来源：Exploring genetic codon expansion for unnatural amino acid incorporation in filamentous fungus Aspergillus nidulans（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
遗传密码扩展技术可将非天然氨基酸（UAA）定点掺入目标蛋白，在蛋白质工程、合成生物学和基因治疗中具有广阔应用前景。然而，该技术在丝状真菌中尚未得到开发。本研究以构巢曲霉（Aspergillus nidulans）为对象，通过引入正交的酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，成功实现了非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸（OMeY）的位点特异性掺入，并系统优化了UAA标记蛋白的表达水平。该工作填补了遗传密码扩展技术在丝状真菌中的应用空白。
研究背景
遗传密码扩展技术是生命科学研究中广泛使用的工具，其核心在于利用正交的氨酰-tRNA合成酶（AARS）/tRNA对将非天然氨基酸（UAA）掺入蛋白质。正交性要求引入的AARS/tRNA对与内源性AARS/tRNA对不发生交叉反应，从而确保目标蛋白中只掺入非天然氨基酸，同时减少外源AARS/tRNA对天然蛋白翻译的影响。为此，正交tRNA的反密码子被改造为与无义密码子配对，其中琥珀终止密码子（TAG）最为常用。此外，正交AARS/tRNA对通常来源于亲缘关系较远的物种，因为系统发育距离可导致tRNA识别元件的分化。为保证UAA的高效掺入，正交AARS的氨基酸结合口袋需经改造以选择性识别目标UAA并排斥天然氨基酸。UAA可携带酮、醛、叠氮、炔、烯、酰胺、硝基、磷酸和磺酸等多种官能团，其掺入为蛋白质功能研究和改造提供了有力手段。尽管该技术在多种物种中已有应用，丝状真菌中尚属空白。本研究旨在构巢曲霉中建立遗传密码扩展技术体系。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用构巢曲霉菌株列于表S1。菌株FGSC A6购自真菌遗传资源中心（FGSC；美国密苏里大学）；菌株ABPUN由东京大学Hiroyuki Horiuchi博士惠赠；其余菌株由本实验室构建。所有真菌菌株均在37°C、基本培养基（1%葡萄糖、10 mM NaNO₃、7 mM KCl、10 mM KH₂PO₄、2 mM MgSO₄、2 mL/L Hunter微量元素液，pH 6.5）中培养，并根据需要添加补充成分（0.4 mg/L吡哆醇、0.5 g/L尿嘧啶、0.6 g/L尿苷、0.5 g/L精氨酸和0.4 mg/L生物素）。Hunter微量元素液组成如下：EDTA二钠盐（50 g/L）、ZnSO₄·7H₂O（22 g/L）、H₃BO₃（11.4 g/L）、MnCl₂·4H₂O（5.06 g/L）、CoCl₂·6H₂O（1.61 g/L）、CuSO₄·5H₂O（1.57 g/L）、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O（1.10 g/L）、FeSO₄·7H₂O（4.99 g/L）（Hutner等，1950）。E. coli DH5α用于DNA操作。培养基所用试剂均购自上海生工生物技术有限公司。
【数据】培养温度：37°C；培养基：基本培养基（1%葡萄糖、10 mM NaNO₃、7 mM KCl、10 mM KH₂PO₄、2 mM MgSO₄、2 mL/L Hunter微量元素液，pH 6.5）；补充成分：0.4 mg/L吡哆醇、0.5 g/L尿嘧啶、0.6 g/L尿苷、0.5 g/L精氨酸、0.4 mg/L生物素
2.2 质粒构建
使用Genomic DNA Purification Kit（Promega，美国威斯康星州）从构巢曲霉A6和E. coli K12中提取基因组DNA。使用PrimeSTAR® HS DNA聚合酶（Takara，日本东京）扩增基因和载体片段。需要时使用QuickCut™ DpnI（Takara，日本东京）去除PCR产物中的质粒模板。使用ClonExpress II/MultiS一步克隆试剂盒（Vazyme，中国南京）进行单片段或多片段PCR产物的无缝克隆。本实验所用引物和质粒信息分别列于表S2和表S3。
为构建构巢曲霉GUS表达质粒，以E. coli基因组DNA为模板，使用引物uidA-F/uidA-R PCR扩增uidA基因。以构巢曲霉A6基因组DNA为模板，分别使用引物对prxA.P-1F/prxA.P-1R和trpC.T-1F/trpC.T-1R PCR扩增prxA基因启动子（PrxA.P）和trpC终止子（TrpC.T）。这些PCR产物的5′和3′端分别携带与uidA基因5′和3′端同源的20 bp同源臂。此外，使用引物pyrG-1F/pyrG-1R通过反向PCR从PstI和SphI多克隆位点线性化pUC19-pyrG质粒。pUC19-pyrG是含有选择标记基因pyrG的pUC19衍生质粒，pyrG来源于构巢曲霉A6基因组DNA，按前述方法（Zhou等，2021）插入XbaI多克隆位点。线性化pUC19-pyrG片段的5′和3′端分别携带与PrxA.P和TrpC.T的5′和3′端同源的20 bp同源臂。随后，使用One Step Cloning Kit提供的重组酶Exnase MultiS，通过同源重组将PrxA.P、uidA、TrpC.T的PCR片段和线性pUC19-pyrG环化，生成GUS表达质粒GUS-pUC19。使用引物对uidA-TAG-F/uidA-TAG-R进行定点突变，在GUS-pUC19质粒的uidA基因中引入琥珀密码子（TAG）突变，生成表达质粒GUSY69am-pUC19。随后以GUSY69am-pUC19为模板，使用引物uidA-TAG-His-F/uidA-TAG-His-R进行反向PCR，获得C端His标签标记的GUSY69am表达质粒GUSY69am-His-pUC19。同样，使用相同引物对GUS-pUC19进行反向PCR，获得C端His标签标记的野生型表达质粒GUS-His-pUC19。
为构建琥珀抑制子tRNATyr（tRNATyr CUA），首先构建pUC19-pyroA质粒。pUC19-pyroA是含有选择标记基因pyroA的pUC19衍生质粒，pyroA使用引物A-pyroA-F/A-pyroA-R从构巢曲霉A6基因组DNA PCR扩增，按前述方法（Zhou等，2021）插入pUC19的XbaI多克隆位点。随后使用引物pyroA-F/pyroA-R通过反向PCR从KpnI和HindIII多克隆位点线性化pUC19-pyroA质粒。使用引物tRNATyr-F/tRNATyr-R PCR扩增构巢曲霉野生型tRNATyr基因（登录号BN001301），其两端各携带1 kb上游和0.5 kb下游序列。PCR片段两端均携带与线性化pUC19-pyroA片段5′和3′端同源的20 bp同源臂。使用One Step克隆试剂盒将线性化pUC19-pyroA片段与构巢曲霉tRNATyr片段环化，获得An.tRNATyr-pUC19质粒。随后使用引物tRNATyr-mut-F/tRNATyr-mut-R对An.tRNATyr-pUC19进行定点突变，将An.tRNATyr突变为An.tRNATyr CUA，生成An.tRNATyr CUA-pUC19质粒。
为建立来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的琥珀抑制子tRNATyr（Bs.tRNATyr CUA），从文献（Sakamoto等，2002）获取Bs.tRNATyr CUA的序列信息，人工合成Bs.tRNATyr CUA（擎科生物技术，中国上海），并将其插入An.tRNATyr CUA-pUC19，完全替换An.tRNATyr CUA，生成Bs.tRNATyr CUA-pUC19质粒。类似地，基于E. coli tRNATyr基因（登录号LK007086）合成E. coli tRNATyr CUA（Ec.tRNATyr CUA），生成Ec.tRNATyr CUA-pUC19质粒。
为构建E. coli Ec.TyrRS-FLAG表达质粒，首先构建pUC19-argB质粒。使用引物A-argB-F/A-argB-R从构巢曲霉A6基因组DNA PCR扩增选择标记基因argB，按前述方法（Zhou等，2021）插入pUC19的XbaI多克隆位点。随后使用引物argB-F/argB-R通过反向PCR从XbaI和SmaI多克隆位点线性化pUC19-argB质粒。使用引物对gpdA.P-F/gpdA.P-R和trpC.T-2F/trpC.T-2R分别从构巢曲霉A6基因组DNA PCR扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子（gpdA.P）和trpC.T。使用引物Ec.TyrRS-F/Ec.TyrRS-R从E. coli基因组DNA PCR扩增编码C端FLAG标签的Ec.TyrRS基因。利用各片段上相应的20 bp同源臂，通过One Step Cloning Kit将四个DNA片段环化，完成表达质粒Ec.TyrRS-FLAG-pUC19的构建。以Ec.TyrRS-FLAG-pUC19为模板，通过PCR定点突变构建E. coli TyrRS六重突变体（Ec.TyrRS）表达质粒（Ec.TyrRS-FLAG-pUC19）。依次使用以下引物对：Tyr37Val-F/Tyr37Val-R、Asp182Ser-F/Asp182Ser-F-R、Phe183Met-F/Phe183Met-R、Leu186Ala-F/Leu186Ala-R、Asp165Gly-F/Asp165Gly-R和Asp265Arg-F/Asp265Arg-R（表S2）。
pAUR316 DNA为商业质粒（Takara，日本东京）。Ec.tRNATyr CUA-AMA1是pAUR316 DNA衍生质粒，在BglII和BamHI多克隆位点含有Ec.tRNATyr CUA序列。为构建该质粒，使用引物AMA1-F/AMA1-R从Ec.tRNATyr CUA-pUC19质粒PCR扩增Ec.tRNATyr CUA的DNA片段。使用引物pAUR316-F/pAUR316-R通过反向PCR从BglII和BamHI多克隆位点线性化pAUR316质粒。利用相应的20 bp同源臂，通过One Step Cloning Kit将Ec.tRNATyr CUA的DNA片段插入pAUR316的BglII和BamHI限制性位点，生成Ec.tRNATyr CUA-AMA1质粒。
【数据】PCR聚合酶：PrimeSTAR® HS DNA Polymerase（Takara）；克隆试剂盒：ClonExpress II/MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme）；限制酶：QuickCut™ DpnI（Takara）；同源臂长度：20 bp；tRNATyr基因侧翼序列：1 kb上游+0.5 kb下游；Ec.TyrRS突变位点：Tyr37Val、Asp182Ser、Phe183Met、Leu186Ala、Asp165Gly、Asp265Arg
2.3 重组菌株构建
所构建重组菌株的信息列于表S1。构巢曲霉原生质体制备和转化条件的详细方案参见前述文献（Tilburn等，1983）。为构建表达野生型GUS和GUSY69am的构巢曲霉菌株，将GUS-His-pUC19和GUSY69am-His-pUC19转化至相应宿主菌株。
（注：原文节选在此处中断，后续转化具体操作步骤原文未完整呈现）
【数据】转化方法：参照Tilburn等（1983）文献；菌株信息：见表S1
研究结果
3.1 琥珀抑制的发生依赖于构巢曲霉抑制子tRNATyr CUA基因
第一步是证明构巢曲霉存在琥珀抑制现象，这是UAA掺入所必需的（Wang等，2009）。本实验选择E. coli β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因uidA作为报告基因，而非GFP基因。这一选择基于以下原因：由于菌丝长度通常不一，无法准确量化细胞数量。因此，需要使用细胞提取物来定量报告基因编码的目标蛋白。GUS因其能产生名为4-甲基伞形酮（4-MU）的高荧光产物而被优先选用。4-MU的强荧光使其检测灵敏度极高，使GUS成为本实验特定目标的理想选择。
为在构巢曲霉中建立遗传密码扩展系统，研究尝试将O-甲基-L-酪氨酸（OMeY）——酪氨酸的甲基化形式——掺入GUS序列。具体而言，选择GUS序列中Tyr69位点的酪氨酸残基进行OMeY掺入。选择将GUS的Tyr69替换为OMeY主要基于两个关键因素：其一，由于Tyr和OMeY结构相似，将Tyr替换为OMeY预计不会显著影响GUS的结构；其二，由于Tyr69远离活性位点（Wallace等，2015），其突变不太可能影响GUS活性。
为在构巢曲霉GUS的Tyr69位点掺入OMeY，将GUS基因中相应的酪氨酸密码子（TAT）的第三个碱基由T突变为G，形成琥珀终止密码子TAG（图S1）。该突变体命名为GUSY69am，使用高活性且可被H₂O₂诱导的过氧化物酶PrxA基因启动子（prxA.P）（Li等，2022；Yan等，2023）驱动其表达。琥珀抑制子An.tRNATyr CUA来源于构巢曲霉酪氨酸tRNA，其反密码子由GUA突变为CUA以识别UAG密码子。为表达An.tRNATyr CUA，将其两侧连接构巢曲霉tRNATyr基因的1 kb 5′上游和0.5 kb 3′下游序列。共表达An.tRNATyr CUA和GUSY69am的构巢曲霉菌株（命名为An.tRNATyr CUA/GUSY69am）用于检测琥珀抑制的发生。仅表达野生型GUS或仅表达GUSY69am而不表达An.tRNATyr CUA的菌株分别作为阳性和阴性对照。琥珀抑制的发生允许GUS的全长翻译，可通过可测量的GUS活性进行检测。
当将各菌株提取物中的10 μg蛋白分别加入1 mL反应溶液中反应5分钟时，仅野生型GUS表达菌株显示酶活性（图1a）。然而，当An.tRNATyr CUA/GUSY69am的细胞提取物蛋白量增加至500 μg且反应时间延长至40分钟时，检测到GUS活性。相比之下，GUSY69am表达菌株显示可忽略的活性（图1a）。定量分析显示，An.tRNATyr CUA/GUSY69am的GUS活性约为野生型GUS表达菌株的1/10,000（图1b）。另一方面，GUSY69am表达菌株的GUS活性仅表现出与不表达GUS的菌株相似的背景活性水平（图1b）。这表明构巢曲霉抑制子tRNATyr CUA可以抑制GUS的琥珀突变，但构巢曲霉中不存在天然的琥珀抑制现象。
【数据】检测条件：10 μg蛋白+1 mL反应液反应5分钟（野生型）；500 μg蛋白+1 mL反应液反应40分钟（An.tRNATyr CUA/GUSY69am）；GUS活性比值：An.tRNATyr CUA/GUSY69am约为野生型的1/10,000；Tyr69突变：TAT→TAG
3.2 *E. coli* tRNATyr CUA/*E. coli* TyrRS对在构巢曲霉中表现出正交性
UAA插入技术使用不应干扰内源性AARS/tRNA对的正交AARS/tRNA对（Cervettini等，2020）。研究最初选择嗜热脂肪芽孢杆菌tRNATyr CUA（Bs.tRNATyr CUA）与E. coli TyrRS（Ec.TyrRS）的组合，因为该组合已成功用于哺乳动物细胞的UAA插入技术（Sakamoto等，2002）。在构建的质粒中，Bs.tRNATyr CUA替换了An.tRNATyr CUA，Ec.TyrRS的表达由甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子（gpdA.P）驱动。gpdA.P是已知的强组成型启动子。将两个质粒共转入GUSY69am表达菌株，获得重组菌株（Bs.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am。（Bs.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am的细胞提取物未显示GUS活性（图2a），表明该组合中未发生琥珀抑制。
为探究原因，通过免疫检测其C端FLAG融合标签来检查Ec.TyrRS的胞内表达。Western blot分析清晰显示，在（Bs.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am中检测到Ec.TyrRS对应的条带，而其亲本菌株GUSY69am表达菌株中无相应信号，表明Ec.TyrRS在（Bs.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am中成功表达（图2b，图S2）。这排除了琥珀抑制缺失是由于Ec.TyrRS不表达的可能性，并提示Bs.tRNATyr CUA可能存在转录问题。
由于Ec.TyrRS与E. coli tRNATyr CUA对（Ec.TyrRS/Ec.tRNATyr CUA）已成功用作哺乳动物细胞的UAA掺入系统（Italia等，2018），研究将Bs.tRNATyr CUA替换为Ec.tRNATyr CUA，并与Ec.TyrRS共表达，评估其在构巢曲霉中对琥珀抑制的影响。与亲本菌株GUSY69am表达菌株相比，表达Ec.TyrRS/Ec.tRNATyr CUA对的菌株（Ec.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am的细胞提取物中观察到显著的GUS活性（图2a）。相比之下，在GUSY69am表达菌株中单独表达Ec.tRNATyr CUA或Ec.TyrRS均未显示GUS活性，证明Ec.TyrRS/Ec.tRNATyr CUA对在构巢曲霉中具有正交性（图2a）。
为进一步确认琥珀抑制对Ec.TyrRS/Ec.tRNATyr CUA对的依赖性，使用抗His标签抗体进行Western blot检测His标签标记的GUS（图2b，图S2）。野生型GUS表达菌株显示特异性GUS条带。然而，其他菌株，包括（Ec.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am，无论是否发生琥珀抑制，均未显示GUS条带。（Ec.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am的GUS活性与An.tRNATyr CUA/GUSY69am相当，两者均低于野生型GUS表达菌株活性的1/10,000（图1a和图2a）。推测野生型GUS表达菌株强度1/10,000的条带信号可能无法在Western blot上检测到。因此，这些结果表明，尽管（Ec.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am中发生了琥珀抑制，但其效率不高。
【数据】Bs.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS组合：无GUS活性；Ec.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS组合：有显著GUS活性；单独表达Ec.tRNATyr CUA或Ec.TyrRS：无GUS活性；（Ec.tRNATyr CUA+Ec.TyrRS）/GUSY69am GUS活性：低于野生型的1/10,000
3.3 通过琥珀密码子掺入OMeY
研究考察了Ec.TyrRS/Ec.tRNATyr CUA对在构巢曲霉中将UAA掺入蛋白质的能力。向培养基中添加1 mM OMeY并未使（Ec.tRNA+Ec.TyrRS）/GUSY69am的GUS活性相比不添加OMeY的条件有所增加（图S3）。这表明在构巢曲霉中，野生型Ec.TyrRS未能有效地将OMeY装载到Ec.tRNATyr CUA上，这与哺乳动物细胞和酿酒酵母中的报道一致（Italia等，2018）。
据报道，Ec.TyrRS中的Y37V、D182S、F183M和L186A突变可增强OMeY向tRNA的装载效率（Chin等，2003；Italia等，2018）。此外，Ec.TyrRS中的D165G和D265R突变可加强EcTyrRS-tRNA相互作用（Italia等，2018）。据此，研究构建了E. coli TyrRS六重突变体（Ec.TyrRS*）的表达质粒，并用其替换野生型Ec.TyrRS，以在构巢曲霉中将OMeY掺入GUS。
【数据】OMeY添加浓度：1 mM；Ec.TyrRS突变体：六重突变（Y37V、D182S、F183M、L186A、D165G、D265R）；1 mM OMeY添加：未增加GUS活性
3.4 提高OMeY标记GUS产量的优化策略
（注：原文节选在此处开始，但内容在节选中未完整呈现。根据图4图注信息，研究通过时间进程实验评估了OMeY标记GUS的表达水平，并考察了OMeY添加和H₂O₂诱导的影响，OMeY浓度为0.5 mM。）
【数据】OMeY浓度：0.5 mM；诱导条件：H₂O₂；检测方法：GUS活性测定
讨论与解读
本研究利用E. coli tRNATyr CUA/E. coli TyrRS在构巢曲霉中建立了遗传密码扩展技术，成功将非天然氨基酸OMeY掺入GUS蛋白。结果表明，E. coli tRNATyr CUA/E. coli TyrRS在构巢曲霉中具有有效的正交性。此外，针对E. coli TyrRS底物结合位点的靶向突变提高了OMeY在真菌中的掺入效率，这与该突变在细菌和哺乳动物细胞中的效果一致（Chin等，2003；Italia等，2018）。同时，增加含抑制子tRNA质粒的拷贝数是提高UAA掺入效率的有效策略。这些发现明确证实了在构巢曲霉中利用遗传密码扩展技术的可行性，拓展了其在丝状真菌分子研究中的潜在应用。
尽管当前实验通过增加tRNA拷贝数和增强目标蛋白启动子强度提高了构巢曲霉中UAA标记GUS的产量，但所得产量仍显著低于已建立的宿主表达系统。据报道，E. coli的产量可达每升数百毫克，CHO细胞可达每升克级水平（Schultz，2023）。因此，利用丝状真菌作为细胞工厂生产UAA标记蛋白仍有很大的提升空间。
编译者解读
本研究是遗传密码扩展技术在丝状真菌中的首次系统探索，其方法学价值在于系统比较了不同来源的正交tRNA/TyrRS组合，明确了E. coli来源组合在构巢曲霉中的适用性，并确认了种属来源对tRNA转录适配性的关键影响。研究中通过六重突变改造Ec.TyrRS底物结合口袋、增加tRNA基因拷贝数等策略提升掺入效率，体现了典型的合成生物学"设计-构建-测试-学习"迭代逻辑。值得注意的是，当前UAA标记蛋白产量仍远低于细菌和哺乳动物细胞系统，丝状真菌作为细胞工厂的潜力尚未充分释放。未来若能结合强启动子工程、密码子优化及发酵工艺调控，有望进一步提升产量，推动丝状真菌在蛋白质工程和生物制药领域的应用。
参考来源
Li X. Exploring genetic codon expansion for unnatural amino acid incorporation in filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Biotechnology, 2024. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.07.018
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.07.018