来源：Mechanism investigation for efficient cell-free unnatural amino acid embedding（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
无细胞非天然蛋白质合成（CFUPS）系统已从小规模实验室走向工业化应用，但非天然氨基酸（UNAA）嵌入效率仍受多重因素制约。本研究建立并优化了典型CFUPS平台，系统探究了释放因子1（RF1）、嵌入位点、终止密码子第四位碱基、稀有密码子及正交翻译系统（OTS）正交性对UNAA嵌入的影响。优化后的系统中，绿色荧光蛋白（sfGFP）产量达1306 mg/L，含单个对炔丙氧基-L-苯丙氨酸（pPaF）的修饰sfGFP产量达804 mg/L，含四个pPaF的修饰sfGFP产量仍达197 mg/L。
研究背景
自然界中由20种标准氨基酸构建的蛋白质足以支撑生命活动，但基础与应用科学的持续发展对蛋白质功能提出了更高要求。将含独特官能团的非天然氨基酸嵌入蛋白质，可赋予蛋白质新的理化性质，扩展遗传编码，实现更多样化的功能。该策略已应用于蛋白质结构与动力学研究、翻译后修饰、蛋白质间或蛋白质与核酸间相互作用表征等领域。然而，要推动CFUPS系统的进一步发展与应用，仍需优化UNAA嵌入体系并探究其影响因素。
研究方法
2.1 非天然氨基酸
本研究使用四种非天然氨基酸（UNAA），包括对炔丙氧基-L-苯丙氨酸（pPaF）（VIRTUE-CLARA）[25]、对乙酰-L-苯丙氨酸（pAcF）（MACKLIN）[26]、对叠氮-L-苯丙氨酸（pAzF）（AMTEK）[27]和对苯甲酰-L-苯丙氨酸（pBpF）（AMTEK）[28]。
【数据】UNAA种类：pPaF、pAcF、pAzF、pBpF；供应商：VIRTUE-CLARA、MACKLIN、AMTEK、AMTEK
2.2 质粒构建
质粒详细信息列于表S1。o-aaRS基因连接至pET24a载体，带有N端6×His标签（表S2）。o-tRNA以单拷贝插入pET23a载体，作为扩增模板。编码野生型和修饰型sfGFP的报告基因（图S1）连接至pET23a载体，用于无细胞表达及UNAA嵌入相关机制探究（表S3）。
【数据】载体：pET24a（o-aaRS）、pET23a（o-tRNA、报告基因）；标签：N端6×His
2.3 菌株与培养条件
采用大肠杆菌BL21(DE3)表达o-aaRS酶，大肠杆菌DH10B用于构建质粒，该质粒用于在无细胞系统中表达野生型和修饰型sfGFP的DNA模板。除经典大肠杆菌菌株（表S4）外，还有6株基因组重编码大肠杆菌菌株作为提取物来源（表S5）。所有细菌在Luria-Bertani（LB）培养基中、37℃、200 rpm条件下培养用于常规实验。制备细胞提取物时，使用2×YTP培养基（6 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mM磷酸氢二钾、22 mM磷酸二氢钾）。根据情况添加氨苄青霉素（100 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）。
【数据】菌株：BL21(DE3)、DH10B、6株基因组重编码菌株；培养基：LB、2×YTP；温度：37℃；转速：200 rpm；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、氯霉素34 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL
2.4 粗提取物的制备
挑取单菌落接种于10 mL 2×YTP培养基中。取1 mL过夜培养物接种至200 mL 2×YTP培养基。当OD600达到0.6–0.8时，取50 mL菌液接种至1 L LB培养基中，在最佳培养条件下培养。在对数生长中期至后期（约3–4小时），以8000 rpm离心10分钟收集细胞。用S30A缓冲液洗涤细菌并离心两次。每1 g细菌加入1 mL S30A缓冲液重悬细胞。低温细胞在4℃下高压破碎两次，然后以13,000g离心30分钟。细胞在37℃、120 rpm条件下重悬，避光孵育80分钟。4℃透析过夜并离心后，分装保存于−80℃[29]。
【数据】培养基：2×YTP、LB；OD600：0.6–0.8；离心：8000 rpm、10 min；破碎：4℃高压两次；离心：13,000g、30 min；孵育：37℃、120 rpm、80 min；透析：4℃过夜；保存：−80℃
2.5 o-aaRS的表达与纯化
本研究中使用的o-aaRS序列和结构见图S2–5。携带o-aaRS表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)用1 M IPTG在37℃诱导约4～6小时。收集细胞并用His标签结合缓冲液洗涤三次。重悬细胞并移入高压破碎仪，在15,000～20,000 psi下单次破碎。纯化程序使用ÄKTA Prime系统，配5 mL EzFast Ni HP柱（BestChrom，中国），在4℃下进行。随后用SDS-PAGE检测o-aaRS表达，用蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）测定蛋白浓度。
【数据】诱导剂：1 M IPTG；温度：37℃；时间：4～6 h；破碎压力：15,000～20,000 psi；纯化系统：ÄKTA Prime；层析柱：5 mL EzFast Ni HP；温度：4℃
2.6 o-tRNA的制备
本研究中使用的o-tRNA序列和结构见图S6。该o-tRNA具有转录和切割单元，可自行成熟为tRNA[30]。o-tRNA按前述方法制备[31]。简言之，将o-tRNA基因通过Gibson反应组装入pET23a载体，转化至大肠杆菌DH10B菌株进行测序。从正确菌株中提取质粒，以Pfu DNA聚合酶进行扩增。PCR产物经0.4%琼脂糖凝胶电泳分析（图S7）。结果表明o-tRNA为单一产物，随后通过乙醇沉淀直接从PCR产物中纯化。o-tRNA浓度用超微量分光光度计检测。纯化的o-tRNA直接用于CFUPS反应。
【数据】载体：pET23a；菌株：DH10B；聚合酶：Pfu DNA polymerase；电泳：0.4%琼脂糖凝胶；纯化：乙醇沉淀
2.7 无细胞非天然蛋白质合成
基于经典无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，CFUPS系统还包含纯化的OTS组分，包括o-tRNA、四种不同UNAA及相应的o-aaRS。除非另有说明，所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich。基础CFUPS反应按前述方法进行[31]。简言之，反应体系包含175 mM谷氨酸钾、2.7 mM草酸单钾盐、100 mM谷氨酸、20 mM谷氨酸镁、2 mM除谷氨酸外的19种氨基酸、33 mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、1 mM腐胺、1.5 mM亚精胺、1.2 mM ATP、0.86 mM CTP、GTP和UTP各0.86 mM、0.27 mM辅酶A（CoA）、170 µg/mL大肠杆菌tRNA、75 ng/μL o-tRNA和0.2 μL T7 RNA聚合酶粗提取物。对于不同UNAA，UNAA和o-aaRS的最终浓度经测试确定。加入5 nM表达模板后，将反应置于30℃反应16小时。随后用微孔板读数器（Infinite M200 PR，Tecan，瑞士）在黑色96孔板中检测反应在Ex485/Em535处的荧光强度。
【数据】反应体系：175 mM谷氨酸钾、2.7 mM草酸单钾盐、100 mM谷氨酸、20 mM谷氨酸镁、2 mM 19种氨基酸、33 mM PEP、1 mM腐胺、1.5 mM亚精胺、1.2 mM ATP、0.86 mM CTP/GTP/UTP、0.27 mM CoA、170 µg/mL tRNA、75 ng/μL o-tRNA、0.2 μL T7 RNA聚合酶粗提物；模板：5 nM；温度：30℃；时间：16 h；检测：Ex485/Em535
2.8 sfGFP的定量
用ÄKTA Prime系统配合EzFast Ni HP柱（5 mL）纯化在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的野生型sfGFP，并在Ex485/Em535处检测其荧光强度。使用DC蛋白测定试剂盒（Bio-Rad），以牛血清白蛋白（BSA）为标准品测定野生型sfGFP的蛋白浓度。随后制备不同蛋白浓度梯度的sfGFP，检测相应的荧光强度并绘制标准曲线，该曲线可在线性范围内指示sfGFP蛋白浓度与荧光强度之间的关系，用于评估CFUPS系统中野生型和修饰型sfGFP的表达（图S8）。单位点UNAA嵌入效率按以下公式计算：UNAA嵌入效率（%）= 修饰型sfGFP产量 ÷ 野生型sfGFP产量 × 100%。
【数据】纯化系统：ÄKTA Prime；层析柱：EzFast Ni HP（5 mL）；检测波长：Ex485/Em535；定量方法：DC蛋白测定试剂盒，BSA标准品
2.9 质谱分析
表达产物置于EP管中并标记。随后将EP管送至清华大学蛋白质平台进行质谱分析。使用Protein Prospector分析质谱结果（https://prospector2.ucsf.edu/prospector/mshome.htm）。该软件可分析蛋白可靠性，并提供肽段数量、蛋白丰度、理化性质等信息。
【数据】分析平台：清华大学蛋白质平台；软件：Protein Prospector
研究结果
3.1 单一位点UAG密码子嵌入UNAA
基于CFUPS系统的非天然蛋白质合成需要外源添加相应的OTS组分。OTS包括UNAA以及o-tRNA/o-aaRS配对，其正交性可能影响UNAA嵌入[32]。本实验首先测试了OTS组分的活性。四种不同UNAA（图2A）对应的o-aaRS均来源于古菌Methanocaldococcus jannaschii，带有不同突变。携带四种不同UNAA的o-tRNA均来自同一o-tRNA。纯化的o-aaRS和o-tRNA分别经SDS-PAGE和琼脂糖凝胶电泳分析（图S7）。选择第2位和第23位作为嵌入位点。靠近N端的第2位可检验翻译起始的影响。选择第23位则不影响蛋白质空间结构。从图2B可见，含OTS组的荧光强度高于不含OTS组。四种不同UNAA已成功嵌入sfGFP的不同位点，其中pPaF嵌入效果最佳。添加OTS组分后sfGFP荧光值下降，表明外源添加的OTS组分在一定程度上抑制了蛋白质表达。由于pPaF在上述实验中嵌入效果最佳（图S9），后续优化选用pPaF作为UNAA。
【数据】嵌入位点：第2位、第23位；UNAA来源：Methanocaldococcus jannaschii突变体；最佳UNAA：pPaF
3.2 CFUPS系统优化
在基于粗提取物的CFUPS系统中，来源于粗提取物的转录因子、酶及各种辅因子的类型和活性对蛋白质合成至关重要。不同细胞提取物含有不同的特定因子，可促进蛋白质表达、折叠或翻译后修饰[33]。因此，测试了来源于七种不同商业大肠杆菌菌株的细胞提取物，包括K-12系列（K-12、K-12 ΔtnaA、K-12 ΔtnaAΔsdaB）、BL12系列（BL21(DE3)和BL21 ΔserB）、Rosetta（DE3）和Rosetta-gami B（DE3）。从图2C可见，K12系列菌株的表达效果无论天然还是非天然蛋白质合成系统均较差。BL21系列、Rosetta（DE3）和Rosetta-gami B（DE3）明显优于K12系列，其中Rosetta（DE3）最佳。因此，K12系列菌株不适合无细胞蛋白质合成，Rosetta（DE3）是最佳提取物来源。该结果可能与上述菌株特性有关。因此，在后续实验中，如无特别说明，均使用Rosetta（DE3）作为细胞提取物来源。
反应时间和温度是CFUPS反应的主要条件，影响非天然蛋白质的合成效率。为构建最佳反应体系，分析了野生型sfGFP和修饰型sfGFP（sfGFP2pPaF和sfGFP23pPaF）在25℃、30℃和37℃不同温度下的时间进程。结果表明，sfGFP在30℃时表达水平最高，37℃和25℃时表达水平基本相同（图2D）。sfGFP2pPaF在30℃时表达最高，37℃时最低（图2E）。sfGFP23pPaF在30℃和37℃时表达水平相近，其中30℃最稳定（图2F）。不同蛋白质在同一温度下达到最高稳定点的时间基本相同，不同温度下的最高稳定点为：37℃、5小时；30℃、13小时；25℃、22小时。从表达角度看，30℃可获得不同蛋白质的最大表达量，较高（37℃）或较低（25℃）的温度均不利于蛋白质的过表达。据此确定反应的最佳环境条件为30℃、16小时完成反应，后续实验如无特别说明均在此条件下进行。
由于外源添加OTS组分可能对CFUPS系统造成一定毒性，为实现非天然蛋白质的高效合成，筛选毒性最低、蛋白质表达最高的OTS组分最佳浓度至关重要。为此，筛选了OTS组分的最佳浓度，包括o-tRNA、o-aaRS和UNAA，相应细节见图S10-14。最佳o-tRNA浓度为75 ng/μL。其他组分的最佳浓度为0.04 mg/mL pPaFRS、5 mM pPaF、0.3 mg/mL pAcFRS、2.5 mM pAcF、0.5 mg/mL pAzFRS、2.5 mM pAzF、0.5 mg/mL pBpFRS和5 mM pBpF。
【数据】菌株：K-12、K-12 ΔtnaA、K-12 ΔtnaAΔsdaB、BL21(DE3)、BL21 ΔserB、Rosetta(DE3)、Rosetta-gami B(DE3)；最佳提取物来源：Rosetta(DE3)；温度：25℃、30℃、37℃；最高稳定点时间：37℃/5h、30℃/13h、25℃/22h；最佳反应条件：30℃、16h；最佳o-tRNA浓度：75 ng/μL；最佳组分浓度：0.04 mg/mL pPaFRS、5 mM pPaF、0.3 mg/mL pAcFRS、2.5 mM pAcF、0.5 mg/mL pAzFRS、2.5 mM pAzF、0.5 mg/mL pBpFRS、5 mM pBpF
3.3 RF1缺失系统
大肠杆菌细胞提取物中含有一定量的释放因子1（RF1），RF1与o-tRNA竞争UAG密码子，导致产生截短蛋白，不利于非天然蛋白质的后续纯化和表征[34,35]。因此，本研究选择了四株工程菌rEc.13、rEc13.delA、C321和C321.ΔA（菌株详情见表S5）及其出发菌株MG1655和无细胞系统常用底盘细胞Rosetta（DE3）作为提取物来源菌株。在C321.ΔA和rEc13.delA中，编码RF1的prf基因被敲除。此外，由于不同培养条件下制备的细胞提取物中所含的某些转录和翻译元件可能不同，可能导致CFUPS系统中非天然蛋白质的表达水平不同。本研究探索了YT和YT-P两种培养基，如图3A和图3B所示。比较表明，当提取物为Rosetta（DE3）时，无论何种培养基，sfGFP的表达在所有提取物中均为最佳。然而，C321.ΔA的嵌入效率在所有提取物中最高。由于C321.ΔA菌株中所有TAG密码子均被替换且RF1被敲除，无论培养基类型如何，pPaF嵌入sfGFP单位点的CFUPS嵌入效率均为最高。因此，RF1缺失的无细胞系统显著促进了UNAA的嵌入。
【数据】菌株：rEc.13、rEc13.delA、C321、C321.ΔA、MG1655、Rosetta(DE3)；敲除基因：prf（编码RF1）；培养基：YT、YT-P；最佳表达提取物：Rosetta(DE3)；最高嵌入效率提取物：C321.ΔA
3.4 靠近N端的影响
为探究UNAA嵌入位点距N/C末端的距离对UNAA嵌入效率的影响，在sfGFP的N端和C端之间选择了5个不影响荧光特性的位点，分别为第2位、第23位、第90位、第151位和第211位（图3C）。随后在基于Rosetta（DE3）的优化CFUPS系统中测试了不同位点的嵌入效率。当添加不同浓度的报告基因（0至800 ng）时（图3D），sfGFP的表达呈线性增加。含单位点嵌入的非天然sfGFP并未随质粒浓度增加而增加。测试结果表明，报告基因浓度并非pPaF嵌入的限制因素。对于修饰型sfGFP，第90位点的荧光强度相对较高，第2位点相对较差。当UNAA嵌入位点靠近C端时，嵌入效率略高于N端。
【数据】测试位点：第2、23、90、151、211位；报告基因浓度范围：0–800 ng；最佳嵌入位点：第90位；最差嵌入位点：第2位
3.5 终止密码子第四位碱基
终止密码子后的碱基也可能影响UNAA的嵌入效率[36]。第四位碱基通过与RF相互作用，对肽释放有显著贡献[37]。因此，本研究进一步探究了在不同提取物中选择不同嵌入位点时，第四位碱基效应是否遵循相同规律。用于研究琥珀终止密码子第四位碱基影响UNAA嵌入原理的质粒见表S3。嘌呤核苷酸A或G比嘧啶核苷酸T或C更有利于UNAA嵌入，且不受不同提取物和不同嵌入位点的影响。
【数据】第四位碱基：A/G优于T/C；不受提取物和嵌入位点影响
3.6 多位点相同UNAA嵌入
为探究多位点UNAA嵌入的可能性，在sfGFP中选择了第2位、第90位、第151位和第211位四个位点用于嵌入相同的UNAA（pPaF）（图5A）。使用不同细胞提取物进行多位点pPaF嵌入实验。从图5B可见，使用Rosetta（DE3）提取物时，含两个pPaF的sfGFP表达量最高；使用C321.ΔA提取物时，含四个pPaF的sfGFP表达量最高。Western blot结果（图5C）进一步证实了多位点UNAA嵌入的成功。在优化系统中，含四个pPaF的修饰sfGFP产量达197 mg/L。RI：RNA酶抑制剂；PI：蛋白酶抑制剂。
【数据】多位点嵌入位点：第2、90、151、211位；UNAA：pPaF；含四个pPaF的sfGFP产量：197 mg/L
讨论与解读
本研究系统探究了CFUPS系统中UNAA嵌入的多种影响因素。RF1缺失显著促进UNAA嵌入，C321.ΔA菌株在所有提取物中嵌入效率最高。嵌入位点靠近C端时效率略高于N端，第90位为最佳嵌入位点。终止密码子第四位为嘌呤（A或G）时更有利于UNAA嵌入，且不受提取物和位点影响。通过优化，系统实现了含四个pPaF的sfGFP的高效合成。OTS组分的正交性和浓度对嵌入效率有重要影响。
编译者解读：该研究通过多因素系统解析，为无细胞系统嵌入非天然氨基酸提供了可量化的设计原则。值得注意的是，C321.ΔA菌株的RF1敲除策略与位点偏好性发现，对非天然蛋白的工业化生产具有直接指导价值。然而，研究主要聚焦于pPaF这一种UNAA的深度优化——四种UNAA中仅pPaF被用于后续机制研究，其他三种UNAA的嵌入效率是否遵循相同规律尚不清楚。此外，197 mg/L的四位点嵌入产量虽可观，但多位点嵌入效率随位点数增加的衰减规律仍值得深入探索。未来若能将位点偏好规则与OTS工程化改造结合，有望进一步提升多UNAA嵌入的效率与复杂度。
参考来源
Wang Y. Mechanism investigation for efficient cell-free unnatural amino acid embedding. Process Biochemistry, 2022. DOI: 10.1016/j.procbio.2022.09.015
DOI: 10.1016/j.procbio.2022.09.015