来源：Toxicity mechanisms of metal ions in sugarcane molasses to Saccharomyces cerevisiae: Integrated physiological and transcriptomic insights（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甘蔗糖蜜中过量金属离子严重制约乙醇发酵效率。本研究以酿酒酵母GJ2008为对象，通过外源离子添加结合理化表征与转录组分析，系统解析了K⁺、Ca²⁺及混合离子的毒性机制。研究发现K⁺和Ca²�具有强生长抑制效应，混合离子处理使乙醇产量下降68.3%。转录组分析揭示了离子特异性毒理路径：K⁺干扰核糖体生物合成与乙酰辅酶A通量，Ca²⁺诱导乙醇分解代谢与翻译抑制，混合离子则引发蛋白质稳态、能量分配和DNA修复三重系统崩溃。
研究背景
乙醇因其清洁燃烧特性和可再生性，在医疗和燃料等领域应用广泛。然而，大规模乙醇生产受制于原料供应。甘蔗糖蜜作为制糖副产物，含约50%可发酵糖及蛋白质、维生素和微量元素，产量大、成本低，被视为生物乙醇的主要原料来源之一。但糖蜜中高浓度金属离子严重抑制发酵过程中酵母的生长和代谢活性，成为限制糖蜜基发酵乙醇浓度的主要因素之一。
糖蜜中的金属离子主要来源于甘蔗施肥、制糖工艺以及石灰澄清脱色过程。这些离子通过抑制关键代谢酶、诱导活性氧产生、对DNA、脂质和蛋白质等细胞组分造成氧化损伤，同时破坏细胞壁完整性，从而降低酵母存活率。已有研究指出，Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺和Cr³⁺可催化Fenton和Haber-Weiss反应，进一步加剧氧化损伤。
研究方法
2.1 甘蔗糖蜜中金属离子分析
甘蔗糖蜜样品采用热浓酸消解预处理。消解液中金属离子组成与含量随后采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）在Agilent 7700系统上按照中国标准GB/T 9735-2008（化学试剂 重金属测定通用方法）进行定量。详细实验方法见补充材料与方法1.1。
【数据】仪器：Agilent 7700 ICP-MS；样品处理：热浓酸消解；标准：GB/T 9735-2008
2.2 金属离子对酵母生长影响的评估
酿酒酵母GJ2008（来源于广西科技大学生物与食品工程学院发酵工程研究所），为一株高糖耐受工业菌株，全程用于本研究。酵母浓缩悬浮液以1%（v/v）接种量接种至蔗糖发酵培养基（250 g/L蔗糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物；pH不调节）。基于ICP-MS结果，处理组按糖蜜组成浓度添加补充金属离子，对照组不添加。培养物在摇瓶中培养（30°C，150 rpm）36小时。定期测定560 nm处光密度（OD₅₆₀）以绘制生长曲线。
【数据】菌株：Saccharomyces cerevisiae GJ2008；培养基：250 g/L蔗糖+20 g/L蛋白胨+10 g/L酵母提取物；接种量：1%（v/v）；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：36h；检测波长：OD₅₆₀
2.3 金属离子对蔗糖乙醇发酵的影响
在蔗糖发酵培养基中补充特定金属离子，设立三个处理组：钾离子组（K⁺，15.64 g/L）、钙离子组（Ca²⁺，8.17 g/L）和混合离子组（Mix：K⁺ 15.64 g/L、Ca²⁺ 8.17 g/L、Mg²⁺ 2.78 g/L、Fe³⁺ 0.346 g/L、Mn²⁺ 0.035 g/L、Na⁺ 0.23 g/L）。未补充培养基作为对照。所有培养物在摇瓶中于30°C、150 rpm条件下培养36小时。按预定时间间隔采集样品并离心，细胞沉淀重悬后测定560 nm光密度（OD₅₆₀）绘制生长曲线。上清液用于测定蔗糖、葡萄糖、果糖和乙醇含量，以分析发酵过程中糖和乙醇的代谢情况。乙醇含量采用高性能气相色谱测定，蔗糖、果糖和葡萄糖含量采用高效液相色谱测定（Long et al., 2024）。
【数据】K⁺浓度：15.64 g/L；Ca²⁺浓度：8.17 g/L；Mix组成：K⁺ 15.64 g/L + Ca²⁺ 8.17 g/L + Mg²⁺ 2.78 g/L + Fe³⁺ 0.346 g/L + Mn²⁺ 0.035 g/L + Na⁺ 0.23 g/L；温度：30°C；转速：150 rpm；时间：36h
2.4 金属离子对酵母形态影响的评估
按2.3节方法制备酵母培养物，在对数生长期取样。取3 mL等分试样离心，弃上清。细胞沉淀在1 mL 2.5%戊二醛溶液中于4°C固定过夜。固定后，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS；8.0 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na₂HPO₄、0.24 g/L KH₂PO₄，pH = 7.4）洗涤三次，并进行系列乙醇脱水（30%–100%浓度）。每步脱水后，细胞通过离心回收（5000 r/min，10 min）。最终沉淀经真空冷冻干燥和喷金处理。使用Phenom台式扫描电子显微镜（Phenom Pro，上海飞纳科学仪器有限公司）观察形态变化。SEM关键实验操作流程和成像参数见补充材料与方法1.2。
【数据】固定液：2.5%戊二醛；固定条件：4°C过夜；PBS配方：8.0 g/L NaCl+0.2 g/L KCl+1.44 g/L Na₂HPO₄+0.24 g/L KH₂PO₄，pH=7.4；脱水梯度：30%–100%乙醇；离心：5000 r/min，10 min；仪器：Phenom Pro台式SEM
2.5 金属离子对酵母细胞壁分子结构的影响
按2.3节方法制备细胞培养物。对数生长期取3 mL等分试样离心（5000 r/min，10 min），弃上清。细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，随后真空冷冻干燥。干燥细胞与KBr混合压片，使用Frontier FTIR光谱仪（PerkinElmer，Waltham, MA, USA）进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析。FTIR方法见补充材料与方法1.3。
【数据】离心：5000 r/min，10 min；样品制备：KBr压片；仪器：Frontier FTIR光谱仪（PerkinElmer）
2.6 金属离子对胞内海藻糖含量的影响
酵母细胞在蔗糖培养基中培养至对数生长期。分别添加K⁺、Ca²⁺和混合金属离子作为处理组，继续培养。在处理后0、3和6小时收集发酵液（4 mL），离心（12,000 r/min，3 min），弃上清。沉淀洗涤三次。一份用于生物量测定，另一份重悬于4 mL冰浴预冷的0.5 mol/L三氯乙酸中处理1小时。离心后，取1 mL上清液转移至冰浴中的比色管中。加入5 mL蒽酮-硫酸试剂，剧烈混匀，煮沸10分钟。冰水冷却后，测定620 nm处吸光度。海藻糖含量采用标准曲线计算（y = 10.015x + 0.0221，R² = 0.9994）。
【数据】取样时间：0、3、6h；离心：12,000 r/min，3 min；提取剂：0.5 mol/L三氯乙酸（冰浴，1h）；显色剂：蒽酮-硫酸试剂5 mL；煮沸：10 min；检测波长：620 nm；标准曲线：y = 10.015x + 0.0221，R² = 0.9994
2.7 胞内甘油含量测定
从0、9和18小时发酵液中收集细胞并离心。约5 × 10⁶个细胞重悬于1 mL提取缓冲液中，超声破碎（200 W输出功率，3 s脉冲，10 s间隔，30个循环，冰浴）。裂解液离心（12,000 rpm，10 min，4°C），上清液使用商业检测试剂盒（瑞鑫生物，广州，中国）分析甘油含量。按照制造商方案测定510 nm处吸光度，甘油浓度根据标准曲线计算。
【数据】取样时间：0、9、18h；细胞数：约5 × 10⁶；超声条件：200 W，3s脉冲，10s间隔，30循环，冰浴；离心：12,000 rpm，10 min，4°C；检测波长：510 nm；试剂盒：瑞鑫生物（广州）
2.8 转录组测序
样品分为K⁺、Ca²⁺和混合离子（Mix）处理组，未补充培养物为对照。在摇瓶中（30°C，150 rpm）培养至对数中期后，离心收集细胞（4°C，5000 r/min）。沉淀经三次PBS洗涤后进行RNA提取。RNA完整性验证后，使用oligo(dT)磁珠富集并片段化mRNA。片段化mRNA作为模板进行cDNA合成，随后进行末端修复和接头连接。文库质量评估后，在上海美吉生物医药科技（上海，中国）的Illumina平台上进行测序。原始测序读段使用Fastp进行质量控制，包括接头修剪和低质量碱基去除。HISAT2将干净读段比对到酿酒酵母参考基因组，比对质量通过Qualimap（v2.2.1）评估。差异表达基因（DEGs）使用DESeq2鉴定，显著性阈值为FDR校正P < 0.05且|log₂(倍数变化)| ≥ 1。DEGs功能注释通过GO（http://geneontology.org/）和KEGG通路（https://www.genome.jp/kegg/）数据库进行。GO富集分析使用Goatools，KEGG通路富集使用Python SciPy实现。
【数据】培养条件：30°C，150 rpm；离心：4°C，5000 r/min；DEG阈值：FDR校正P < 0.05，|log₂FC| ≥ 1；测序平台：Illumina；比对软件：HISAT2；质控软件：Fastp；富集分析：Goatools（GO）、Python SciPy（KEGG）
2.9 统计分析
所有实验至少进行三次独立生物学重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。组间显著性差异采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验，使用SPSS软件（版本19.0）。P值小于0.05视为统计学显著。数据可视化使用OriginPro 9.5软件。
【数据】统计方法：单因素ANOVA + Tukey事后检验；软件：SPSS 19.0；显著性水平：P < 0.05；绘图软件：OriginPro 9.5
研究结果
3.1 甘蔗糖蜜中金属离子组成及其对酿酒酵母生长的影响
糖蜜中金属离子通常来源于农业施肥、制糖加工和预处理阶段。热酸消解后，ICP-MS分析检测到样品中存在58种不同金属种类（表1），其中大多数为痕量水平。K⁺（15.64 g/L）、Ca²⁺（8.17 g/L）和Mg²⁺（2.76 g/L）构成主要离子。适量金属离子通过调节膜通透性稳定线粒体功能，但过量金属离子对酵母具有毒性，对细胞生长、存活率和乙醇代谢产生显著影响。根据ICP-MS结果，将含量最高的六种离子补充至发酵培养基中，评估其对酿酒酵母GJ2008的影响。
如图1所示，所有培养物在发酵初期（0–6 h）均表现出快速生长，但金属补充组的生物量积累（OD₅₆₀）始终低于对照组。至12小时，对照培养物及添加Mg²⁺、Fe³⁺、Na⁺和Mn²⁺的培养物达到稳定期，表明对离子胁迫产生了短暂适应。与此形成鲜明对比的是，K⁺和Ca²⁺处理将稳定期延迟了6小时（至18小时才达到稳定），且整个发酵过程中OD₅₆₀值持续受抑制。这种持续的生长抑制凸显了K⁺和Ca²⁺的特别细胞毒性。
鉴于上述发现以及糖蜜离子谱的固有复杂性，研究选取K⁺、Ca²⁺和混合离子（前六种离子：K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Na⁺）进行后续乙醇发酵过程和细胞响应研究。
【数据】检测金属种类：58种；主要离子：K⁺ 15.64 g/L、Ca²⁺ 8.17 g/L、Mg²⁺ 2.76 g/L；K⁺和Ca²⁺处理稳定期延迟：6h（18h达稳定）
3.2 金属离子对酿酒酵母乙醇发酵过程的影响
经热酸消解预处理的甘蔗糖蜜总糖含量经HPLC测定为273.3 g/L。为模拟发酵条件，采用250 g/L蔗糖培养基评估K⁺、Ca²⁺和混合离子（Mix）对细胞生长、底物利用和乙醇产量的影响。在乙醇发酵过程中，酿酒酵母通过蔗糖水解酶将胞外蔗糖水解为葡萄糖和果糖，随后经糖酵解转化为丙酮酸。丙酮酸脱羧酶催化乙醛形成，最终生成乙醇。
高浓度金属离子显著损害了这一过程（图2）。对照培养物在12小时内快速水解蔗糖（图2A），而K⁺和Ca²⁺处理在初期（0–3 h）表现出水解抑制，提示胁迫适应。随后这些组的水解速率加快，至24小时接近完成。相反，Mix组表现出持续的水解抑制，终点时仍有35.82%的蔗糖未水解。这表明高浓度金属离子抑制蔗糖水解酶活性，尤其是在多离子条件下，协同抑制作用超过单一离子效应。
总糖消耗（葡萄糖+果糖利用）反映发酵效率。对照培养物初期糖消耗缓慢（图2B），随后在对数生长期加速摄取，与乙醇产生同步。至24小时，乙醇毒性和营养耗竭降低了葡萄糖和果糖的消耗，残余总糖浓度（蔗糖+葡萄糖+果糖）为21.66 g/L。金属离子处理显著提高了残余总糖，最终浓度分别达到54.67 g/L（K⁺）、99.01 g/L（Ca²⁺）和155.6 g/L（Mix），表明对酵母代谢的强烈抑制作用。
如图2C/D所示，对照组在发酵早期（0–6 h）以生物量积累为主，乙醇生产率较低。6–24小时快速生长通过加速葡萄糖/果糖消耗推动乙醇产量达到峰值。至24–36小时，乙醇平台期达到12.3% v/v，归因于乙醇毒性、营养耗竭和膜改变。相比之下，K⁺、Ca²⁺和Mix处理分别将稳定期延迟至18小时、18小时和30小时。最终生物量分别下降7.62%、16.62%和26.45%，乙醇产量相应降低14.43%、32.52%和68.3%。
总体而言，金属离子通过抑制蔗糖酶活性损害酵母的蔗糖水解和葡萄糖/果糖利用。这种损害扰乱了糖酵解通量，导致残余糖升高、乙醇产量降低和发酵不完全。值得注意的是，Ca²⁺的抑制作用强于K⁺，而混合离子（Mix）表现出超过单一离子效应的协同抑制，凸显了糖蜜毒性谱的复杂性。
【数据】糖蜜总糖：273.3 g/L；培养基蔗糖：250 g/L；对照残余总糖：21.66 g/L；K⁺处理残余总糖：54.67 g/L；Ca²⁺处理残余总糖：99.01 g/L；Mix处理残余总糖：155.6 g/L；Mix未水解蔗糖：35.82%；对照乙醇：12.3% v/v；生物量下降：K⁺ 7.62%、Ca²⁺ 16.62%、Mix 26.45%；乙醇产量下降：K⁺ 14.43%、Ca²⁺ 32.52%、Mix 68.3%；稳定期延迟：K⁺和Ca²⁺至18h、Mix至30h
3.3 金属离子对酵母细胞理化性质的影响
#### 3.3.1 金属离子胁迫下的形态变化
扫描电子显微镜（SEM）揭示了暴露于K⁺、Ca²⁺和混合离子（Mix）处理的酿酒酵母的显著形态变化。对照组（图3A）细胞表现出典型的饱满形态，表面光滑、分布均匀、出芽频率高。相比之下，K⁺处理细胞（图3B）表面粗糙，附着絮状物质，细胞尺寸减小，并出现细胞间聚集。Ca²⁺暴露（图3C）诱导更严重的变形，包括表面凹坑、皱缩和细胞结构塌陷。Mix处理（图3D）引发极端的形态破坏：细胞出现皱缩和聚集，表面广泛折叠，胞外碎片积累，细胞质泄漏。
这些结构改变表明高浓度金属离子损害了细胞完整性。胞外聚合物的表面沉积和细胞聚集阻碍了营养物/废物运输，而膜损伤和细胞质丢失直接抑制代谢功能。这种形态恶化与观察到的发酵抑制相关，表明金属离子胁迫下细胞活力逐渐丧失。
【数据】对照组：表面光滑、饱满、出芽频率高；K⁺处理：表面粗糙、附着絮状物、细胞尺寸减小；Ca²⁺处理：表面凹坑、皱缩、结构塌陷；Mix处理：细胞皱缩聚集、胞外碎片积累、细胞质泄漏
#### 3.3.2 金属离子对酵母细胞结构的FTIR分析
酵母细胞壁由外层甘露糖蛋白层和内层β-葡聚糖与几丁质结构网络组成。这些组分含有对维持细胞形态和活力至关重要的反应性官能团。FTIR光谱通过特征键振动揭示了金属离子诱导的结构扰动，可检测分子组成变化和环境相互作用。
值得注意的是，3319.3 cm⁻¹处的O-H/N-H伸缩峰在处理组中透射率显著增加（图4），表明几丁质的氢键网络被破坏，导致结构松散或降解。这种效应在Mix处理中最为显著，表明协同损伤增强。脂双层紊乱表现为2999.1 cm⁻¹和2978.8 cm⁻¹处CH反对称振动增强，提示金属离子诱导的构象变化或膜流动性降低。蛋白质变性通过酰胺带透射率增加体现：酰胺I（1654 cm⁻¹，C=O伸缩）、酰胺II（1542.9 cm⁻¹，N-H弯曲/C-N伸缩）和酰胺III（1242.1 cm⁻¹，C-H弯曲/C-O伸缩），表明二级结构展开，可能与金属离子结合导致的酶失活相关。多糖完整性在1078.1 cm⁻¹（C-O伸缩）和894.9 cm⁻¹（β-糖苷键的C1-H弯曲）处受损，透射率增加反映了β-葡聚糖糖环破坏和羟基稳定性降低。光谱位移进一步证实了结构失稳。
【数据】O-H/N-H峰位：3319.3 cm⁻¹（透射率增加，几丁质氢键破坏）；CH反对称振动：2999.1、2978.8 cm⁻¹（脂双层紊乱）；酰胺I：1654 cm⁻¹（C=O伸缩）；酰胺II：1542.9 cm⁻¹（N-H弯曲/C-N伸缩）；酰胺III：1242.1 cm⁻¹（C-H弯曲/C-O伸缩）；多糖峰位：1078.1 cm⁻¹（C-O伸缩）、894.9 cm⁻¹（β-糖苷键C1-H弯曲）
3.4 金属离子对胞内海藻糖和甘油含量的影响
海藻糖和甘油是酵母中典型的相容性溶质，在胁迫条件下积累以保护细胞结构和大分子。如图5A所示，K⁺、Ca²⁺和Mix处理均诱导了海藻糖的显著胞内积累，且随时间延长积累量增加。图5B显示，金属离子处理组的胞内甘油含量也显著高于对照组。这些相容性溶质的积累是酵母应对金属离子胁迫的重要防御机制，通过稳定蛋白质天然构象和细胞膜流动性来减轻离子毒性造成的损伤。
【数据】海藻糖：处理组显著积累，随时间增加；甘油：处理组显著高于对照；统计：平均值±SD（n=3），单因素ANOVA + Tukey事后检验，P < 0.05
3.5 金属离子对蔗糖水解酶活性的影响
蔗糖水解酶（转化酶）是酵母利用蔗糖的关键酶。如图6所示，K⁺、Ca²⁺和Mix处理均显著抑制了蔗糖水解酶活性。其中Mix处理的抑制效果最为显著，与发酵实验中观察到的蔗糖水解持续受抑现象一致。Ca²⁺处理的酶活性抑制强于K⁺处理，与二者对发酵过程的抑制趋势相吻合。
【数据】酶活性抑制：K⁺、Ca²⁺和Mix处理均显著抑制；抑制强度：Mix > Ca²⁺ > K⁺
3.6 金属离子胁迫对菌落形态的影响
如图7所示，对照组的菌落呈现典型的圆形、光滑边缘和均匀表面。K⁺处理组的菌落尺寸减小，边缘略不规则。Ca²⁺处理组的菌落进一步缩小，表面出现皱褶。Mix处理组的菌落最小，形态极不规则，表面严重皱缩。菌落形态的变化与液体培养中观察到的生长抑制和细胞形态损伤一致，进一步证实了金属离子对酵母细胞活力的损害。
【数据】对照组：圆形、光滑边缘；K⁺处理：菌落减小、边缘不规则；Ca²⁺处理：菌落缩小、表面皱褶；Mix处理：菌落最小、形态极不规则、表面严重皱缩
3.7 转录组分析
转录组分析鉴定出K⁺、Ca²⁺和Mix处理组中分别有1,421、1,367和950个差异表达基因（DEGs）。GO富集分析（图8A）和KEGG通路富集分析（图8B）揭示了离子特异性的功能扰动模式。
深入分析表明，K⁺胁迫通过同时激活核糖体RNA（rRNA）加工和抑制核糖体蛋白合成来诱导核糖体功能障碍，同时干扰乙酰辅酶A通量以削弱基础代谢。Ca²⁺胁迫驱动代谢反转，其特征为乙醇分解代谢为乙醛以及全局翻译抑制。Mix暴露诱导三方系统崩溃，涵盖蛋白质稳态系统（ERAD-UPS抑制）、能量分配网络（TCA底物分流）和DNA修复机制衰竭。
【数据】DEGs数量：K⁺组1,421个、Ca²⁺组1,367个、Mix组950个；K⁺胁迫：rRNA加工激活+核糖体蛋白合成抑制+乙酰辅酶A通量干扰；Ca²⁺胁迫：乙醇分解代谢为乙醛+全局翻译抑制；Mix胁迫：ERAD-UPS抑制+TCA底物分流+DNA修复衰竭
讨论与解读
本研究通过整合生理学和转录组学分析，阐明了甘蔗糖蜜中金属离子对酿酒酵母的毒性机制。K⁺、Ca²⁺和混合离子（Mix）胁迫显著抑制蔗糖水解和葡萄糖/果糖利用，从而损害细胞生长和乙醇代谢。Ca²⁺的抑制作用强于K⁺，而Mix处理产生超过单一离子加和效应的协同毒性。生理分析揭示了严重的形态损伤、膜和细胞壁破坏、相容性溶质（海藻糖和甘油）积累以及蔗糖水解酶活性的显著抑制。转录组分析进一步揭示了离子特异性的关键细胞过程失调：K⁺胁迫破坏核糖体生物合成和乙酰辅酶A通量；Ca²⁺胁迫诱导异常的乙醇分解代谢和全局翻译抑制；Mix胁迫引发蛋白质稳态、能量代谢和DNA修复系统的三方崩溃。
本研究存在若干局限。Mix处理组中必需离子的潜在保护作用未被阐明，在复杂发酵体系中这些离子可能部分缓解整体毒性。此外，转录组提出的代谢转变——如乙酰辅酶A通量重定向和乙醇分解代谢——仍需通过代谢流分析和酶活性测定等生化实验进一步验证。未来研究可在实际糖蜜发酵体系中验证这些机制，并探索靶向解除特定离子抑制的工程策略。
编译者解读
本研究采用"外源添加+多组学联用"的策略，将真实糖蜜中的离子组成转化为可控实验变量，方法设计值得借鉴。混合离子组呈现的超加和毒性提示，在实际糖蜜脱毒处理中需关注离子协同效应而非单一离子阈值。从合成生物学应用角度看，K⁺和Ca²⁺特异性胁迫响应的差异（核糖体功能障碍vs.代谢反转）为定向改造酵母耐受性提供了潜在靶点——例如增强核糖体组装效率或阻断乙醇分解代谢通路。但转录组预测的代谢转变尚缺乏代谢流和酶活数据直接验证，后续可结合¹³C代谢流分析锁定关键节点，推动耐受性工程从"描述现象"走向"精准改造"。
参考来源
Tang, M. (2025). Toxicity mechanisms of metal ions in sugarcane molasses to Saccharomyces cerevisiae: Integrated physiological and transcriptomic insights. Food Bioscience, 107770. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107770
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107770