来源：Dual-module engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient glucose-xylose Co-utilization via secretory xylose isomerase and xylulose transport activation（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素水解液中的葡萄糖与木糖共发酵长期受制于碳代谢物阻遏和木糖转运效率低下。本研究提出"分泌型木糖异构酶（XI）+木酮糖转运激活"双模块工程策略：将木糖在胞外异构化为木酮糖，绕过胞内代谢瓶颈，同时利用酿酒酵母内源及异源转运蛋白对木酮糖的高效摄取。结果显示，分泌型XI菌株在混合糖中木糖消耗率达75.2%，较胞内表达菌株提升6.4倍，为木质纤维素生物炼制提供了新范式。
研究背景
木质纤维素生物质富含于农业残留物、杂草、木材废料等固体废弃物中，经水解和发酵可生产醇类、微生物油脂、有机酸等化学品。其水解产物为己糖和戊糖混合物，主要为葡萄糖（60%–70%）和木糖（30%–40%）。纤维素来源的葡萄糖可被微生物高效利用，但半纤维素来源的木糖同化效率低下，严重制约木质纤维素资源的工业化应用。天然具备木糖代谢能力的微生物稀少，且常面临底物偏好性强、碳代谢物阻遏（CCR）和生产力低下等问题。酿酒酵母作为生物制造的关键微生物底盘，其碳源利用效率直接影响生物燃料和高值化学品的生产经济性，但天然酿酒酵母缺乏内源木糖代谢途径。因此，工程化改造微生物菌株以实现混合糖（尤其是葡萄糖-木糖）的高效共利用，是木质纤维素生物质大规模工业化增值的关键路径。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
大肠杆菌DH5α作为基因克隆宿主，购自武汉YB Cell公司。酿酒酵母INVSc1（MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52）和酿酒酵母BY4741（MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52）购自美国ThermoFisher Scientific Incubator。己糖转运缺陷型菌株酿酒酵母EBY.VW4000（MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δstl1 Δagt1 leu2-3112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8c SUC2）由德国法兰克福大学Eckhard Boles教授惠赠。酿酒酵母INVSc1因其遗传背景清晰、转化效率高、生长稳健，被选为代谢工程的主要宿主。INVSc1、BY4741和EBY.VW4000分别用于表征不同碳源的转运能力，其中EBY.VW4000作为零背景对照，用于明确木酮糖摄取是否依赖己糖转运蛋白活性。用于酿酒酵母GAL80位点定点整合的表达载体pUMRI按文献构建。编码异源木糖转运蛋白N326Xtr1p（GenBank: XP_006966515）的基因此前已克隆至该载体，获得质粒pUMRI-N326FXtr1p，保存于实验室。编码PirXI（GenBank: CAB76571.1）的核苷酸序列基于酿酒酵母密码子偏好性，使用GenSmart密码子优化工具进行优化，由上海生工生物工程股份有限公司合成。酵母提取物和蛋白胨等化学试剂及培养基组分购自美国Sigma-Aldrich。氨基酸（组氨酸、亮氨酸、色氨酸）和木酮糖购自中国Macklin公司。合成完全（SC）氨基酸混合物由Coolaber公司提供。木糖、葡萄糖、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）、硫酸（H₂SO₄）和盐酸（HCl）等标准化学品购自国药集团化学试剂有限公司。LB培养基（0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1% NaCl、1%葡萄糖）用于大肠杆菌常规培养；YPD培养基（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1%葡萄糖）用于酿酒酵母常规培养。YPD、YPX（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1%木糖）和YPDX（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、0.4%葡萄糖、1%木糖）培养基用于测试重组酿酒酵母的木糖利用能力。含0.4%葡萄糖和1%木糖的合成完全缺陷培养基（SCDX）、1%木糖（SCX）和1%葡萄糖（SC）也用于测试重组菌株的木糖利用能力。YPX和YP10Xylu培养基（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1%木酮糖）用于测试重组菌株的木糖和木酮糖利用能力。使用合成完全缺陷尿嘧啶（SC-Ura）培养基筛选重组酿酒酵母菌株。YPD、YPX、YP（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨）和YP10Xylu培养基用于重组菌株的转录组分析。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae INVSc1、BY4741、EBY.VW4000；培养基：LB、YPD、YPX、YPDX、SC、SCX、SCDX、YP10Xylu、SC-Ura；碳源浓度：葡萄糖0.4%–1%、木糖1%、木酮糖1%；温度与时间：原文未详述
2.2 整合表达质粒在酿酒酵母INVSc1中表达XI和N326FXtr1p
采用同源重组将信号肽片段连接至载体pUMRI-N326FXtr1p，构建分泌表达载体pUMRI-N326FXtr1p-SS，用于PirXI在酿酒酵母中的胞外表达。将PirXI基因序列成功克隆至pUMRI-N326FXtr1p和pUMRI-N326FXtr1p-SS表达载体，获得两种重组构建体：胞内表达质粒pUMRI-PirXI-N326FXtr1p和分泌表达质粒pUMRI-N326FXtr1p-SS-PirXI。经验证的含XI质粒pUMRI-N326FXtr1p-PirXI（简称pUMRI-PirXI）和pUMRI-N326FXtr1p-SS-PirXI（简称pUMRI-SS-PirXI）经SfiI线性化后，通过电穿孔法转化至酿酒酵母INVSc1。线性化质粒通过同源重组整合至酿酒酵母INVSc1的GAL80位点。重组菌株INVSc1 PirXI和INVSc1 SS-PirXI通过SC-Ura培养基筛选，并用聚合酶链式反应（PCR）验证目标XI基因。随后，将验证正确的重组菌株INVSc1 PirXI和INVSc1 SS-PirXI以初始OD600为1.0接种至YPD、YPX、YPDX、SC、SCX和SCDX培养基中，间隔取样测定细胞生长、残余木糖、单位细胞干重（DCW）的糖消耗量及PirXI酶活。将重组菌株INVSc1 PirXI和INVSc1 SS-PirXI以初始OD600为20.0接种至YPX和YP10Xylu培养基中，间隔取样测定残余木糖、残余木酮糖和乙醇产量。
【数据】接种OD600：1.0（生长与糖消耗实验）、20.0（高密度发酵实验）；整合位点：GAL80；筛选培养基：SC-Ura；转化方法：电穿孔；验证方法：PCR
2.3 XI的纯化与酶活测定
XI的分泌表达通过将木糖胞外转化为木酮糖来规避胞内瓶颈。将酿酒酵母INVSc1 PirXI的培养物以1600 g离心5 min收集细胞。细胞用预冷的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）洗涤两次，然后重悬于预冷的细胞裂解缓冲液中。使用均质机在1200 bar压力下破碎细胞，离心收集酿酒酵母INVSc1 PirXI的细胞上清液。酿酒酵母INVSc1 SS-PirXI的培养上清液通过4°C、16,000 g离心10 min收集。将INVSc1 PirXI的细胞上清液和INVSc1 SS-PirXI的培养上清液分别上样至Ni螯合树脂，并用含20 mM咪唑的平衡缓冲液持续洗涤。使用3倍柱体积含200 mM咪唑的平衡缓冲液进行梯度洗脱和蛋白纯化。纯化蛋白使用截留分子量为10 kDa的Vivaflow® 50超滤膜超滤浓缩。纯化酶经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，用柠檬酸钠缓冲液稀释后储存于4°C。蛋白浓度使用Bradford蛋白定量试剂盒（上海碧云天）测定。木糖异构酶酶活采用半胱氨酸-甲酚法测定。具体反应体系如下：依次加入50 μL 100 mM木糖溶液、500 μL 50 mM马来酸缓冲液（pH 6.6）、50 μL 10 mM MnCl₂溶液、200 μL酶液和150 μL去离子水，混匀后在37°C水浴中孵育20 min。水浴结束后，向反应体系中加入50 μL 50%三氯乙酸溶液终止反应。然后依次加入200 μL 1.5%半胱氨酸盐溶液、6 mL 13 M硫酸和200 μL 0.12%甲酚乙醇溶液，混匀后在37°C水浴中孵育20 min显色。最后使用酶标仪在540 nm处检测吸光度值，根据标准曲线计算对应的木酮糖含量。一个酶活单位定义为每分钟产生1 μmol木酮糖所需的酶量。
【数据】离心条件：1600 g/5 min（细胞收集）、16,000 g/10 min/4°C（培养上清）；破碎压力：1200 bar；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）；咪唑浓度：20 mM（洗涤）、200 mM（洗脱）；超滤膜截留：10 kDa；酶活测定：半胱氨酸-甲酚法，540 nm检测；反应体系：100 mM木糖50 μL、50 mM马来酸缓冲液（pH 6.6）500 μL、10 mM MnCl₂ 50 μL、酶液200 μL、去离子水150 μL；反应条件：37°C、20 min；终止液：50%三氯乙酸50 μL；显色液：1.5%半胱氨酸盐200 μL、13 M硫酸6 mL、0.12%甲酚乙醇200 μL；酶活单位定义：1 μmol木酮糖/min
2.4 酿酒酵母INVSc1和BY4741对不同碳源摄取能力的测定
将活化的酿酒酵母INVSc1和BY4741接种至100 mL YPD培养基中，在摇床中过夜培养。
【数据】培养基：YPD 100 mL；培养方式：摇床过夜；温度：原文未详述
研究结果
3.1 PirXI分泌表达增强酿酒酵母INVSc1的木糖利用效率
为评估分泌型PirXI表达对木糖代谢的影响，我们比较了分泌型XI菌株（酿酒酵母INVSc1 SS-PirXI）和胞内XI菌株（酿酒酵母INVSc1 PirXI）在含木糖培养基中的生长和木糖利用曲线。在YPX培养基（木糖为唯一碳源）中，酿酒酵母INVSc1 SS-PirXI表现出更优性能：培养120 h后，其生物量达2.01 g/L（对比INVSc1 PirXI的1.12 g/L），木糖利用率28.2%（对比10.30%）（图1a和b）。与此一致，在SCX合成培养基中，INVSc1 SS-PirXI的木糖利用效率显著高于INVSc1 PirXI（图S1），证实胞外XI活性缓解了胞内代谢限制。此前研究报道，重组酿酒酵母在含4 g/L葡萄糖和10 g/L木糖的混合糖培养基中表现出最高的木糖利用率。因此，本研究进一步分析了PirXI分泌表达对重组酿酒酵母在混合糖培养基中木糖利用的影响。在YPDX培养基中，INVSc1 SS-PirXI实现75.2%的木糖利用率（对比胞内菌株的11.8%），生物量达4.99 g/L（对比2.45 g/L）（图1c–d）。SCDX培养基中的平行实验验证了上述趋势（图S2），证明分泌型XI表达克服了葡萄糖-木糖共利用的瓶颈。值得注意的是，INVSc1 SS-PirXI在混合糖中120 h的木糖消耗率为75.2%，是胞内菌株11.8%的6.4倍，凸显了胞外异构化的优势。
【数据】YPX培养基（120 h）：生物量2.01 g/L（SS-PirXI）vs 1.12 g/L（PirXI）；木糖利用率28.2% vs 10.30%；YPDX培养基：木糖利用率75.2% vs 11.8%；生物量4.99 g/L vs 2.45 g/L；倍数提升：6.4倍
3.2 酿酒酵母INVSc1 PirXI对木酮糖的利用效率优于木糖
PirXI的分泌表达实现了木糖向木酮糖的胞外异构化。为验证酿酒酵母INVSc1 PirXI优先利用木酮糖而非木糖的假设，我们在单一碳源条件（10 g/L木糖或10 g/L木酮糖）下进行了高细胞密度发酵（初始OD600 = 20），以最小化生长速率对代谢活性的干扰。在木糖唯一碳源培养基中，INVSc1 PirXI的木糖同化有限：24 h时残余木糖达6.79 g/L，乙醇产量可忽略不计（图2）。相比之下，当木酮糖作为唯一碳源时，其被快速消耗，残余木酮糖降至2.82 g/L。这种高效消耗伴随2.09 g/L乙醇的产生，对应每克木酮糖消耗产生0.29 g乙醇的得率（图2）。这一鲜明对比证实，INVSc1 PirXI天然代谢木酮糖的效率远高于木糖，且乙醇合成与木酮糖摄取紧密偶联。这些发现凸显了分泌型XI工程的优势——胞外异构化有效规避了胞内瓶颈（如Gre3p介导的木糖醇积累）。此外，观察到的木酮糖消耗速率强调了胞外代谢通道化在木质纤维素生物炼制应用中的巨大潜力。
【数据】初始OD600：20；木糖唯一碳源（24 h）：残余木糖6.79 g/L，乙醇≈0；木酮糖唯一碳源（24 h）：残余木酮糖2.82 g/L，乙醇2.09 g/L；乙醇得率：0.29 g/g木酮糖
3.3 分泌表达增强PirXI催化活性
为阐明分泌型XI表达菌株木糖利用改善的机制，我们比较了胞内和分泌型PirXI的酶学性质。使用半胱氨酸-甲酚红比色法分析粗酶提取物和纯化蛋白。胞内PirXI酶活在48 h达到峰值，而分泌型PirXI在24 h即达到最大酶活（图3a）。这一时间变化与分泌型菌株更快的木糖消耗一致（图1）。纯化的SS-PirXI（0.78 ± 0.03 IU/mg）比活较胞内PirXI（0.71 ± 0.02 IU/mg）高9.9%（图3b），比色测定中更深的紫红色也证实了这一点（图S3）。这些发现表明，分泌表达加速了酶活化，增强了混合糖体系中木糖向木酮糖的转化。
【数据】胞内PirXI酶活峰值：48 h；分泌型PirXI酶活峰值：24 h；比活：SS-PirXI 0.78 ± 0.03 IU/mg vs PirXI 0.71 ± 0.02 IU/mg；提升幅度：9.9%
3.4 酿酒酵母INVSc1和BY4741内源转运蛋白对木酮糖具有更优转运效率
为评估酿酒酵母INVSc1内源转运蛋白的底物偏好性，我们使用静息细胞定量测定了单一碳源和混合碳源条件下的木糖和木酮糖摄取。在单一碳源体系（10 g/L葡萄糖、木糖或木酮糖）中，酿酒酵母INVSc1快速消耗葡萄糖（120 min时残余量为0.00 g/L），而木糖摄取可忽略不计（残余量9.87 g/L）。引人注目的是，在相同条件下木酮糖摄取量达1.26 g/L（图4a），表明木酮糖的转运效率高于木糖。单倍体酿酒酵母BY4741也观察到类似趋势，木酮糖摄取量（1.55 g/L）超过木糖转运的4.69倍（图4b）。我们进一步测试了混合碳源体系（4 g/L葡萄糖+10 g/L木糖或木酮糖）中的转运蛋白性能。在葡萄糖和木糖混合物中，由于葡萄糖竞争，木糖摄取仍受抑制（180 min时残余量9.98 g/L）（图4c）。相反，在葡萄糖和木酮糖混合物中，木酮糖被高效共摄取，残余量降至8.81 g/L（对比初始10 g/L）（图4c）。单倍体酿酒酵母BY4741呈现相同模式，在混合糖中实现1.92 g/L的木酮糖摄取（图4d）。这些结果强调了胞外生成木酮糖的显著优势——内源转运蛋白因其底物选择性而偏好木酮糖而非木糖。
【数据】INVSc1单糖体系（120 min）：葡萄糖残余0.00 g/L、木糖残余9.87 g/L、木酮糖摄取1.26 g/L；BY4741单糖体系：木酮糖摄取1.55 g/L，为木糖的4.69倍；INVSc1混合糖（180 min）：木糖残余9.98 g/L、木酮糖残余8.81 g/L（摄取1.19 g/L）；BY4741混合糖：木酮糖摄取1.92 g/L
3.5 异源转运蛋白N326FXtr1p增强木酮糖摄取且不受葡萄糖抑制
为解析内源和异源转运蛋白在木酮糖转运中的作用，我们比较了酿酒酵母EBY.VW4000（己糖转运蛋白敲除）和INVSc1-N326FXtr1p（表达异源木糖转运蛋白N326FXtr1p）的木酮糖摄取能力。在单一碳源和混合碳源条件下，酿酒酵母EBY.VW4000在180 min内对葡萄糖、木糖或木酮糖均无检测到的摄取（图5a–b），表明天然木酮糖转运依赖于己糖转运蛋白（Hxt家族）。相比之下，酿酒酵母INVSc1-N326FXtr1p表现出强劲的木酮糖摄取：180 min时胞外木酮糖在单一碳源条件下减少3.20 g/L，在葡萄糖-木酮糖混合碳源条件下减少3.12 g/L（图5c和d），表明N326FXtr1p介导高效的木酮糖转运。值得注意的是，INVSc1-N326FXtr1p在单一碳源和混合碳源中的木酮糖摄取量分别超过野生型酿酒酵母INVSc1的2.54倍和2.62倍（对比图4a和c），证实N326FXtr1p对木糖和木酮糖具有双重转运功能。关键的是，木酮糖转运不受葡萄糖共存的影响（图5e）：INVSc1-N326FXtr1p在葡萄糖-木酮糖混合物中消耗3.12 g/L木酮糖，与单一碳源条件下的3.20 g/L相当。这种葡萄糖兼容性与葡萄糖对木糖摄取的竞争性抑制形成鲜明对比（图4c），凸显了木酮糖在混合糖体系中的代谢优势。这些发现确立了N326FXtr1p作为一种可绕过葡萄糖阻遏的广谱转运蛋白，与分泌型XI协同实现葡萄糖和木糖衍生木酮糖的共利用。
【数据】EBY.VW4000（180 min）：葡萄糖/木糖/木酮糖摄取均为0；INVSc1-N326FXtr1p（180 min）：单碳源木酮糖减少3.20 g/L、混合碳源减少3.12 g/L；倍数提升：2.54倍（单碳源）、2.62倍（混合碳源）vs野生型INVSc1
3.6 转录组学揭示木酮糖诱导的类葡萄糖代谢重编程
为解析木糖与木酮糖利用之间的代谢差异，我们对在无碳（C）、葡萄糖（D）、木糖（X）或木酮糖（XY）的YP培养基中培养的重组酿酒酵母INVSc1 PirXI进行了RNA-seq分析。主成分分析（PCA）确认了三组生物学重复的高重现性，各组的生物学重复紧密聚类。
【数据】转录组条件：无碳（C）、葡萄糖（D）、木糖（X）、木酮糖（XY）；生物学重复：3组；分析方法：RNA-seq、PCA
讨论与解读
本研究建立了"胞外异构化-快速摄取"双模块工程策略，将分泌型木糖异构酶与木酮糖转运增强相结合。相比传统胞内XI策略，双模块系统在酿酒酵母INVSc1 SS-PirXI中实现了混合糖共利用的显著提升——木糖消耗增加6.4倍（75.2%对比11.8%），乙醇产量更优。尽管分泌型XI和异源木糖转运蛋白此前已被分别探索，本研究的真正新颖之处在于将两个模块作为集成系统进行协同组合和系统验证。该策略从根本上重新规划了木糖的代谢入口：胞外异构化将初始限速步骤与胞内竞争和还原酶干扰解耦，而随后的木酮糖（而非木糖）转运利用了更高效且对葡萄糖不敏感的摄取机制。这创造了一个"代谢漏斗"，将传统胞内途径中混杂的异构化和摄取挑战分离，实现了此前未报道的共利用协同效应。工程菌株的优越性能源于两个模块的协同优化：分泌型PirXI的比活较胞内形式高9.9%，且酶活达到峰值的时间更早（24 h对比48 h）。
编译者解读：该研究巧妙利用了酿酒酵母天然偏好木酮糖而非木糖的代谢特性，通过"胞外异构化"将木糖转化为更易利用的木酮糖，同时筛选出不受葡萄糖抑制的木酮糖转运蛋白，双模块协同突破了传统木糖代谢工程中葡萄糖阻遏与转运效率的双重瓶颈。从合成生物学应用角度看，这种"改变底物进入途径而非强行改造既有代谢通道"的策略具有普适性——它提示我们，有时候绕开问题比解决问题更高效。然而，分泌型XI的长期操作稳定性、木酮糖的商业可得性以及放大生产中的成本控制，仍是产业化前需要回答的问题。此外，N326FXtr1p作为广谱己糖转运蛋白，其对其他糖类的非特异性转运是否会影响发酵底物谱，也值得后续关注。
参考来源
期刊：Biomass and Bioenergy, 2026
DOI: 10.1016/j.biombioe.2025.108863
DOI: 10.1016/j.biombioe.2025.108863