来源：Paving the way for synthetic C1 - Metabolism in Pseudomonas putida through the reductive glycine pathway（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
一碳（C1）化合物——甲醇、甲酸和CO₂——是可持续生物制造的重要替代原料。本研究在工业重要菌株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）中，通过还原甘氨酸途径（rGlyP）的模块化设计，首次实现了该菌对三种C1底物的同化。研究团队将途径拆分为C1、C2、C3三大模块，利用营养缺陷型菌株的生长偶联筛选，逐一验证各模块功能，并最终通过短期适应性进化实现了CO₂依赖的细胞部分生物质合成。这项工作为假单胞菌向完全C1原料生长迈进铺平了道路。
研究背景
当前生物技术生产化学品和燃料主要依赖糖类及植物生物质作为底物。然而，这些底物与粮食生产和生物多样性存在土地竞争，可持续性令人担忧。一碳（C1）原料被认为是重要的可持续替代方案——CO₂或还原性C1原料可从大气或废弃气流中大量获取。化学（电）催化方法正日益成熟，可将CO₂高效转化为可溶性的还原型C1分子甲酸和甲醇。冰岛已实现利用CO₂和电力工业化规模生产电子甲醇。甲醇和甲酸因呈液态，相比气态C1分子更易于投入生物生产过程，因而被认定为有前景的微生物原料。厌氧产乙酸菌虽可实现C1底物的能量高效转化，但其遗传工具匮乏、产物谱有限，限制了工业应用。恶臭假单胞菌作为工业主力菌株，具备强健的代谢网络和丰富的遗传工具，但缺乏天然的C1同化途径。本研究旨在通过还原甘氨酸途径的异源表达，为该菌建立合成C1代谢基础。
研究方法
4.1 质粒、引物与菌株
本研究所用全部菌株和质粒列于表S1和S2。用于质粒构建和基因敲除的引物列于表S3。
4.2 细菌菌株与培养条件
P. putida 和 E. coli 培养温度分别为30°C和37°C。克隆操作中，两种菌株均在Lysogeny Broth（LB）培养基中增殖，该培养基含10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物。配制固体培养基时加入1.5%（w/v）琼脂。需要时使用抗生素，浓度如下：卡那霉素（Km）50 μg/ml、庆大霉素（Gm）10 μg/ml、氯霉素（Cm）50 μg/ml、安普霉素（Apra）50 μg/ml。
所有生长实验均使用M9基本培养基（每升含3.88 g K₂HPO₄、1.63 g NaH₂PO₄、2.0 g (NH₄)₂SO₄，pH 7.0）。M9培养基补充微量元素溶液（每升含10 mg/L乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1 g/L MgCl₂·6H₂O、2 mg/L ZnSO₄·7H₂O、1 mg/L CaCl₂·2H₂O、5 mg/L FeSO₄·7H₂O、0.2 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.2 mg/L CuSO₄·5H₂O、0.4 mg/L CoCl₂·6H₂O、1 mg/L MnCl₂·2H₂O）。
生长实验前，细胞先在含10 mM葡萄糖和2 mM丝氨酸的非选择性M9培养基中预培养，然后转入选择性培养条件。所有生长实验中，预培养菌株在转入前用无碳源M9培养基洗涤两次，以OD600为0.1接种。选择性生长条件除非另有说明，为10 mM葡萄糖+5 mM甘氨酸（C1–S-Aux）或10 mM葡萄糖（C1-G-S-Aux），并补充相应C1底物（30 mM甲酸或500 mM甲醇或50%（v/v）CO₂）。C1-G-S-Aux的甲酸和甲醇实验中，培养基中添加100 mM碳酸氢钠以推动GCS逆向运行。添加碳酸氢钠后，用1M HCl将pH重新调至7.0。
板式读数器实验在200 μL M9培养基中进行，使用Synergy板式读数器（Biotek）。通过连续线性振荡（567 cpm，3 mm）随时间测量生长（OD600），每5分钟测定一次。培养板用Breath-Easy®密封膜（Sigma-Aldrich）覆盖。
CO₂依赖性生长实验中，100 mL玻璃瓶装入10%（10 mL）液体M9培养基。随后，在高压灭菌前将顶空（90%）充入所需CO₂浓度。灭菌后添加碳源和抗生素，培养物在旋转摇床中200 rpm、30°C条件下培养。
所有生长实验均设三次生物学重复，所示生长曲线为三次重复的平均值。
【数据】培养温度：P. putida 30°C，E. coli 37°C；LB培养基：10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物；抗生素：Km 50 μg/ml、Gm 10 μg/ml、Cm 50 μg/ml、Apra 50 μg/ml；M9培养基：3.88 g/L K₂HPO₄、1.63 g/L NaH₂PO₄、2.0 g/L (NH₄)₂SO₄、pH 7.0；接种OD600：0.1；C1底物浓度：30 mM甲酸、500 mM甲醇、50%（v/v）CO₂；碳酸氢钠：100 mM；振荡：567 cpm（板式）、200 rpm（瓶式）；读数间隔：5 min
4.3 质粒构建
质粒构建采用先前描述的SevaBrick Assembly标准方案（Damalas et al., 2020）。所有DNA片段用Q5® Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶（New England Biolabs）扩增。
构建C1模块时，来自 Clostridium ljunghdahlii DSM13528的 fhs、fchA 和 folD 基因的DNA片段用JCat工具（Grote et al., 2005）进行密码子优化，并通过Genescript合成。来自 Geobacillus stearothermophilus、Bacillus methanolicus、Corynebacterium glutamicum 以及 Cupriavidus necator 工程变体（Wu et al., 2016）的MDH基因经密码子优化后由IDT（Integrated DNA Technologies）合成（表S5）。
本研究中所有基因均在强组成型启动子（BBa_J23100）和RBS（BBa_B0034）控制下表达。所有质粒通过热激转化至化学感受态 E. coli DH5α λpir，并在含相应抗生素的LB琼脂上筛选。菌落通过Phire Hot Start II DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific）进行菌落PCR筛选。分离的质粒经Sanger测序（MACROGEN inc.）验证，随后通过电穿孔转化至 P. putida。
【数据】聚合酶：Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase；密码子优化工具：JCat；启动子：BBa_J23100；RBS：BBa_B0034；宿主菌：E. coli DH5α λpir；转化方法：热激、电穿孔
4.4 基因组修饰
本研究的基因组敲除采用Wirth et al.（2020）先前描述的方案。从 P. putida KT2440基因组中扩增靶基因上下游约±500 bp的同源区。两个区域克隆至非复制型pGNW载体，并在 E. coli DH5α λpir中增殖。正确的质粒通过电穿孔转化至 P. putida，在LB + Km平板上筛选。成功的共整合通过PCR验证。
此后，共整合菌株转化pQURE6-H，转化体涂布于含2 mM 3-甲基苯甲酸（3-mBz）的LB + Gm平板。该化合物诱导XylS依赖性Pm启动子，调控I-SceI归巢核酸酶切割整合的pGNW载体。成功的基因敲除通过PCR和Sanger测序（MACROGEN inc.）验证。随后，通过去除选择性压力消除pQURE6-H，并通过庆大霉素敏感性确认其丢失。
【数据】同源臂长度：±500 bp；筛选抗生素：Km（共整合）、Gm（pQURE6-H）；诱导剂：2 mM 3-甲基苯甲酸
4.5 启动子表征
表达正常或突变J23100启动子控制下GFP的 P. putida 菌株，或含空载体的菌株，在M9培养基+10 mM葡萄糖中三次生物学重复培养。使用Synergy板式读数器（Biotek）随时间测量细胞密度（OD600）和GFP荧光（激发485 nm，发射512 nm，增益50），采用连续线性振荡，每5分钟测定一次。启动子强度基于培养20小时细胞达到稳定期后按细胞密度归一化的荧光（RFU/OD600）进行量化。数值已扣除无GFP细胞的背景荧光。
【数据】GFP荧光：激发485 nm、发射512 nm、增益50；测定时间：培养20 h（稳定期）；培养基：M9 + 10 mM葡萄糖
4.6 全基因组测序
从LB过夜培养物中使用GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit（Sigma-Aldrich St. Louis, MO）分离进化突变株和未进化亲本菌株的基因组DNA。提取的DNA通过凝胶电泳评估，并用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）定量。样品送至Novogene Co. Ltd.（中国北京）进行Illumina测序。
原始Illumina读段用fastp（v0.20.0）进行低质量和接头修剪。突变通过将读段与 Pseudomonas putida KT2440注释参考基因组（GCF_000007565.2）比对，使用breseq（v0.35.5）（Barrick et al., 2014）鉴定。
【数据】测序平台：Illumina（Novogene Co. Ltd.）；参考基因组：P. putida KT2440（GCF_000007565.2）；软件：fastp v0.20.0、breseq v0.35.5
4.7 碳标记实验
对蛋白质氨基酸进行稳态同位素示踪时，培养物在10 ml M9培养基中、按前述实验条件培养。培养基由未标记（葡萄糖和甘氨酸）和标记（甲酸-¹³C、甲醇-¹³C和¹³CO₂）（Sigma，99原子%）碳源组成。细胞在含标记或未标记碳源的培养基中连续传代培养两次，以减少预培养的标记效应。
此后，收获约相当于1 mL OD600为1的细胞生物量的细胞体积，离心沉淀。沉淀用1 mL纯水洗涤后再次离心。沉淀重悬于1 ml 6N HCl中，95°C孵育24小时。然后打开盖子，在持续气流下蒸发。所得沉淀重悬于1 mL纯水中，全速离心5分钟去除残余颗粒。
水解产物使用超高效液相色谱（UPLC）（Acquity，Waters）分析，配备HSS T3 C18反相柱（Waters）。流动相为含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）。流速400 μL/min，梯度如下：0–1 min 99% A；1–5 min从99% A梯度至82%；5–6 min从82% A梯度至1% A；6–8 min 1% A；8–8.5 min梯度至99% A；8.5–11 min用99% A再平衡。质谱使用Exactive质谱仪（Thermo Scientific）正离子模式采集。数据分析使用Xcalibur（Thermo Scientific）。氨基酸鉴定基于保留时间和质谱数据。
【数据】标记物：甲酸-¹³C、甲醇-¹³C、¹³CO₂（99原子%）；水解：6N HCl、95°C、24 h；UPLC柱：HSS T3 C18反相柱；流速：400 μL/min；流动相：0.1%甲酸水/乙腈；质谱：Exactive正离子模式
研究结果
2.1 还原甘氨酸途径的构建
为实施rGlyP，研究团队将途径拆分为三个模块：C1、C2和C3（图1）。C1模块将甲酸转化为5,10-亚甲基-THF，该物质在C2模块中通过GCS的反向操作进一步转化为甘氨酸。在C3模块中，甘氨酸与另一个5,10-亚甲基-THF缩合生成丝氨酸。最终，丝氨酸可转化为丙酮酸，并由此进入生物质合成。
研究构建了两个营养缺陷型菌株，将模块功能与生长偶联——即若模块功能正常，则营养缺陷被解除，菌株得以生长。为测试C1和C3模块，构建了生长偶联设计菌株C1–S-Aux，敲除两个GCS的基因（ΔgcvTPH-I/II）和D-3-磷酸甘油酸脱氢酶基因（ΔserA/ΔPP_2533）（图2A）。该菌株无法产生丝氨酸和C1前体分子（如5,10-亚甲基-THF），而这些是嘌呤、胸苷、辅酶A和甲硫氨酸生物合成所必需的（Yishai et al., 2017）。在该菌株中，在常规碳源（如葡萄糖）上的生长只有在补充丝氨酸时才能恢复，或者在C1和C3模块同时存在且有活性、以甘氨酸和甲酸为底物时才能恢复。此时，C1模块将甲酸转化为5,10-亚甲基-THF，C3模块将5,10-亚甲基-THF与甘氨酸缩合形成丝氨酸（图2a）。
为实现C1模块的异源表达，研究团队将来自 Clostridium ljunghdahlii DSM13528的甲酸-THF连接酶（fhs）、5,10-次甲基-THF环化水解酶（fchA）和双功能5,10-次甲基-THF环化水解酶/5,10-亚甲基-THF脱氢酶（folD）基因引入SEVAb24骨架，构建了pC1质粒。将pC1导入C1–S-Aux菌株，并在含葡萄糖、甘氨酸和甲酸的培养基上测试菌株生长。观察到C1和C3模块能够向C1库和丝氨酸输送足够通量，恢复C1–S-Aux的生长。生长速率与对照（葡萄糖+丝氨酸培养基）相似（倍增时间约1小时），生物量产量甚至更高（图2b）。C3模块无需过表达，内源活性已足以恢复生长。当培养基中省略甲酸时，未观察到生长，这反映了生长对rGlyP C1模块同化甲酸的依赖性。
为确认这一依赖性，研究团队使用¹³C标记甲酸进行了标记实验，并测定了蛋白质氨基酸甘氨酸、丝氨酸和组氨酸中的标记情况（图2c）。若C1和C3模块按预期运行，丝氨酸应来源于未标记甘氨酸与单标记5,10-亚甲基-THF（源自¹³C-甲酸）的缩合。组氨酸生物合成需要掺入10-甲酰-THF，该物质来自C1模块中的甲酸，因此也应被单标记。如预期，丝氨酸和组氨酸几乎完全被单标记，证实了C1和C3模块的活性。
接下来，研究团队旨在测试包含GCS反向操作的C2模块。为测试该模块，构建了生长偶联筛选菌株C1-G-S-Aux，敲除了编码苏氨酸醛缩酶（ΔltaE）、异柠檬酸裂解酶（ΔaceA）以及serA和PP_2533的基因。该菌株无法产生丝氨酸、甘氨酸和C1前体分子，在葡萄糖上生长需要外源补充丝氨酸或甘氨酸（Yishai et al., 2018）。通过C1、C2和C3模块的联合活性，甲酸与CO₂可生成甘氨酸，进而生成丝氨酸，解除营养缺陷（图2d）。
GCS在CO₂水平升高时可反向运行，研究团队通过在培养基中补充100 mM碳酸氢钠来实现这一点。目前尚不清楚GCS利用的是CO₂还是碳酸氢盐，但细胞内天然碳酸酐酶（PP_0100）可实现这些碳物种的相互转化。由于GCS的天然表达水平可能不足以维持足够通量，研究团队设计了一个质粒来过表达天然GCS系统。构建了pC2质粒（SEVAb65骨架），过表达内源 gcvT-I、gcvP-I 和 gcvH-I 基因。将pC1和pC2共转化至C1-G-S-Aux后，添加甲酸可恢复生长，生长速率（倍增时间1.7小时）和产量略低于甘氨酸补充对照（图2e）。当两个模块存在但未补充碳酸氢盐时，未观察到生长，表明没有升高的CO₂水平就无法生长。与C1–S-Aux类似，C3模块的内源活性足以恢复生长。
在¹³C-甲酸上生长后，对蛋白质氨基酸甘氨酸、丝氨酸和组氨酸的同位素标记进一步证实了rGlyP模块的联合活性（图2f）。甘氨酸由标记的5,10-亚甲基-THF与未标记CO₂在GCS中缩合产生，预期被单标记。几乎所有的甘氨酸都被单标记，证实了C1和C2模块的联合活性。丝氨酸预期被双标记，因为它由单标记甘氨酸加上一个标记的5,10-亚甲基-THF分子产生。如预期，丝氨酸主要被双标记。
【数据】C1–S-Aux生长倍增时间：约1 h；C1-G-S-Aux生长倍增时间：1.7 h；碳酸氢钠：100 mM；标记物：¹³C-甲酸；敲除基因：ΔgcvTPH-I/II、ΔserA、ΔPP_2533、ΔltaE、ΔaceA
2.2 还原甘氨酸途径延伸至甲醇同化
在证明了通过rGlyP的C1、C2和C3模块进行甲酸同化后，研究团队想测试这些模块是否也能支持 P. putida 中的甲醇同化（图1）。与甲酸一样，甲醇是一种可溶性微生物原料，可由CO₂和可再生电力高效生成（Szima and Cormos, 2018）。
甲醇通过两个酶促步骤转化为甲酸。首先，甲醇被甲醇脱氢酶（MDH）氧化为甲醛。其次，甲醛被甲醛脱氢酶进一步氧化为甲酸。此后，甲酸可经过前述工程模块进一步同化。
为在 P. putida 中实现甲醇利用，研究团队构建了M模块，包含将甲醇氧化为甲酸所需的酶。P. putida 基因组编码超过20种醇脱氢酶，但无一被注释为MDH。然而，先前有报道称某些固有醇脱氢酶可能对甲醇具有副活性（Koopman et al., 2009）。第一个候选是吡咯喹啉醌（PQQ）依赖性醇脱氢酶，由 pedE 编码，该酶对甲醇作为底物表现出活性（Wehrmann et al., 2017）。第二个候选是天然醇脱氢酶，由 adhP 编码。通过BLAST分析发现，adhP 基因编码 C. glutamicum MDH的同源物（同一性：41.5%）。
除这两个候选外，研究团队还测试了来自不同生物的、先前被描述可催化NAD依赖性甲醇氧化的天然或工程酶：Bacillus methanolicus、Geobacillus stearothermophilus、Corynebacterium glutamicum 和 Cupriavidus necator（Wenk et al., 2020; Wu et al., 2016）。对于甲醛氧化为甲酸，过表达了 P. putida 的 fdhA 基因，编码NAD依赖性甲醛脱氢酶。
将各种MDH候选基因和 fdhA 克隆入pC1，构建pM。将各种pM质粒转化至C1–S-Aux，评估哪个MDH候选能维持最高通量从而支持生长。没有质粒表达MDH（M模块）时未观察到生长。所有MDH候选都能恢复C1–S-Aux菌株在葡萄糖、甘氨酸和甲醇上的生长，但生长模式不同（图S1）。来自 C. necator 的工程MDH能维持最佳生长（10小时倍增时间），滞后期最短（图3b）。其次是 B. methanolicus 和 C. glutamicum 的MDH恢复生长最快。
【数据】MDH来源：B. methanolicus、G. stearothermophilus、C. glutamicum、C. necator（工程变体）；C. necator MDH倍增时间：10 h；adhP与C. glutamicum MDH同一性：41.5%；甲醇浓度：500 mM
讨论与解读
本研究成功为工业主力菌株 P. putida 的合成C1代谢奠定了基础。通过生长偶联的营养缺陷型筛选菌株，证明了rGlyP核心模块的异源表达可实现甲酸、甲醇和CO₂的同化。研究展示了以甲酸和甲醇为底物时rGlyP所有关键模块至丝氨酸的功能表达。在C1-G-S-Aux中，甲醇和甲酸转化为甘氨酸和丝氨酸（合计约占细胞生物量的11%），为 P. putida 实现完全甲酸营养型和甲醇营养型提供了坚实基础。两种底物上的完全C1依赖性生长可能通过基因组整合和各模块酶的进一步微调来实现。随后，理性工程与适应性实验室进化的组合可用于优化整个代谢网络——该方法已在 E. coli 和 C. necator 中证明有效。近期，合成甲酸营养型 E. coli 已实现生物生产的首个概念验证，通过适应性实验室进化进一步优化后，该菌能以理论最大值的10%从甲酸生产乳酸。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于其"模块化+生长偶联"的策略设计——将复杂的还原甘氨酸途径拆解为可独立验证的三个模块，以营养缺陷型菌株的生长作为筛选压力，每一步都通过同位素标记确认通路真实性。这种策略不仅规避了假单胞菌缺乏天然C1途径的短板，也为其他非模式工业菌株的合成C1代谢改造提供了可复用的方法论模板。CO₂同化部分需要短期适应性进化来重新平衡NADH/NAD⁺比例，这一发现提示：在合成途径引入后，辅因子平衡往往是比酶活性更隐蔽的瓶颈。后续若要将该菌推向真正的C1原料全生长，基因组整合与表达精细调控仍是关键挑战。
参考来源
Bruinsma L. Paving the way for synthetic C1-Metabolism in Pseudomonas putida through the reductive glycine pathway. Metabolic Engineering, 2023. DOI: 10.1016/j.ymben.2023.02.004
DOI: 10.1016/j.ymben.2023.02.004