来源：A modular two-stage strategy decoupling biosynthesis from aldehyde formation enables record-high vanillin production in yeast（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
香草醛是全球用量最大的风味化合物，但微生物合成长期受制于前体依赖、细胞毒性和工艺稳健性不足。本研究提出模块化两阶段策略：先在酿酒酵母中构建并优化香草醇的从头生物合成路径，避开胞内香草醛毒性；再通过纯化的香草醇氧化酶（VAO）将发酵液中的香草醇酶法氧化为香草醛。经高细胞密度发酵与酶氧化耦合，最终香草醛产量达到4.0 g/L，为迄今报道的从头合成最高水平。
研究背景
香草醛（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）是全球使用最广泛的风味化合物，在食品、饮料、化妆品和制药行业有大量应用。全球年需求量约2万吨，但来自天然香草荚的香草醛不足1%——植物生物质中香草醛浓度本就极低，且种植与固化过程劳动密集。市场因此由石油化工前体（愈创木酚、木质素衍生物）化学合成的产品主导。消费者对清洁标签成分的需求增长，加上美欧对天然香料的监管定义日益严格，推动了香草醛生物技术生产的研究热潮。经微生物发酵天然碳源生产的香草醛可标注为天然香料，具备商业和监管优势。此前的微生物生产主要依赖结构相关芳香化合物（阿魏酸、丁香酚、异丁香酚）的生物转化，但前体依赖策略受制于成本高、来源有限和底物毒性。本研究旨在开发一条不依赖芳香前体、可完全从简单碳源合成香草醛的新路线。
研究方法
2.1 菌株与质粒
大肠杆菌TOP10和BL21 Star (DE3)（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分别用作质粒构建宿主和VAO异源表达宿主。酿酒酵母菌株D452-2、BY4741和X2180-1A用作香草醇生产宿主。本研究所用全部菌株和质粒列于表S2。
2.2 基因操作
编码以下酶的密码子优化基因由Bionics Co., Ltd.（韩国首尔）合成：来自Podospora pauciseta的3-脱氢莽草酸脱水酶（3DSD）；来自人的儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）；来自谷氨酸棒杆菌和Nocardia iowensis的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）；来自Nocardia sp.、Segniliparus rotundus和Mycobacterium abscessus的芳香羧酸还原酶（ACAR）；以及来自Diplodia corticola、Penicillium simplicissimum和Rhodococcus jostii的VAO（表S3）。表S4列出用于扩增香草醇从头生物合成相关酶和VAO编码基因、以及构建酵母整合质粒和引导RNA（gRNA）质粒的引物组。所得PCR产物使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）按厂家说明书进行组装。
为在酿酒酵母X2180-1A中产生质粒整合的营养缺陷标记，使用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑系统分别破坏HIS3、LEU2和URA3位点。此外，含有截短型可溶性COMT（SCOMT，缺失N端跨膜结构域NTD）的表达盒（TEF1p-SCOMT-CYC1t）被导入CS6、IR10、IR8和IR6位点，以逐步增加SCOMT拷贝数。在X2180-1A中，CS6、IR10、IR8和IR6位点分别是：VII号染色体上YHR19W与YNCH0042C之间的基因间区、XV号染色体上PUP2与ENO1之间的基因间区、XIV号染色体上ACC1与TIM23之间的基因间区、XI号染色体上SRP40与PTR2之间的基因间区。修复DNA片段用表S4所列引物扩增。所得修复DNA片段和gRNA质粒共转化至携带pCas9_AUR的X2180-1A菌株中，以破坏靶基因或导入含目的基因的表达盒。
【数据】菌株：E. coli TOP10/BL21 Star (DE3)、S. cerevisiae D452-2/BY4741/X2180-1A；基因来源：P. pauciseta、H. sapiens、C. glutamicum、N. iowensis、Nocardia sp.、S. rotundus、M. abscessus、D. corticola、P. simplicissimum、R. jostii；整合位点：CS6、IR10、IR8、IR6；标记基因：HIS3、LEU2、URA3
2.3 培养基与培养条件
VAO生产：携带VAO表达质粒的E. coli BL21 Star (DE3)在5 mL LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中、添加50 μg/mL氨苄青霉素、37°C、250 rpm预培养24 h。随后在含100 mL LB培养基（含50 μg/mL氨苄青霉素）的500 mL挡板摇瓶中进行分批发酵，温度和搅拌条件同上。当OD₆₀₀达到0.8–1.0时，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度0.2 mM。诱导后培养物在25°C、200 rpm下继续培养24 h。
所有酿酒酵母菌株在5 mL YP20D培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto™ Peptone、20 g/L葡萄糖）中、30°C、250 rpm预培养48 h。预培养细胞收获后接种至分批发酵培养物中，使初始OD₆₀₀为1.0。分批发酵在含100 mL YP20D或YP50D培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto™ Peptone、50 g/L葡萄糖）的挡板摇瓶中进行。整个发酵过程温度维持在30°C、搅拌速度250 rpm。
以乙醇为碳源时采用逐步补料分批发酵策略。培养开始时加入初始乙醇浓度20–25 g/L，随时间监测乙醇消耗。根据消耗曲线，在后续两个补料步骤中补充乙醇，总乙醇投入量为50 g/L。其他培养条件（包括预培养程序、培养温度和搅拌速度）与含葡萄糖培养基的分批发酵相同。
补料分批发酵在2.5 L生物反应器（Kobiotech Co.，韩国仁川）中进行，含1 L YP20D培养基，初始OD₆₀₀调至1.0。初始葡萄糖耗尽后，以2.1–10.1 mL/h的速率引入含200 g/L酵母提取物、100 g/L Bacto™ Peptone和600 g/L葡萄糖的补料液。培养基pH、温度、搅拌速度和供气量分别维持在5.0、30°C、1000–1200 rpm和2.0–4.0 vvm。培养基pH用2 N HCl和2 N NaOH调节。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/L NaCl；氨苄青霉素：50 μg/mL；预培养：37°C、250 rpm、24 h；诱导剂IPTG：0.2 mM；诱导后：25°C、200 rpm、24 h；酵母预培养：30°C、250 rpm、48 h；初始OD₆₀₀：1.0；YP20D/YP50D培养基：10 g/L酵母提取物+20 g/L Bacto™ Peptone+20或50 g/L葡萄糖；发酵温度/转速：30°C、250 rpm；乙醇初始浓度：20–25 g/L；总乙醇投入：50 g/L；补料分批：2.5 L反应器、1 L YP20D、补料液200 g/L酵母提取物+100 g/L Bacto™ Peptone+600 g/L葡萄糖、速率2.1–10.1 mL/h；pH 5.0；30°C；1000–1200 rpm；2.0–4.0 vvm
2.4 香草醛和香草醇处理后的细胞活力测定
为评估细胞毒性效应，预培养细胞收获后接种至新鲜YP20D培养基中，初始OD₆₀₀为1.0。随后加入香草醛或香草醇至终浓度0–4 g/L。培养48 h后，培养物进行系列稀释（10⁴–10⁷倍），各取100 μL涂布于YP20D琼脂平板。平板在30°C培养48 h后计数菌落形成单位（CFU）。
【数据】处理浓度：0–4 g/L；培养时间：48 h；稀释倍数：10⁴–10⁷倍；涂布量：100 μL；平板培养：30°C、48 h
2.5 分析方法
使用分光光度计（OPTIZEN POP，Mecasys Co., Ltd.，韩国大田）在OD₆₀₀下测定细胞生长。葡萄糖和乙醇浓度使用高效液相色谱（HPLC）系统（Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测定，配备Rezex ROA-Organic Acid H+色谱柱（Phenomenex，Torrance，CA，USA）。代谢物在等温60°C、流速0.6 mL/min条件下，以5 mM硫酸（H₂SO₄）为流动相进行分离，用示差折光检测器检测。
为测定原儿茶酸、香草酸、香草醛和香草醇的胞外浓度，培养上清液稀释十倍并经0.2 μm膜过滤器过滤后进行HPLC分析。胞外代谢物用配备YMC-Pack ODS-A C18色谱柱（150 × 4.6 mm，5 μm；YMC Co., Ltd.，日本京都）的HPLC系统（Vanquish™，Thermo Fisher Scientific）定量。分离在恒定柱温28°C下进行，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1%（v/v）三氟乙酸的水、流动相B为含0.1%（v/v）三氟乙酸的乙腈，程序如下：0–55 min，A:B = 95:5；55–65 min，A:B = 90:10；65–70 min，A:B = 0:100；70–75 min，A:B = 95:5。流速维持在0.5 mL/min，用紫外检测器在270 nm处检测。
【数据】色谱柱：Rezex ROA-Organic Acid H+（糖/醇）、YMC-Pack ODS-A C18 150×4.6 mm 5 μm（芳香代谢物）；柱温：60°C（糖/醇）、28°C（芳香代谢物）；流速：0.6 mL/min（糖/醇）、0.5 mL/min（芳香代谢物）；流动相：5 mM H₂SO₄（糖/醇）、0.1% TFA水/乙腈梯度（芳香代谢物）；检测：示差折光（糖/醇）、UV 270 nm（芳香代谢物）；样品稀释：10倍；过滤：0.2 μm
2.6 基于结构的ACAR突变位点鉴定
使用AlphaFold3服务器生成S. rotundus ACAR（ACARSr）的氨基酸序列结构模型。从蛋白质数据库（Protein Data Bank）获取S. rugosus ACAR各结构域的3D晶体结构作为参考结构，包括腺苷化结构域（PDB: 5MSW）、硫醇化（磷酸泛酰巯基乙胺载体蛋白）结构域（PDB: 5MSS）和还原酶结构域（PDB: 5MSV）。由于这些晶体结构代表单个结构域而非全长酶，使用AlphaFold3生成了全长ACARSr模型，并用PyMOL与参考ACAR结构域进行结构比对。该结构比对能够鉴定ACARSr中与S. rugosus ACAR此前报道的突变位点相对应的氨基酸残基。随后在鉴定的位点进行定点突变。
【数据】参考结构：PDB 5MSW（腺苷化）、5MSS（硫醇化）、5MSV（还原酶）；建模工具：AlphaFold3；比对工具：PyMOL
2.7 胞内蛋白组分制备与His标签蛋白纯化
（原文此节内容未完整提供，以下按节选忠实翻译）
研究结果
3.1 酿酒酵母上游香草醇生物合成路径的构建
为实现从葡萄糖从头生物合成香草醇，首先构建了香草醇生物合成路径的上游区段，将芳香族氨基酸生物合成的关键前体——脱氢莽草酸（DHS）转化为香草酸。在该区段中，DHS经3DSD和COMT催化的连续反应，通过原儿茶酸转化为香草酸（图1）。为此，将P. pauciseta来源的3DSD和人源COMT导入初始宿主菌株酿酒酵母D452-2。
人源COMT含有将酶锚定至细胞膜的NTD，形成膜结合形式。鉴于人与酵母膜结构的差异，推测这种膜结合在酵母中会损害COMT活性。为验证这一假设，构建了缺失NTD的SCOMT，并与野生型酶进行比较。此外，由于膜蛋白的折叠和活性受表达水平强烈影响，采用两个转录特征不同的启动子来控制两种COMT变体的表达：截短的HXT7启动子（tHXT7p）在葡萄糖和乙醇上均提供强组成型转录，而TEF1启动子（TEF1p）则实现不依赖碳源的稳定、中等强度组成型表达。
在测试的组合中，仅TEF1p转录控制下表达SCOMT的菌株（DTEF1SCOMT）产生了可检测的香草酸，产量为66 mg/L（图2A）。表达野生型COMT的菌株未检测到香草酸积累，表明NTD对酿酒酵母中COMT活性有负面影响。此外，tHXT7p驱动的SCOMT表达也未产生可检测的香草酸，提示发酵早期过强的组成型表达不利于SCOMT发挥功能活性。虽然未定量比较转录水平，但所用启动子（包括tHXT7p）驱动的下游基因转录已得到确认。因此，某些组合中未观察到香草酸产生不太可能归因于转录缺失，而更可能归因于蛋白表达水平和/或功能酶活性层面的限制。综上，去除COMT的NTD并适当控制其表达水平，是在酵母中建立有活性的香草酸生物合成上游路径的关键。
为确定香草醇生产的最佳宿主菌株，将最初在D452-2中构建的上游香草醇生物合成路径导入两个常用实验室单倍体菌株BY4741和X2180-1A并比较其性能。携带上游路径的BY4741菌株（BTEF1SCOMT）未产生可检测的香草酸，而X2180-1A菌株（XTEF1SCOMT）产生了107 mg/L香草酸（图2B）。这一差异可能归因于宿主菌株间遗传背景和路径兼容性的不同。值得注意的是，XTEF1SCOMT达到的产量比D452-2菌株（DTEF1SCOMT）高34%。基于这些结果，选择XTEF1SCOMT作为后续香草醇生产实验的宿主菌株。
【数据】DTEF1SCOMT香草酸产量：66 mg/L；XTEF1SCOMT香草酸产量：107 mg/L；产量提升：34%；野生型COMT：未检出；tHXT7p-SCOMT：未检出
3.2 酿酒酵母完整香草醇生物合成路径的建立
在构建从头香草醇生物合成的下游路径之前，通过比较香草醛和香草醇对酿酒酵母的毒性效应来确立该策略的合理性。为此，在酿酒酵母X2180-1A培养物中分别添加0.5、2.0和4.0 g/L的香草醛或香草醇，定量比较活细胞数。对两种化合物而言，提高添加浓度均降低活细胞数（图S1）。但香草醛处理培养物的下降幅度远大于香草醇处理。在4.0 g/L浓度下，香草醛处理导致CFU/mL比未处理对照减少94%。相比之下，4.0 g/L香草醇处理仅使CFU/mL下降33%，相当于活细胞数比香草醛处理高12倍。这些结果表明香草醇对酿酒酵母的细胞毒性压力显著低于香草醛。基于这一观察，继续构建香草醇生物合成的下游路径，从而完成完整的从头香草醇生产路径。
从头香草醇生物合成的下游路径涉及ACAR催化的香草酸还原为香草醛，随后由酿酒酵母内源还原酶将香草醛还原为香草醇（图1）。由于ACAR需要经磷酸泛酰巯基乙胺化进行翻译后激活，共表达PPTase对催化活性至关重要。此前研究表明，异源表达的ACAR常因非同源PPTase激活效率低而活性有限或可忽略。为解决这一问题，系统评估了ACAR与PPTase之间的兼容性，构建了包含三种ACAR和三种不同微生物来源PPTase的组合文库，共产生九种ACAR–PPTase组合。随后定量香草醇产量以评估功能性配对效率。在测试的组合中，仅ACARSr与N. iowensis来源PPTase（PPTaseNi）共表达产生了可检测的香草醇（图S2），表明ACAR活性强烈依赖于同源或兼容的PPTase配对。
考虑到过强的组成型表达可能损害异源表达酶的功能活性，通过调节ACARSr和PPTaseNi的表达水平来优化香草醇生物合成下游路径。由于高效的ACAR活性需要PPTase介导的翻译后激活，这些酶的平衡且可独立调节的表达对有效的下游转化至关重要。因此，ACARSr和PPTaseNi在转录强度分级的组成型启动子下表达。将酿酒酵母中五个常用启动子（tHXT7p、TEF1p、PGK1p、GPDp和ADH1p，从强到弱）组合配对，产生25种表达构型。该策略能够系统鉴定ACARSr–PPTaseNi的最佳表达平衡，以高效生产香草醇，同时最小化代谢负担。
在测试的启动子组合中，当PPTaseNi在与ACARSr相同或更强的启动子下表达时，观察到更高的香草醇产量（图3和图S3）。值得注意的是，当PPTaseNi在最强启动子tHXT7p下表达、ACARSr在中等强度启动子PGK1p下表达时，香草醇产量最高，达到107 mg/L。该产量比对照菌株XPPTaseNi/ACARSr（两种酶均在tHXT7p转录控制下过表达）高62%。这些结果表明，激活酶PPTaseNi与催化酶ACARSr之间的最佳化学计量比，比单纯最大化各酶的表达水平更能决定产物形成的效率。
【数据】香草醛4.0 g/L处理：CFU/mL下降94%；香草醇4.0 g/L处理：CFU/mL下降33%；活细胞数差异：12倍；最佳组合：tHXT7p-PPTaseNi/PGK1p-ACARSr；香草醇产量：107 mg/L；比对照提高：62%；ACAR-PPTase组合：9种；启动子组合：25种
3.3 碳源类型和浓度对香草醇生产的影响
（原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，以下按可获得的原文内容忠实翻译）
为评估碳源对香草醇生产的影响，将最优菌株XtHXT7pPPTaseNi/PGK1pACARSr分别在含20 g/L葡萄糖、50 g/L葡萄糖或20 g/L乙醇的培养基中培养，监测碳源消耗和细胞生长的时间曲线（图4A–C），并比较不同碳源条件下的香草醇产量（图4D）。
【数据】葡萄糖浓度：20 g/L、50 g/L；乙醇浓度：20 g/L；菌株：XtHXT7pPPTaseNi/PGK1pACARSr
3.4 SCOMT拷贝数和结构引导的ACARSr工程对香草醇生物合成的影响
（原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，以下按可获得的原文内容忠实翻译）
通过逐步增加SCOMT拷贝数，比较原儿茶酸、香草酸和香草醇的产量变化（图5A–C）。同时，基于结构引导的ACARSr工程改造（图5D），评估突变对香草醇生产的影响。
【数据】SCOMT拷贝数：逐步增加（原文未详述各拷贝数对应产量）；ACARSr突变位点：结构引导鉴定（原文未详述具体突变）
3.5 乙醇补料和高细胞密度培养条件下的时间曲线
（原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，以下按可获得的原文内容忠实翻译）
在乙醇补料和高细胞密度培养条件下，监测XtHXT7pPPTaseNi/PGK1pACARSr/2SCOMT和XtHXT7pPPTaseNi/PGK1pACARK522S/A625L/2SCOMT菌株的碳源消耗和细胞生长时间曲线（图6A、B）。
【数据】菌株：XtHXT7pPPTaseNi/PGK1pACARSr/2SCOMT、XtHXT7pPPTaseNi/PGK1pACARK522S/A625L/2SCOMT；培养条件：乙醇补料、高细胞密度（原文未详述具体参数）
3.6 基于VAO的体外反应将香草醇转化为香草醛
（原文此节内容在提供的节选中未完整呈现，以下按可获得的原文内容忠实翻译）
对来自Penicillium simplicissimum（VAOPs）、Diplodia corticola（VAODc）和Rhodococcus jostii（VAORj）的重组VAO在大肠杆菌BL21 Star (DE3)细胞质中的表达进行SDS–PAGE分析（图7A）。经简单调节发酵液pH后，用纯化的VAO催化香草醇氧化为香草醛。在分批、逐步补料分批和补料分批发酵模式下，转化效率达到83%–97%。高细胞密度发酵与酶氧化耦合后，香草醛产量最高达4.0 g/L。
【数据】VAO来源：P. simplicissimum、D. corticola、R. jostii；表达宿主：E. coli BL21 Star (DE3)细胞质；转化效率：83%–97%；发酵模式：分批、逐步补料分批、补料分批；最高香草醛产量：4.0 g/L
讨论与解读
本研究开发了模块化两阶段香草醛生产策略，将微生物生物合成与醛形成解偶联。工程化酿酒酵母高效从头合成香草醇，随后经酶氧化步骤转化为香草醛，从而规避了胞内香草醛积累带来的细胞毒性和代谢限制。逐步路径优化揭示香草醇生产受不同限速步骤控制。增加SCOMT拷贝数增强甲基化能力，在发酵、呼吸和高细胞密度条件下均提高了产量；而ATP和NADPH依赖的ACAR催化还原步骤的优化则表现出强烈的背景依赖性。这些结果强调了路径设计与碳源和代谢状态相匹配的重要性，尤其是在工艺放大过程中。高细胞密度发酵与VAO催化氧化的整合使香草醛产量达到4.0 g/L，为迄今报道的从头合成最高水平。此外，以香草醇作为主要发酵产物、仅在需要时才将其转化为香草醛，通过减轻下游处理过程中吸附相关的产物损失，进一步增强了工艺稳健性。
编译者解读：该研究的核心价值在于"解偶联"思维——将有毒醛类产物的生成从微生物发酵中剥离，用两步法替代传统的一步发酵。这种策略巧妙回避了香草醛对酵母的毒性瓶颈，同时利用香草醇作为稳定中间体，为其他毒性芳香醛（如苯甲醛、肉桂醛）的微生物生产提供了可迁移的范式。从合成生物学工程角度看，启动子组合筛选与结构引导突变相结合的系统优化思路值得借鉴。局限在于酶氧化步骤需额外纯化VAO并调节pH，增加了下游工艺复杂度；4.0 g/L虽为报道最高，距工业化仍有距离。未来若能在体内耦合VAO表达或开发更简单的氧化方案，有望进一步提升经济性。
参考来源
Oh, S. A modular two-stage strategy decoupling biosynthesis from aldehyde formation enables record-high vanillin production in yeast. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.180818
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180818