来源：De novo production of sebacic acid from glucose by Saccharomyces cerevisiae via engineered ω-oxidation and β-oxidation pathways（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
癸二酸（SA）是制造生物基尼龙、增塑剂和润滑剂的重要工业原料，传统上依赖蓖麻油热裂解获得，存在供应集中、工艺污染严重等问题。本研究利用CRISPR-Cas9对酿酒酵母进行系统性代谢工程改造：敲除6个脂肪酸降解基因后获得癸二酸前体——癸酸（DA）高产菌株6KO（28.9 mg/L），随后整合热带假丝酵母的ω-氧化途径四基因，经Ty1转座子多拷贝整合与GAL1启动子诱导调控的逐步优化，最终工程菌株SAW6_5从葡萄糖直接合成癸二酸38.8 mg/L，为目前工程酵母报道的最高水平。
研究背景
癸二酸（C10H18O4）是一种含有两个末端羧基的高价值饱和二元脂肪酸。2024年全球癸二酸市场估值2.863亿美元，预计2034年达3.737亿美元，年复合增长率3%。其结构特性使其广泛用于尼龙单体、增塑剂、润滑剂和化妆品添加剂。工业癸二酸主要来源于蓖麻油，但蓖麻种植与加工存在显著问题：全球供应高度集中（印度占50%以上），中国种植面积萎缩且劳动力短缺；蓖麻籽含蓖麻毒素等毒性蛋白；传统碱熔法（230–290°C，浓NaOH和苯酚）产率仅约50 wt%，设备腐蚀严重且产生大量含酚废水，还需复杂纯化回收副产物2-辛醇和癸酸。这些缺陷促使研究者寻求更安全、可持续的替代生产路线。酿酒酵母作为模式工业菌株，具备完善的基因操作工具和良好的工业适应性，是构建癸二酸微生物细胞工厂的理想底盘。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
以酿酒酵母D452-2（MATα, leu2, his3, ura3, can1）作为癸二酸生产的宿主菌株。ω-氧化途径基因——细胞色素P450单加氧酶（CtCYP52B1, CTRG_03115）、细胞色素P450还原酶（CtNCP1, CTRG_00485）、醇脱氢酶（CtADH1, CTRG_06113）和醛脱氢酶（CtALD1, CTRG_04471）——均来源于热带假丝酵母MYA-3404（ATCC）。大肠杆菌DH5α用于质粒构建与保存。所有菌株列于补充表S1。大肠杆菌在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、250 rpm培养。酿酒酵母在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中培养，需要时补充抗生素。脂肪酸生产使用改良Delft培养基（6.7 g/L酵母氮碱无氨基酸、13.4 g/L KH2SO4、20 g/L葡萄糖及适量氨基酸补充物）。转化子在含有clonNAT（100 µg/mL）、潮霉素B（300 µg/mL）或G418硫酸盐（200 µg/mL）的YPD平板上筛选，取决于选择标记。所有菌株在50 mL锥形瓶（含10 mL培养基）中培养，30°C、200 rpm振荡。全程使用挡板摇瓶。除非另有说明，接种初始OD600为0.1，每24小时取样。
【数据】宿主菌：S. cerevisiae D452-2；LB培养基：10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/L NaCl，37°C，250 rpm；YPD培养基：10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖；改良Delft培养基：6.7 g/L YNB+13.4 g/L KH2SO4+20 g/L葡萄糖；筛选抗生素：clonNAT 100 µg/mL、潮霉素B 300 µg/mL、G418 200 µg/mL；培养条件：50 mL瓶/10 mL培养基，30°C，200 rpm；初始OD600：0.1；取样间隔：24 h
2.2 β-氧化敲除菌株与ω-氧化途径整合菌株的构建
基因敲除与整合采用基于CRISPR-Cas9的系统。质粒Cas-NAT用于表达Cas9蛋白，pRS42K和pRS42H（补充表S3）用于单引导RNA（sgRNA）表达。醋酸锂/单链DNA/聚乙二醇转化方案参照Lee等人（2020）的描述。整合位点基于Reider Apel等人（2017）的报道选择。sgRNA序列通过反向PCR插入。基因敲除sgRNA靶点使用CHOPCHOP在线工具（https://chopchop.cbu.uib.no）选择，最高效的20碱基对序列通过反向PCR克隆至pRS42K或pRS42H（补充表S2）。含有各开放阅读框（ORF）5′和3′同源臂的供体DNA片段通过重叠延伸PCR生成，以实现完整基因敲除。转化子经菌落PCR筛选，验证菌株于−80°C在50%（w/v）甘油中保存。整合供体DNA片段以pET28a为克隆骨架组装，包含侧翼异源基因片段的上、下游同源臂。正确整合的克隆经菌落PCR确认，于−80°C在50%（w/v）甘油中保存。
【数据】CRISPR-Cas9系统；质粒：Cas-NAT（Cas9表达）、pRS42K/pRS42H（sgRNA表达）；转化方法：醋酸锂/ssDNA/PEG；sgRNA设计工具：CHOPCHOP；供体DNA：重叠延伸PCR；筛选：菌落PCR；保存：−80°C，50%甘油
2.3 密码子优化的CtCYP52B1和CtNCP1表达
为表达CtCYP52B1和CtNCP1，密码子优化基因（GenBank登录号：PZ050893和PZ050894）（补充表S4）插入酵母整合质粒pRS403，置于组成型ADH1启动子或诱导型GAL1启动子（含ADH1终止子）控制下，生成质粒pRSCN。编码细胞色素P450单加氧酶（CtCYP52B1, CTRG_03115）和细胞色素P450还原酶（CtNCP1, CTRG_00485）的基因使用密码子优化工具针对酿酒酵母进行优化，并由Macrogen（韩国首尔）化学合成。质粒经NdeI线性化后转化。转化子在缺乏组氨酸的酵母氮碱（YNB）平板上筛选，经菌落PCR验证，于−80°C在50%（w/v）甘油中保存。
【数据】密码子优化基因：PZ050893、PZ050894；整合质粒：pRS403；启动子：ADH1（组成型）或GAL1（诱导型）；终止子：ADH1t；线性化酶：NdeI；筛选：组氨酸缺陷YNB平板；保存：−80°C，50%甘油
2.4 CtCYP52B1和CtNCP1的多拷贝整合
将Ty1转座子和δ元件的同源序列引入质粒pRSCN和pRSGAL1pCGAL1pN，用于多拷贝基因组整合。靶向Ty1和δ区域的sgRNA序列使用GGGenome数据库（https://gggenome.dbcls.jp/sacCer3/）设计。选定的Ty1 sgRNA（5′-TTACCAAAAACGTCTTAGAA-3′）在酿酒酵母S288C基因组中引入14处双链断裂，而δ sgRNA（5′-TATACTAGAAGTTCTCCTCG-3′）产生109处切割。转化后在组氨酸缺陷YNB琼脂平板上分离单菌落。
【数据】Ty1 sgRNA：5′-TTACCAAAAACGTCTTAGAA-3′（14处DSB）；δ sgRNA：5′-TATACTAGAAGTTCTCCTCG-3′（109处切割）；筛选：组氨酸缺陷YNB平板
2.5 定量PCR分析
使用MasterPure酵母DNA纯化试剂盒（LGC Biosearch Technologies，英国）提取基因组DNA。定量PCR（qPCR）使用Taq Pro Universal SYBR qPCR预混液（Vazyme，中国南京），在CFX Opus 96实时PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA）上进行。质粒pRSCN用于建立标准曲线，所有反应设三次重复。ALG9基因在酿酒酵母基因组中以单拷贝存在，作为内参。CtCYP52B1和CtNCP1的相对拷贝数采用ΔΔCq方法计算（式1）：基因拷贝数 = 2−[(Cq(Gene)−Cq(ALG9))Sample−(Cq(Gene)−Cq(ALG9))Control]，其中Cq(Gene)和Cq(ALG9)分别代表靶基因和参考基因的定量循环数。CtCYP52B1和CtNCP1基因在酿酒酵母基因组中的初始拷贝数通过基因拷贝数与ALG9基因拷贝数的比值确定。荧光定量PCR所用特异性引物见补充表S2。DNA拷贝浓度（copies/µL）按下式计算（式2）：DNA拷贝数 = (6.02×10²³)×(ng/µL×10⁻⁹)/(DNA长度×660)。
【数据】qPCR试剂：Taq Pro Universal SYBR qPCR预混液；仪器：CFX Opus 96；内参基因：ALG9（单拷贝）；计算方法：ΔΔCq法；拷贝数公式：2−ΔΔCq；DNA拷贝数公式：(6.02×10²³)×(ng/µL×10⁻⁹)/(DNA长度×660)
2.6 细胞生长测定与高效液相色谱（HPLC）分析
细胞生长通过分光光度计（SmartSpec 3000；Bio-Rad）测定OD600监测。干细胞重（DCW）基于与OD600的比例关系确定，比例系数DCW/OD600 = 0.33。葡萄糖和乙醇浓度使用配备示差折光检测器（RID）和H+（8%）色谱柱（Rezex ROA-有机酸柱；Phenomenex，Torrance，CA，USA）的HPLC系统（Agilent 1100，Agilent Technologies，Santa Clara，CA）测定。流动相为0.005N H2SO4，流速0.5 mL/min，柱温65°C，RID温度55°C。
【数据】DCW/OD600 = 0.33；HPLC：Agilent 1100 + RID + Rezex ROA-有机酸柱（H+ 8%）；流动相：0.005N H2SO4；流速：0.5 mL/min；柱温：65°C；RID温度：55°C
2.7 脂肪酸的气相色谱/质谱（GC/MS）分析
分析二元羧酸（DCA）时，培养液用2M HCl酸化，涡旋1分钟，用等体积乙酸乙酯萃取。涡旋3分钟并离心（13,000 × g，3分钟）后，收集上层有机相并真空蒸发。干燥提取物用50 µL N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）衍生化以提高挥发性。取1 µL衍生化样品，使用配备DB-5 MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm；Agilent Technologies）的Agilent 7890A GC/5975C MSD系统分析。柱温程序：100°C保持3.5分钟，以15°C/min升至160°C保持20分钟，以20°C/min升至200°C保持20分钟，再以20°C/min升至280°C保持5分钟。电离采用电子轰击（70 eV），温度230°C，质谱记录范围50–500 m/z。
【数据】酸化：2M HCl；萃取：等体积乙酸乙酯，涡旋3 min，离心13,000×g 3 min；衍生化：50 µL MSTFA；进样量：1 µL；色谱柱：DB-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；升温程序：100°C(3.5 min)→15°C/min至160°C(20 min)→20°C/min至200°C(20 min)→20°C/min至280°C(5 min)；电离：EI 70 eV，230°C；扫描范围：50–500 m/z
研究结果
3.1 多基因敲除β-氧化途径将脂肪酸通量导向癸酸
癸二酸在热带假丝酵母中可通过ω-氧化以癸酸为前体合成。因此，胞内癸酸浓度是决定酿酒酵母癸二酸生产效率的关键因素。然而，癸酸天然比大多数其他脂肪酸具有更强的细胞毒性——其疏水尾部能插入质膜，改变脂质堆积并降低膜流动性，进而导致氧化应激产生。这些效应最终损害细胞活力，限制癸酸超过一定阈值的积累。因此，识别限制癸酸降解的代谢节点并将碳通量重定向至其积累，是建立有效癸二酸生产平台的关键第一步。
为此，研究选取了6个参与脂肪酸降解的基因进行系统性敲除：FAA1、FAA2、FAA4、POX1、PEX11和PXA1（图2a）。其中，FAA1、FAA2、FAA4和PXA1编码定位于细胞膜或过氧化物酶体膜的酰基辅酶A合成酶，介导中长链脂肪酸的活化并转运进入过氧化物酶体；PEX11编码调节过氧化物酶体增殖的膜蛋白；POX1编码酰基辅酶A氧化酶，催化β-氧化的第一步。
敲除FAA1、FAA4和PEX11未显著增加癸酸积累（图2b）。这可能是因为FAA1和FAA4同时负责长链脂肪酸的转运与活化，而仅敲除PEX11导致的过氧化物酶体增殖减少可能不足以显著影响中链脂肪酸周转（图2a）。相比之下，POX1敲除使癸酸显著升高至14.4 mg/L（图2b），证实β-氧化第一步对癸酸降解至关重要，阻断该步骤可将通量重定向至积累。随后依次敲除PXA1和FAA2进一步提高了癸酸水平，并略微改善了细胞生长，最终获得菌株6KO——在20 g/L葡萄糖中培养120小时后积累28.9 mg/L癸酸，约为野生型（0.5 mg/L）的53倍。这表明抑制脂肪酸降解可有效增加胞内癸酸，而无需额外改造上游脂肪酸合成。观察到的生物量增加可能部分反映了氧化还原失衡的缓解，因为进入过氧化物酶体氧化的酰基辅酶A中间产物减少。
总体而言，这种β-氧化阻断策略为富集癸二酸生物合成的关键前体库提供了一种简单而有力的手段。尽管如此，通过调节脂肪酸合酶复合物的链长特异性或过表达偏好癸酰辅酶A的硫酯酶以促进癸酸释放，可进一步增强中链脂肪酸生物合成。考虑到癸酸的固有毒性，进化或工程改造宿主对中链脂肪酸的耐受性对于维持更高产量也至关重要。因此，6KO菌株的构建建立了稳定且高产的前体底盘，为后续ω-氧化工程提供了代谢基础。
【数据】6KO菌株：20 g/L葡萄糖，120 h，DA积累28.9 mg/L；野生型DA：0.5 mg/L；倍数：约53倍；POX1单敲除DA：14.4 mg/L；FAA1/FAA4/PEX11单敲除：DA无显著增加
3.2 重构异源ω-氧化途径实现癸二酸从头生产
ω-氧化途径是存在于高等真核生物和某些酵母中的天然氧化路线，主要参与脂肪酸解毒和末端氧化。在热带假丝酵母等工业生物催化剂中，该途径通过三步氧化级联将烷烃或脂肪酸高效氧化为包括癸二酸在内的二元羧酸：细胞色素P450单加氧酶催化末端甲基羟基化，醇脱氢酶将生成的ω-醇氧化为醛，醛脱氢酶再将醛进一步氧化为二元羧酸。
为在酿酒酵母中重构这一能力，研究将热带假丝酵母MYA-3404的4个基因——CtCYP52B1（细胞色素P450单加氧酶）、CtNCP1（NADPH-细胞色素P450还原酶）、CtADH1（醇脱氢酶）和CtALD1（醛脱氢酶）——依次整合至β-氧化缺陷菌株6KO中（图2c）。采用CRISPR-Cas9介导的基因组整合而非游离质粒，以确保表达稳定性并避免抗生素补充带来的高成本和变异性。整合位点基于先前报道的转录活跃位点选择。四个基因依次插入后，所得菌株SAW3在120小时内从葡萄糖产生0.4 mg/L癸二酸（图2c）。有趣的是，仅部分表达CtCYP52B1和CtNCP1就已经产生低但可检测的癸二酸（0.2 mg/L），表明酿酒酵母内源脱氢酶可部分互补ω-氧化途径。
GC/MS分析显示，菌株SAW3不仅产生癸二酸，还产生多种中链和长链脂肪酸及二元羧酸（图2d、e）。显著存在的C10二元羧酸（癸二酸）证实引入的P450单加氧酶有效羟基化了癸酸，确立癸酸是ω-氧化的合格底物。然而，还检测到C12、C14和C16链长的其他二元羧酸（图2e），表明Cyp52b1p保留广泛的底物特异性。这些结构相似的二元羧酸的共生产可能降低产物选择性并使下游纯化复杂化，因为链长相近的化合物通常表现出相似的理化性质。副产物的鉴定既说明了当前系统的成功，也揭示了其局限。
结果表明，热带假丝酵母的核心ω-氧化模块可在酿酒酵母中发挥功能，证实Cyp52b1p与Ncp1p之间的正确折叠、辅因子互作和电子传递。同时，相对较低的癸二酸产量（0.4 mg/L）表明ω-碳羟基化仍是主要瓶颈，可能受限于P450表达水平、氧化还原能力或单加氧酶与还原酶组分之间的低效偶联。在改善该步骤的初步尝试中，研究者使用易错PCR和基于结构的诱变工程改造CtCYP52B1，但未获得显著提高癸二酸产量的变体（图S8）。这表明酿酒酵母中的催化性能更多受系统层面因素限制，而非仅由序列变异决定。CtCYP52B1与其还原酶CtNCP1之间的电子传递效率低下，以及血红素可用性有限，可能限制催化周转。
未来对ω-氧化模块的优化应聚焦于结构引导工程，包括修饰底物结合口袋、优化底物进入通道以及改善P450-还原酶电子传递界面。增强氧化还原偶联效率和底物亲和力将是提高途径通量的关键。此外，长链二元羧酸的形成表明酿酒酵母中其他天然脂肪酸（如C12–C16酰基链）也作为Cyp52b1p的非预期底物。聚焦底物结合口袋的定向进化或理性突变可改善链长辨别能力并减少这些副反应。或者，调节内源脂质库以偏向中链脂肪酸可进一步提高过程选择性。
总之，这些结果证实异源ω-氧化途径首次在酿酒酵母中成功重构并发挥功能，实现了直接从葡萄糖从头合成癸二酸。菌株SAW3的建立因此标志着向开发安全、遗传可操作的可持续癸二酸生物合成平台迈出了关键一步。
【数据】SAW3菌株：120 h，SA产量0.4 mg/L；仅表达CYP52B1+NCP1：SA 0.2 mg/L；副产物：C12、C14、C16 DCA；易错PCR/结构诱变：无显著提升变体
3.3 多拷贝整合与启动子调控的进一步优化
（注：原文节选在3.2之后直接跳至结论部分，3.3及后续小节的具体实验描述未包含在提供的节选文本中。根据摘要信息，Ty1转座子多拷贝整合使癸二酸产量提升至14.9 mg/L，GAL1启动子与GAL80敲除进一步提至16.2 mg/L，最终组合策略获得38.8 mg/L。）
讨论与解读
本研究通过系统性的代谢工程策略，在酿酒酵母中实现了从葡萄糖直接合成癸二酸。敲除6个脂肪酸降解基因构建的6KO菌株将癸酸积累提升至野生型的53倍，证明阻断β-氧化是富集中链脂肪酸前体的有效手段。异源ω-氧化途径的成功重构验证了热带假丝酵母P450系统在酿酒酵母中的功能性——即便内源脱氢酶仅能部分互补，也足以产生可检测的癸二酸。多拷贝整合与诱导型启动子的组合表明，基因剂量与动态调控的协同优化是突破P450限速步骤的关键。38.8 mg/L的最终产量虽绝对值不高，但作为从葡萄糖直接合成的报道最高值，验证了模块化工程策略的可行性。
编译者解读：该研究的核心价值在于搭建了"前体积累—异源氧化—拷贝扩增—动态调控"的四步模块化框架。值得注意的是，P450底物宽泛性导致C12–C16副产物生成，提示链长特异性应是后续蛋白工程的重点方向。此外，38.8 mg/L的产量距离工业化仍有数量级差距，P450催化效率与辅因子供给的系统性优化（而非仅靠拷贝数堆叠）可能是突破瓶颈的关键。该框架对其它中长链二元羧酸的微生物合成同样具有借鉴意义。
参考来源
Wang, S. De novo production of sebacic acid from glucose by Saccharomyces cerevisiae via engineered ω-oxidation and β-oxidation pathways. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134685
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134685