激活阈值，n为协同系数。对于流式细胞术分析，培养细胞在7000 ×g收集10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。细胞沉淀随后重悬于PBS中并稀释至OD600约为0.3。不同样品的荧光强度分布使用BD FACSAria III流式细胞仪分析，配备561 nm激光器和610/20 nm发射滤光片。荧光检测在PE-Texas Red通道进行，荧光电压设置为490 V。细胞分选以“纯度”模式作为精度模式进行，阈值为每秒3000个事件。
【数据】培养时间（葡萄糖）：16 h；培养时间（乙醇）：32 h；激发/发射波长：578/610 nm；上样量：150 μL；流式激光：561 nm；发射滤光片：610/20 nm；电压：490 V；分选阈值：3000 events/s
2.5 Lac4p乳糖裂解效率的计算
为计算Lac4p的乳糖裂解效率（CE），重组菌株接种于5 mL SD培养基中，30°C过夜培养。将培养物稀释至OD600 = 0.2，接种于10 mL新鲜SD培养基（250 mL摇瓶）中，含不同乳糖浓度，孵育18小时。细胞通过离心（7000 ×g，10分钟）收集用于样品制备。随后CE通过以下方程（3）计算：
（3）CE = (LactoseNC − Lactose)/LactoseNC
该方程中，LactoseNC表示表达Lac12p但不表达Lac4p的对照细胞中的乳糖浓度，Lactose表示共表达Lac12p和Lac4p的菌株中的残余乳糖浓度。
【数据】初始OD600：0.2；培养时间：18 h；离心：7000 ×g、10 min
2.6 Gfa1p定向进化的筛选策略
重组质粒pRS314-P_GFA1-GFA1首先通过将野生型GFA1基因及其天然启动子插入pRS314载体构建。通过Arg196、Lys197和Ser199位点的单点饱和突变以及Arg196和Lys197位点的双位点饱和突变，生成四种类型的质粒突变文库。随后，pRS316-P_TEF1-LAC4-P_SNR52-sgRNA-P_TDH3-2tetO-4-P_SNR52-sgRNA-P_TDH3-2tetO-5-P_LEU2-tetR-Mig1、pRS315-P_GAL1-dCas9-Mig1-P_TDH3-2tetO-mCherry以及这些突变质粒被转化至YS05菌株，构建综合突变菌株文库。突变细胞首先在葡萄糖充足培养基中培养12小时。随后，收获细胞并重悬于含2 g/L乳糖和10 mM脱水四环素（aTc）的新鲜乙醇培养基中。在第一轮荧光激活细胞分选（FACS）中，分析约100,000个细胞，收集荧光最高的前5%（5000个细胞）并进行二次筛选的传代培养。在第二轮中，从每个突变文库中选取荧光强度最高的800个细胞，并在平板上复苏。复苏的细胞随后转移至24深孔板中培养，再转移至96孔板中，使用微板读取器分析。最后，具有高Fl/OD600值的菌株使用含2 g/L乳糖的SD培养基进行摇瓶发酵，LNT II产量通过HPLC定量分析。
【数据】饱和突变位点：Arg196、Lys197、Ser199（单点）、Arg196+Lys197（双点）；乳糖浓度：2 g/L；aTc浓度：10 mM；第一轮FACS分析细胞数：约100,000；第一轮收集：前5%（5000 cells）；第二轮收集：800 cells；葡萄糖充足培养基培养时间：12 h
2.7 CRISPR/dCas9介导的基因下调
来自化脓性链球菌的催化失活dCas9被用于CRISPR干扰（CRISPRi）系统。dCas9蛋白在P_GAL1启动子控制下表达，而引导RNA在P_SNR52启动子控制下表达。靶向ZWF1、PGM1、PGI1和YND1基因的引导RNA序列设计并克隆至pRS316载体中。将携带dCas9和sgRNA的质粒共转化至目标菌株中，通过dCas9-sgRNA复合物与靶基因启动子区域结合，实现转录抑制。抑制效率通过qRT-PCR验证。
【数据】dCas9来源：Streptococcus pyogenes；靶基因：ZWF1、PGM1、PGI1、YND1；启动子：P_GAL1（dCas9）、P_SNR52（sgRNA）
研究结果
3.1 酿酒酵母中LNT II生物合成途径的构建
完整的LNT II合成途径分为三个功能模块：己糖胺途径模块（模块A）、LNT II生物合成模块（模块B）和竞争途径模块（模块C）（图1a）。虽然UDP-GlcNAc核苷酸糖供体在酿酒酵母中天然存在，但该酵母物种缺乏乳糖转运能力。为实现乳糖利用，将来自乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的真核乳糖转运蛋白Lac12p在组成型TEF1启动子（P_TEF1）控制下引入酿酒酵母CEN.PK2-1C的HO位点，生成工程菌株YS01。HPLC验证确认了LAC12的功能性表达，确保了酿酒酵母中HMO生物合成所需的基本底物摄取能力（图S1a）。先前研究表明，来自脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的LgtA（β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶）可催化乳糖和UDP-GlcNAc合成LNT II。为比较两种已报道的LgtA变体（命名为LgtA-1和LgtA-2）在酿酒酵母中的活性，每种变体在P_TEF1控制下染色体整合至菌株YS01中，创建菌株YS02（LgtA-1）和YS03（LgtA-2）。使用2 g/L乳糖的摇瓶分批发酵显示显著的产量差异：72小时后，YS02达到0.134 g/L LNT II，而YS03仅为0.045 g/L（图1b），通过HPLC和LC-MS定量（图S1b、c）。
为分析这种差异的原因，使用（GGGGS）3连接子构建了两种酶的C端3 × HA标记版本，并克隆至pRS316载体中，生成pRS316-P_TEF1-lgtA-1-3 × HA和pRS316-P_TEF1-lgtA-2-3 × HA质粒（图S2a）。这些质粒随后分别转化至YS01菌株中，Western blot分析表明LgtA-1的蛋白表达水平显著高于LgtA-2（图S2b）。序列比对揭示LgtAs的N端区域存在主要差异（图S2c），表明N端序列显著影响异源蛋白在酿酒酵母中的表达水平。这些结果表明YS02中LNT II产量提高可归因于LgtA-1变体更高的表达效率。因此，YS02被选为后续优化的首选基础菌株。
由于关键酶的剂量可显著影响目标产物的产量，研究了LNT II生物合成模块中LAC12和lgtA-1不同拷贝数的影响。为实现这一目标，构建了具有不同LAC12和lgtA-1表达盒拷贝数的菌株YS04-YS06。值得注意的是，含有两个LAC12拷贝和单拷贝lgtA-1的YS05实现了0.151 g/L LNT II（图1c），对菌株YS02、YS04、YS05和YS06中关键酶的转录分析揭示，YS05产量的增加源于LAC12基因的转录上调（图S2d）。这些结果表明更高的乳糖摄取能力有利于增强LNT II合成。因此，YS05被选用于后续研究。
【数据】LNT II产量：YS02为0.134 g/L，YS03为0.045 g/L（72 h）；YS05为0.151 g/L；乳糖浓度：2 g/L；菌株：YS01-YS06；LgtA变体：LgtA-1、LgtA-2；蛋白标签：3 × HA
3.2 Gfa1p：LNT II生物合成中的限速酶
虽然LgtA在LNT II合成中发挥重要作用，但大肠杆菌中的GlmS（Gfa1p同工酶）被鉴定为LNT II生物合成中的限速酶，该酶受到GlcN-6-P的反馈抑制。同时，近期报道阐明了真核生物中Gfat1p（Gfa1p同源物）更复杂的调控机制，Gfat1p是己糖胺途径高度保守的限速酶。具体而言，Gfa1p的活性受两种调控模式调节：PKA介导的磷酸化和UDP-GlcNAc介导的反馈抑制（图2a）。据报道，人Gfat1p Ser205位点的磷酸化不仅降低了酶活性，还破坏了UDP-GlcNAc介导的反馈抑制。此外，人Gfat1pR203H突变体在低UDP-GlcNAc水平条件下表现出Ser205磷酸化减少，与野生型Gfat1p相比催化活性增强，而野生型仍受磷酸化依赖性抑制。值得注意的是，Arg203在UDP-GlcNAc抑制中发挥关键作用，R203H突变体在高UDP-GlcNAc条件下的反馈响应受损，最终导致突变菌株胞内UDP-GlcNAc含量升高。基于这些机制见解，通过氨基酸序列比对，酿酒酵母Gfa1p的磷酸化基序作为关键调控元件脱颖而出（图2b）。
为确定Gfa1p在LNT II生物合成中的作用，通过CRISPR/Cas9基因组编辑从亲本菌株YS05构建了两个重组菌株（YS07和YS05–1）。菌株YS07通过将内源GFA1基因精确替换为其突变同源物GFA1 K197H生成。相比之下，菌株YS05–1通过将P_PGK1启动子控制下的野生型GFA1表达盒整合至YS05基因组308a位点获得。比较分析显示，YS07实现了优异的LNT II产量（0.274 g/L），优于YS05–1（0.188 g/L）（图2c）。值得注意的是，YS05–1中GFA1过表达在YPD培养基中诱导了显著的生长抑制，这可能归因于其相对于YS07较低的产物产量（图S3）。此外，通过LC-MS分析，YS07菌株相比亲本YS05和YS05–1菌株表现出最高的胞内UDP-HexNAc水平（图2d）。
基于先前报道和本研究结果，Gfa1p被鉴定为LNT II生物合成中的限速酶，而Gfa1p的组成型过表达因抑制细胞生长而无法令人满意。因此，Gfa1p的定向进化对于获得在不影响细胞适应性的情况下增强LNT II产量的高性能变体非常必要。Gfa1pK197H突变体与人Gfat1pR203H之间观察到的功能相似性，特别是它们共同提升UDP-GlcNAc水平的能力，暗示了调控过程的进化保守性。假设酿酒酵母Gfa1p的磷酸化基序涉及Arg196、Lys197和Ser199（在结构上类似于人Arg202、Arg203和Ser205，图2b），调控UDP-GlcNAc的生成，从而影响LNT II生物合成。酿酒酵母Lys197似乎在UDP-GlcNAc反馈抑制中发挥与人Arg203类似的关键作用，而相邻残基可能调节磷酸化依赖性活性。对于Gfa1p的定向进化，提出了在Arg196、Lys197和Ser199位点引入突变。然而，对这三个位点的单点和组合突变进行全面分析将极其耗时费力。为克服这一限制，建立Gfa1p突变体的高通量筛选平台成为高效突变体选择和表征的必要前提。
【数据】LNT II产量：YS07为0.274 g/L，YS05–1为0.188 g/L；突变位点：GFA1 K197H；整合位点：308a；启动子：P_PGK1；检测方法：LC-MS（UDP-HexNAc）
3.3 基于GAL电路的乳糖响应型生物传感器的构建
最初尝试开发一种GlcN-6-P响应型生物传感器来直接监测Gfa1p催化活性。选择了三种GntR家族调节因子（来自天蓝色链霉菌的DasR、来自枯草芽孢杆菌的NagR和GamR）。每个调节因子通过柔性（GGGGS）3连接子融合至Gal4p激活结构域（Gal4ad）的N端，生成三种人工GlcN-6-P响应型生物传感器（DasR-Gal4ad、NagR-Gal4ad和GamR-Gal4ad）（图S4a）。响应单元由特异性DNA结合位点（3 × dasO、3 × nagO或3 × gamO）、最小启动子（minP）和荧光报告基因mCherry组成。DasR-Gal4ad、NagR-Gal4ad和GamR-Gal4ad均能够……
【数据】调节因子：DasR（S. coelicolor）、NagR、GamR（B. subtilis）；连接子：（GGGGS）3；DNA结合位点：3 × dasO、3 × nagO、3 × gamO；报告基因：mCherry；启动子：minP
3.4 己糖胺途径模块关键基因过表达对LNT II产量的影响
为增强UDP-GlcNAc前体供应，对己糖胺途径模块中的关键基因进行了过表达研究。通过构建一系列工程菌株YS14-YS23和YS23-YS33，系统评估了PGI1、GFA1、GNA1、PCM1、QRI1、GLN1等基因过表达对LNT II产量的影响（图6a、b）。
【数据】菌株：YS14-YS23、YS23-YS33；过表达基因：PGI1、GFA1、GNA1、PCM1、QRI1、GLN1；数据表示：mean ± s.d.（n = 3）
3.5 dCas9介导的CRISPRi系统改善LNT II产量
为减少竞争途径对代谢流的消耗，采用dCas9介导的CRISPRi系统下调竞争途径中的关键酶。该系统通过dCas9-sgRNA复合物与靶基因启动子区域结合实现转录抑制（图7a）。对己糖胺途径相关竞争酶（图7b），包括ZWF1（戊糖磷酸途径）、PGM1（糖原合成途径）、PGI1（糖酵解途径）和YND1（UDP-GlcNAc水解）进行了转录抑制。结果显示，CRISPRi系统对ZWF1、PGM1等基因实现了有效的转录抑制（图7c、d），从而减少了代谢流的分流，增加了UDP-GlcNAc的可用性。
【数据】靶基因：ZWF1、PGM1、PGI1、YND1；抑制机制：dCas9-sgRNA转录抑制
3.6 补料分批发酵中的LNT II产量
在5 L生物反应器中进行了补料分批发酵实验。发酵过程中监测了葡萄糖、乙醇和细胞生长（OD600）的时间曲线（图8a），以及底物乳糖和产物LNT II的时间曲线（图8b）。最终工程菌株在5 L生物反应器中实现了18.1 g/L的LNT II产量，乳糖到LNT II的转化率为0.71 mol/mol，生产强度为0.15 g/L/h。
【数据】LNT II产量：18.1 g/L（5 L生物反应器）；乳糖转化率：0.71 mol/mol；生产强度：0.15 g/L/h；监测参数：葡萄糖、乙醇、OD600、乳糖、LNT II
讨论与解读
LNT II作为HMOs的核心结构具有广阔的应用前景。然而，在酿酒酵母中高效生物合成LNT II鲜有报道且面临相当大的挑战。本研究采用模块化策略，以乳糖为底物，通过系统的代谢工程在酿酒酵母中实现了LNT II的高滴度生产。综合策略涉及途径构建、酶定向进化、前体增强和竞争途径抑制。首先，通过Lac12p整合赋予乳糖摄取能力，并通过筛选适合酿酒酵母表达的高活性LgtA-1构建LNT II生物合成途径。在鉴定Gfa1p为LNT II生物合成的限速酶后，开发了三种乳糖感应系统（LacGAL v1、LacGAL v2和LacGAL v3）。具体而言，选择LacGAL v1构建乳糖响应型抑制筛选平台，最终成功鉴定出高性能Gfa1p变体。为将代谢流导向LNT II生物合成，通过增强己糖胺途径和抑制竞争途径对酿酒酵母的代谢途径进行了改造，确保UDP-GlcNAc的充足供应。这一综合策略成功生成了优化的酿酒酵母菌株，将LNT II产量从初始菌株YS02的0.13 g/L提升至摇瓶中的1.2 g/L（YS34）。
编译者解读
本研究展示了合成生物学中"感应-进化-调控"闭环策略的典范——利用乳糖响应型生物传感器将Gfa1p的定向进化从传统低通量筛选提升至FACS高通量平台，这一设计思维值得借鉴。模块化划分（前体供给-产物合成-竞争抑制）使代谢改造逻辑清晰，dCas9-mediated CRISPRi的引入避免了基因敲除带来的生长代价。5 L发酵规模下18.1 g/L的产量在酵母系统中颇具竞争力。局限在于LNT II产量虽高，但乳糖转化率（0.71 mol/mol）仍有提升空间，且当前依赖乳糖诱导可能增加原料成本，未来可探索更经济的底物策略。
参考来源
Wang Y. High-efficiency production of lacto-N-triose II through combinatorial metabolic strategies in Saccharomyces cerevisiae. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.175493
DOI: 10.1016/j.cej.2026.175493